כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

המטרה הכוללת של תכשיר זה לפיזור כרומטין היא לדמיין באופן כרונולוגי את דפוסי הלוקליזציה הדינמיים של חלבונים הקשורים לכרומטין ומורפולוגיה כרומוזומלית של ביציות לאורך ביציות יונקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הרבייה הנשית, כגון זיווג כרומוזומים הומולוגי, סינפסה, תיקון DNA והפרדת כרומוזומים מיוטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת תיוג חיסוני ברור והדמיה של חלבונים הקשורים לכרומוזומים והערכה של פלואידיה של ביציות.

אוגנזה מועדת לטעויות, והטעות כרומוזומלית גורמת לעתים קרובות למחלה גנטית. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לשפר את הבנתנו את הגורמים האימהיים לאנופלואידיה ואי פוריות. לאחר המתת חסד של עכברה נקבה 14 עד 19 יום לאחר קיום יחסי מין, צור פתח בצורת V לתוך חלל האגן הבטני

ואז הסר את קרן הרחם האימהית. לאחר מכן, הפרד את העוברים מהשליה, והקריב את העוברים על ידי עריפת ראש. לאחר מכן העבירו אותם לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר המכילה שלושה מיליליטר PBS ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן העבירו גור אחד לצלחת נפרדת עמוסה גם ב-PBS חם. לאחר המתת חסד של העובר, בצע חתך לאורך קו האמצע הגחוני של החצי האחורי, לאורך החצי הקדמי מתחת לגפיים הקדמיות, וישירות מעל הגפיים האחוריות והזנב. לאחר מכן פתח את בטן העובר באמצעות מספריים בגודל 3.5 אינץ '.

בעזרת מלקחיים עדינים יש לעקור או להסיר את הכבד ולולאות המעי, ולחשוף את בלוטות המין. כעת קבע אם בלוטות המין הן בלוטות מין זכריות או נקביות. השחלות ממוקמות מיד מתחת לכליה ומאחוריה, לכיוון הדופן האחורית של חלל הצפק.

יש להסיר את שתי השחלות באמצעות זוג מלקחיים בעלי קצה עדין, ולהעביר אותן למיכל קטן המכיל PBS הנשמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. המשך במהירות לאסוף את השחלות מכל העוברים. לאחר מכן במיכל קטן חדש, טבלו לחלוטין כל קבוצה נפרדת של שחלות בחצי מיליליטר של מאגר מיצוי היפו טרי.

תנו להם לדגור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות, אך לא יותר מ -30 דקות. במהלך הדגירה, השתמש בעט PAP מחסום הידרופובי כדי לצייר שני ריבועים בגודל 22 על 22 מילימטר על מגלשת זכוכית נקייה. הכן שקופית אחת לכל סט שחלות.

בסיום הדגירה, הוסיפו טיפה של 50 מיקרוליטר של סוכרוז של 100 מילי-מולרית לשקופית נקייה, והעבירו זוג שחלות אחד לטיפה. כעת השתמש בשתי מחטים בגודל 27 כדי להקניט את השחלות ולשחרר את התאים בהן. בעזרת מלקחיים מוציאים וזורקים את חתיכות השחלה הגדולות.

לאחר מכן פיפטה בזהירות את תמיסת הסוכרוז כדי לפזר את התאים המשוחררים. לאחר מכן טען כל ריבוע על שקופית עם 40 מיקרוליטר של 1% PFA עם 0.2% טריטון X-100. מורחים את התמיסה סביב הריבוע באמצעות קצה פיפטה או על ידי נדנוד המגלשה קדימה ואחורה.

לאחר מכן, עבור כל מאגר של תמיסת סוכרוז עם תאים, טען שתי שלוליות קיבוע עם 20 מיקרוליטר של תאים תלויים כך שבכל שקופית יש תאים מקבוצה אחת של שחלות. עבור אוספי ביציות MI או MII, הכינו תחילה והמתת חסד של העכבר התורם. לאחר מכן צור פתח גדול בצורת V בחלל האגן הבטני, והשתמש במלקחיים כדי לעקור את המעיים כדי לאתר כל קרן רחם.

מצא את השחלות הקרובות לכלוב הצלעות. החזיקו את צינור הביצית בעזרת מלקחיים עדינים, וחתכו את השומן מעל השחלה בעזרת מספריים לדיסקציה. תוך כדי החזקת צינור הביצית, השתמשו במלקחיים עדינים כדי לשחרר את השחלה מהבורסה, והעבירו את השחלות לכלי איסוף המכיל מדיום הנשמר ב-37 מעלות צלזיוס.

כדי לאסוף ביציות בשלב GV, השתמש במזרק של מיליליטר אחד עם מחט בגודל 27 כדי לשחרר את קומפלקסי הקומולוס-ביצית על ידי ניקוב ידני של הזקיקים האנטרליים הגדולים. כדי לאסוף ביציות שלב MII, קרעו חור באמפולה של צינור הביצית כדי לשחרר אותן במקום פשוט לבצע ניקוב. כעת אספו את הביציות באמצעות פיפטת זכוכית או נימי זכוכית המופעלים בפה, או השתמשו במזרק מיקרומטר המופעל ביד.

