להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לדמיין היווצרות מורכבת של חלבוני SNARE בתאים חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי סחר הממברנות, כגון זיהוי קבוצות חלבוני SNARE המזרזות את שלבי הסחר הספציפיים באורגנלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה ישירה של מיקומים סלולריים שבהם SNAREs עוסקים בהיווצרות מורכבת.

בניסוי זה, 900,000 תאי HeLa המחולקים בין שלושה צינורות אפנדורף משמשים לטרנספקציה. העבר את התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט עם המבנים הבאים. דגימה מספר אחת עם מבנה סינטקסינין-4 mCitrine, דגימה מספר שתיים עם סינטקסינין-4 mCitrine ו-VAMP3-mCherry, ודגימה מספר שלוש עם סינטקסינין-3 התמזגה הן ל-mCitrine והן ל-mCherry.

תרבית התאים הטרנספטנטיים ב-DMEM עם גלוקוז גבוה מסופקים עם 10% FCS ואנטיביוטיקה אנטיביוטית 1% ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 באינקובטור תרבית תאים למשך הלילה. למחרת, שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעם אחת עם מדיום הדמיית תאים חיים למשך שתי דקות. לאחר מכן, הנח את התאים במדיום הדמיה טרי.

כדי להתחיל בהליך זה, הנח דגימה מספר שתיים ב-37 מעלות צלזיוס, על במה מחוממת, תחת מיקרוסקופ קונפוקלי הדמיה פלואורסצנטית של תחום זמן עם מקור עירור פועם עבור הפלואורופור התורם ורכישת נתונים שנפתרה בזמן. לפני כל מיקרוסקופ הדמיה של אורך חיים פלואורסצנטי או מדידת FLIM, בחר תא עם ביטוי גלוי של חלבוני ה-mCitrine וה-mCherry המסומנים SNARE והקלט תמונה קונפוקלית של 256 על 256 פיקסלים עם עירור בו זמנית של שני הפלואורופורים. הקלט תמונת FLIM על ידי לחיצה על הפעל FLIM כאשר תמונת FLIM מוקלטת באותם מידות ורזולוציה מרחבית כמו התמונה הקונפוקלית שהוקלטה קודם לכן.

הקלט את התמונה עם לפחות 50, 000 פוטונים לניתוח FLIM של תא שלם או לפחות 400 פוטונים לפיקסל. חשוב להקליט את מדידות ה-FLIM במרחק של מיקרומטר אחד לפחות מפני השטח של הזכוכית כדי למנוע מבט השתקפות. חזור על ההדמיה ממספר תאים בדגימה מספר שתיים ועבור תאים בדגימה מספר אחת ודגימה מספר שלוש.

לאחר מכן, הנח פתק כיסוי זכוכית נקי על המיקרוסקופ stage להקלטת פונקציית תגובת מכשיר או IRF. כוונן את המונוכרומטור של גלאי הפליטה לאורך גל העירור ולחץ על הכפתור הפעל FLIM כדי להקליט תמונת FLIM עם פיזור אחורי מכיסוי הזכוכית. הקלטות התמונות יומרו לתמונות FLIM באמצעות תוכנת ההמרה PT32ICS.

הגדר את התוכנה. הגדר פלט ל-ImageJ ליצירת תמונות FLIM. קבעו את גודל התמונה ל- 256 על 256 פיקסלים ואת הערוץ לשניים.

לחץ על convert וטען עקבות פוטון אחד או יותר. השאר את מקש הבקרה לחוץ כדי לבחור עקבות פוטונים מרובים. יש ליצור תמונות FLIM באותה תיקיה שבה נשמרים עקבות הפוטון.

התחל בפתיחת תוכנת ניתוח הנתונים המסוגלת להתאים לדה-קונבולוציה. ייבא את קובץ הטקסט המכיל את ההיסטוגרמה עבור כל מעקב אחר פוטון. ארגן מחדש את הטבלה כך שה- IRF יהיה בעמודה השניה של הטבלה, לצד ערכי הזמן בעמודה A.קבע את איכות עקבות הפוטון המוקלטים על-ידי בחירת כל העמודות.

