אוסף והפקת האוויר תעסוקתית דוגמאות לניתוח של DNA פטרייתי

המטרה הכוללת של מתודולוגיית דגימת אוויר ומיצוי DNA זו היא להשיג DNA גנומי פטרייתי שניתן להגביר, לרצף ולמקם טקסונומית כדי לזהות סכנות פטרייתיות פוטנציאליות במסגרות תעסוקתיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הערכת החשיפה התעסוקתית, כגון לאילו סכנות פטרייתיות נחשפים עובדים שעלולות לגרום להשפעות בריאותיות שליליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להבהיר מיני פטריות שנותרו בלתי מזוהים בשיטות מבוססות תרבית או מיקרוסקופיה באמצעות גישות מבוססות ריצוף.

כדי להרכיב את קלטת מסנן דגימת האוויר, הנח כרית תמיכה של מסנן תאית על המשטח המרושת של חלק הבסיס, ולאחר מכן, בעזרת מלקחיים מסננים, הנח מסנן על גבי כרית תמיכת המסנן כשצד האיסוף פונה כלפי מעלה. לאחר ההרכבה, אטמו את קלטת המסנן על ידי הכנסת כיסוי ההארכה ולחיצה עליו בחוזקה ובאופן שווה בעזרת מכבש ידני או פנאומטי. לאחר מכן, התקן את הקסטה המורכבת על גבי דגימת התרסיס של NIOSH ודחף כלפי מטה ככל האפשר.

השתמש בחתיכת סרט 19 מילימטר כדי לעטוף את החלק החיצוני של קלטת המסנן והדגימה המחזיקה את קלטת המסנן במקומה ופועלת כאטם גיבוי למניעת נזילות. הברג את צינורות האיסוף בחוזקה ובמלואם לתוך הדגימה עד שהם מגיעים לתחתית ועוטפים את סרט האיטום סביב הצינורות המשמשים כאיטום משני נגד דליפה. כדי לבצע דגימת אירוסול אישית, הנח את הדגימה בתוך אזור הנשימה של האדם.

חבר את הדגימה לדש, לכתף או לחזה ולאחר מכן שמור את משאבת הדגימה בגובה המותניים או בתיק גב. הפעל את המשאבות ובדוק לאחר דקה אם המשאבה פועלת. לאחר השלמת דגימת האוויר, אסוף את דגימת האוויר מהנבדק.

הסר את סרט האיטום, פתח את הצינורות ואז הניח עליהם מכסה. הנח את החלק השלישי של קלטת המסנן מעל המסנן. ראשית, נגב את קלטת הדגימה עם 70% אתנול, ולאחר מכן השתמש בכלי לפתיחת קלטת כדי לפתוח את קלטת הדגימה תוך כדי עבודה בארון בטיחות ביולוגי Class II.

לאחר מכן, השתמש במרים מסנן כדי להרים את כרית התמיכה ולסנן כלפי מעלה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים מסננים כדי להסיר את המסנן ולהניח אותו בצלחת פטרי סטרילית. חותכים את המסנן לשש חתיכות שוות בעזרת אזמל סטרילי ואז מניחים אותם בצינור מחוזק של שני מיליליטר המכיל 300 מיליגרם של חרוזי זכוכית של 200 עד 500 מיקרומטר.

טבלו את הצינור המכיל פילטר בחנקן נוזלי למשך 30 שניות ולאחר מכן הניחו אותו במהירות בהומוגנייזר של טחנת חרוזים במהירות של 4.5 מטר לשנייה למשך 30 שניות. הוסף 0.5 מיליליטר של מאגר ליזה לצינורות המכילים את החתיכות הקטנות הנותרות של המסנן השלם, ולאחר מכן הוסף 0.3 מיליליטר של מאגר ליזה לצינורות איסוף דגימות האוויר של 15 ו-1.5 מיליליטר ומערבל את הצינורות במצב זקוף והפוך למשך 10 עד 15 שניות בהתאמה. העבירו את מאגר הליזיס מכל צינור איסוף לצינורות מחוזקים של שני מיליליטר המכילים 300 מיליגרם חרוזי זכוכית.

עבד את הצינורות בהומוגנייזר טחנת החרוזים למשך 30 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות בכוח הכבידה פי 20,000 למשך דקה אחת ב-22 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר ושוב צנטריפוגה את הסופרנטנט בכוח הכבידה פי 20,000 למשך דקה אחת ב-22 מעלות צלזיוס. לאחר הוספת 30 מיקרוליטר של מגיב ליזה, דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר מכן, הוסף 0.2 מיליליטר של מאגר מקשר ו -100 מיקרוגרם למיליליטר של פרוטאינאז K לשפופרת, ואז השאר את הצינורות לדגירה בתנור בלוק בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לבסוף, הוסף 100 מיקרוליטר איזופרופנול לכל צינור. לאחר מכן, הניחו צינורות סינון סיבי זכוכית בנפח של 700 מיקרוליטר בצינורות איסוף של שני מיליליטר והעבירו לתוכו את תמיסות החילוץ.