חלק מהביציות עשויות להיות מוקפות בתאי קומולוס, אחרות לא. עבור ביציות MI, הכינו היאלורונידאז טרי ב-MEM-alpha/BSA כדי להוציא את הביציות של תאי הקומולוס שמסביב. עבור כל אוסף ביציות, יש לטפל בהן בחממה עם 2.5 מיליליטר היאלורונידאז מוכן למשך שלוש דקות.

לאחר מכן העבירו את ביציות ה-MI למדיום MEM-alpha/BSA חם טרי. שם, השתמש בפיפטה מזכוכית המופעלת על ידי הפה כדי לספק את כוח הגזירה הדרוש לניתוק מוחלט של תאי הקומולוס. באופן כללי, הצלחת הליך זה מחייבת שליטה באיסוף ומניפולציה של ביציות באמצעות פיפטות זכוכית או נימים המופעלים בפה.

אפשר לביציות להתאושש באינקובטור. בינתיים, לתוך צלחת זכוכית מחוממת של תשע בארות, העמיסו 300 מיקרוליטר של תמיסה חמה של טירוד. טען שתי בארות עם 300 מיקרוליטר של MEM-alpha/BSA חם, וטען באר אחת עם 300 מיקרוליטר של מדיום חם של Waymouth.

כדי להסיר את ה-zona pellucida, העבירו חמש עד 10 ביציות בשלב MII או MII לתוך האמבטיה של התמיסה של Tyrode למשך 30 עד 45 שניות בלבד תוך כדי צפייה בהן תחת מיקרוסקופ דיסקציה. כאשר ה-zona pellucida מומס באופן גלוי, העבירו מיד את הביציות למדיום באמצעות פיפטה רטובה מראש עם מדיום MEM-alpha/BSA. לאחר מכן העבירו את הביציות לאמבטיה שנייה של מדיום מחומם.

לאחר האמבטיה השנייה, העבירו את הביציות למדיום החם של וויימות', ותנו להן להתאושש באינקובטור למשך 30 דקות. כדי להתכונן לפיזור כרומטין, השתמש בעט PAP כדי לצייר מלבן בגודל 11 על 44 מילימטר על שקופית זכוכית. לאחר מכן מצפים את המגלשה בשכבה דקה של 1% PFA עם 0.2% טריטון X-100 במים, ולאחר מכן מנענעים את המגלשה קדימה ואחורה כדי לפזר את התמיסה.

לאחר מכן הקישו על השקף כדי להסיר את העודפים. כעת שואבים בין חמש ל -10 ביציות עם כמות מינימלית של מדיום. לאחר מכן העבירו את הביציות למגלשה המוכנה על ידי גרירת קצה פיפטה בו-זמנית דרך תמיסת הקיבוע והפלת הביציות על המגלשה מכסנטימטר אחד מעל.

הביציות צריכות להתפוצץ מיד, ולהפיץ כרומטין על המגלשה. כעת דגרו מגלשות בטמפרטורת החדר בתא לח סגור. תנו להם להתיישב למשך הלילה כך שהכרומטין יידבק לשקופית.

אוסף הכרומטין העוברי המתואר שימש לניתוח כמותי של היווצרות הצלבה בביציות שנקטפו מעוברי C57 שחור/6J. תכשירי התפשטות כרומטין פרופאזה סומנו בתווית חיסונית לזיהוי SYCP3, SYCP1 ו-MLH1, ונצבעו ב-DAPI. לכרומוזומים בשלב Pachytene היו 27 מוקדי MLH1 מפוזרים לאורך 20 מבני SC מורכבים במלואם.

כאשר הכנת הממרח הייתה לא אופטימלית ולא ניתן היה להבחין בין כרומוזומים בודדים, התכשיר לא נכלל בהערכה. בהכנות טובות, SMC6 הועשר באזור ההטרוכרומטין הפרי-צנטרומרי ולאורך זרועות הכרומוזום, ומוקדי MLH1 התפזרו לאורך ה-SC בשלב הפאצ'יטן. מספר ההצלבות החיוביות ל-MLH1 מ-15 תכשירים טובים מסוג פרא היה כ-24.

שיטת איסוף הביציות שימשה להערכת מורפולוגיה של כרומטין בביציות לאחר חידוש מיוטי. לוקליזציה של חלבונים, כמו גם פלואידיה, הוערכו בקלות, וחשפו גורמים פוטנציאליים לשגיאות בהפרדת כרומוזומים. ניתן היה לראות טופואיזומראז II-אלפא לאורך זרועות הכרומוזום וההטרוכרומטין הפרי-צנטרומרי.

בביציות MII, ניתן להבחין בין כרומטידות אחיות מזווגות על ידי מורפולוגיה של כרומוזום וצנטרומר. לאחר השליטה, ניתן להשלים את הטכניקות הללו ללא או אחרי התרבות תוך שעה או שעתיים לכל עכבר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות משלימות אחרות, כמו תיוג חיסוני של ביציות תאים שלמים והדמיית תאים חיים כדי להעריך כרומוזומים הומולוגיים וכרומטידות אחיות בהקשר של התא.

באופן קולקטיבי, ניתן ליישם בקלות שיטות התפשטות כרומטין המתוארות כאן כדי להעריך את ביציות היונקים ואת המאפיינים הדימורפיים המיניים של דינמיקת הכרומוזומים והחלבונים במהלך מיוזה.