אין לנתח עקבות פוטונים עם שיא השתקפות גבוה. דוגמה מוצגת כאן. השתמש במקש הבקרה כדי לבחור את כל העמודות המכילות את ההיסטוגרמות של אורך החיים המבוקר של האיכות שיותאמו, כמו גם את ה- IRF בעמודה B, וטען את ההתאמה הלא ליניארית.

טען את פונקציית ההתאמה המפותלת על ידי הוספת פונקציה זו לתוכנת הניתוח. בחר את קובץ הפונקציה fit. פונקציה זו מתאימה להיסטוגרמות אורך החיים הקרינה עם פונקציית דעיכה מעריכית מונו-מעריכית עם ה-IRF.

בצע שינוי קנה מידה של ציר X של העקומות המותאמות. התאימו את הקימורים על ידי לחיצה על התאמה. פעולה זו תמיר את ההתאמה ותיצור גיליון דוחות במערך עם הטבלה המכילה את הקיזוזים והמשרעות של אורך החיים הקרינה.

זה גם יפיק גיליון נתונים עם העקומות המותאמות ושאריות ההתאמה. מוצגות תמונות קונפוקליות מייצגות של תאי הלו המבטאים רק סינטקסין ארבעה mCitrine, סניטקסין 4 mCitrine עם VAMP3 mCherry, או מבנה טנדם mCherry של סינטקסין 3 mCitrine. בתמונות אורך החיים הקרינה הנלוות הללו, הצבע מציין את אורך החיים הפלואורסצנטי הממוצע לכאורה.

לאחר מכן התמונות התפתלו עם עוצמות הקרינה של הפלואורופור התורם mCitrine. בהמשך מופיעות אותן תמונות עם התאמה לפונקציות דעיכה דו-מעריכיות. צבעי הפיקסלים מציינים את השברים המשוערים של תחביר ארבע בקומפלקס עם VAMP3.

פונקציית תגובת המכשיר של ההתקנה נמדדה באמצעות פיזור אחורי על ממשק מי הזכוכית. היסטוגרמות של אורך חיים של תא שלם מוצגות עבור תאים המבטאים רק סינטקסין ארבעה mCitrine, מבטאים במשותף סינטקסין ארבעה mCitrine עם VAMP3 mCherry, ומבטאים את מבנה הטנדם של סינטקסין שלושה mCitrine mCherry . לוח E מציג שכבת-על של עקומות הדעיכה של לוחות B, C ו-D.השיבוצים מציגים את אותם גרפים, אך עם קנה מידה לוגריתמי של ציר ה-Y.

היסטוגרמה פלואורסצנטית שנרשמה קרוב מדי לפני השטח של החלקת כיסוי המיקרוסקופ הביאה לשיא השתקפות גדול, המתואר על ידי האזור המוצלל בצהוב. לבסוף, מוצגת היסטוגרמה לכל החיים עם התאמה מייצגת עם פונקציית דעיכה דו-מעריכית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתעד תאים מרובים בעוד שרמות הביטוי של התורם והמיירט SNARES יכולות להשפיע על אורך החיים. בעקבות הליך זה, ניתן להפעיל את התאים על מנת לענות על שאלות ספציפיות לסוג התא הקשורות להשתרשות מחדש של סחר בממברנה בתיווך SNARE. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסחר בממברנות לחקור את המסלולים הבין-תאיים של תנועת האורגנלה בכל התאים האוקריוטיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להקליט ולנתח את נתוני FLIM. אל תשכח שעבודה עם אורגניזמים מהונדסים גנטית ולייזרים בעלי עוצמה גבוהה עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון כפפות ומגני עיניים, בעת ניסיון הליך זה.