לאחר ההעברה, צנטריפוגה את צינורות האיסוף בכוח הכבידה פי 20,000 למשך 30 שניות ב-22 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, הכנס את סיבי מסנן הזכוכית לצינורות איסוף טריים והשליך את צינור האיסוף. לכל צינור יש להוסיף 0.5 מיליליטר של מאגר להסרת מעכבים ולבצע צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 20,000 למשך 30 שניות ב-22 מעלות צלזיוס.

השלך את צינור האיסוף לאחר הצנטריפוגה והנח את צינורות המסנן בצינורות איסוף חדשים. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר של מאגר כביסה לכל צינור ושוב נתון לצנטריפוגה בכוח הכבידה פי 20, 000 למשך 30 שניות ב-22 מעלות צלזיוס. השליכו את צינור האיסוף והחליפו בטריים לאחר הצנטריפוגה.

שוב, הוסף 0.5 מיליליטר של מאגר כביסה לכל צינור וצנטריפוגה בכוח הכבידה פי 20,000 למשך 30 שניות ב-22 מעלות צלזיוס. כדי להסיר כל מאגר כביסה שנותר, סוף סוף צנטריפוגה את צינורות האיסוף בכוח הכבידה פי 20, 000 למשך דקה אחת בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס והשליכו את צינורות האיסוף והחליפו אותם בטריים. לאחר הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר פליטה חם, דגרו את הצינורות על ספסל המעבדה בטמפרטורת החדר למשך דקה עד שתיים וצנטריפוגה את צינורות האיסוף בכוח הכבידה פי 20,000 למשך 30 שניות ב-22 מעלות צלזיוס.

הנח את צינורות הסינון בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר והחל מחדש את האלואטים לצנטריפוגה עגולה נוספת. השתמש בצינורות PCR של 0.5 מיליליטר כדי להגדיר תגובות של 50 מיקרוליטר בשלוש עותקים עם חמישה מיקרוליטרים של DNA שכבר חולץ עבור כל תגובה, ולאחר מכן תכנת את התרמו-סייקלר והתחל את המחזור. מערבבים את כל שלוש תגובות ה-PCR יחד בצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מיליליטר.

הוסף 750 מיקרוליטר של מאגר מחייב וערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים. הוסף 450 מיקרוליטר מהתערובת הכוללת לעמודות סיבוב המוכנסות לצינורות איסוף והתחל לצנטריפוגה בכוח הכבידה פי 17, 900 למשך 30 שניות, ואז השליך את הסינון והוסף את 450 המיקרוליטר הנותרים של התערובת לסבב שני של צנטריפוגה. שוב, השליכו את המסנן והוסיפו 750 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמודי הסיבוב והצנטריפוגה בכוח הכבידה פי 17, 900 למשך 30 שניות ב-22 מעלות צלזיוס.

לבסוף, השליכו את המסנן וסובבו מחדש את העמודים הריקים בכוח הכבידה פי 17, 900 למשך דקה אחת ב-22 מעלות צלזיוס. לאחר העברת עמודי הסיבוב לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מיליליטר, פיפטה 45 מיקרוליטר של מאגר פליטה ודגירה על הצינורות על ספסל המעבדה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה של העמודים בכוח הכבידה פי 17, 900 למשך דקה אחת ב-22 מעלות צלזיוס.

טבלו ג'ל אגרוז 1% במאגר TAE מתקפל אחד בתא אלקטרופורזה, ולאחר מכן ערבבו שני מיקרוליטרים של מאגר טעינה פי חמישה עם שמונה מיקרוליטר של DNA מוגבר. לבסוף, טען את כל 10 המיקרוליטרים של הדגימה על הג'ל יחד עם סולם ה-DNA. הפעל את הג'ל ב 75 וולט למשך כ- 90 דקות.

ג'ל אגרוז מייצג מדגים הגברה של אזורי מרווח מתועתקים פנימיים של DNA גנומי פטרייתי שמקורו בדגימות אוויר תעסוקתיות. הנתיב בצד שמאל הקיצוני מייצג את נתיב סמן ה-DNA. הרצועות מימין מייצגות את אזורי המרווח המתומללים הפנימיים המוגברים מדגימות אוויר תעסוקתיות שונות בגדלים הנעים בין 750 ל-1,000 זוגות בסיסים.

תרשים קרונה מייצג מראה את נוכחותם של מיני פטריות טקסונומיות מגוונות בסביבה פנימית. דגימת הציקלון הביו-אירוסול של NIOSH שימשה בבתים לאיסוף ביו-אירוסולים למשך שעה כדי לקבוע את מיני הפטריות הקיימים. נתונים טבלאיים מייצגים את מדדי המגוון והעושר של מיני פטריות בסביבות פנימיות.

הנתונים מראים מדדי עושר גבוהים יותר של Chao-1, מדדי גיוון שאנון ומקדמי אי-דמיון של בריי-קרטיס בסביבות קירור ממוזגות ואידוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאסוף דגימות אוויר פנימיות ותעסוקתיות ולחלץ DNA גנומי לניתוח אוכלוסיות מיקרוביאליות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בשיטות האספטיות הטובות ביותר למניעת זיהום מיקרוביולוגי של הדגימות.