Name: בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: למדו לבודד ולתרבת תאי סטרומה מח עצם מעכברים ולהבדילם לאוסטאובלסטים ואדיפוציטים. שיטה זו מאפשרת מחקר מהיר וחוזר בביולוגיית עצם ותאי גזע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01 AR061164-01A1).

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה-מכון המחקר מיין מרכז רפואי.
1. אוסף מנורות הכנה
<ol><li>להפוך את המדיה תרבות BMSC על ידי שכשהם בינוני חיוני מינימום α (MEM α) עם 10% סרום שור בעובר ו 1% של פניצילין/סטרפטומיצין.</li>
	<li>מקום µL 100 BMSC תרבות המדיה 1.5 mL microcentrifuge צינורות. 3 עצמות יתאימו בדרך כלל באחד צינור בודד אז התכוננו בהתאם.</li>
	<li>חותכים את הקצוות של 200 µL פיפטה טיפים מספיק כדי שיתאימו את החצוצרות שלה צנטריפוגה. הוסף את הטיפים בתוך הצינורות ולהבטיח כי המכסים יכולים לסגור לפני הנחת הצינורות על קרח. הערה: לחלופין, 0.75 מ ל צינורות microcentrifuge עם קצוות החתך יכול להיות מוכנס לתוך הצינור microcentrifuge 1.5 mL.</li>
</ol>2. הקציר של עצמות של עכברים
<ol><li>המתת חסד החיות באמצעות CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם, לרסס אותם עם 70% אתנול. הערה: ודא כי משמשים בעלי חיים מאותו המין, רצוי באותו הגיל. אנו משתמשים באופן שגרתי חיות בגילאי 7-8 שבועות. אנו ממליצים באגירת תאים בעלי חיים לפחות 3 לכל קבוצות ניסיוני להניב אוכלוסיה תא נציג, לשחזור טוב יותר.</li>
	<li>
הנח את העכבר לאללה על גבו על קרש החיתוך. נורא. להשתמש מלקחיים ליצירת אוהל של העור על הבטן. עושים חתך קטן (בערך 1 ס מ) בעזרת מספריים ויבתר סטרילי. לקלף העור לעבר הגפיים ואת כפות הרגליים של החתך כדי לחשוף את הבטן התחתונה ואת הרגליים.
	<ol>
<li>לחתוך מתחת לקרסול משותפת כדי להסיר את כף הרגל. חתך לאורך האגן-הירך. כדי להפריד את הראש של עצם הירך עצם הכסל. בעוד העכבר הוא עדיין על גבו, לעשות חתך באמצע עצם הכסל כדי להפריד בין שתי העצמות iliac.</li>
	</ol>
</li>
	<li>באמצעות מגבונים ללא מוך, הסר בזהירות את השריר מן עצמות הירך, tibias, ו- iliac עצמות. הערה: חיתוך באותה מידה של גידים, שרירים מן העצם כמו גורם אפשרי הניקוי למהירה וקלה עם המחיקות נטולת מוך (למשל, kimwipes). פעל בזהירות בעת הדחת את העצמות כפי שהם נוטים לשבור בקלות, ניתן להגדיל את השבריריות שלהם עם אחרים מסוימים.</li>
	<li>ברגע שיש כבר גזור כל הדגימות, למקם אותם ב- PBS בקרח ולהעביר אל ברדס תרבות סטרילי עבור השלבים הנותרים של בידוד. הערה: עובד גילוח ורחיצה כירורגית ככל האפשר יקטין את פוטנציאל זיהום בתרבויות.</li>
	<li>לבצע חתכים קטנים (כ 1-2 מ"מ) בשני קצותיו לקרע, העצמות לפני הכנסתם הטיפים משרטוטי בתוך הצינורות צנטריפוגה. הערה: ודא לחתוך מספיקה כך מח יכול להיות centrifuged עם זאת, יש לנקוט כדי למנוע חיתוך מדי כמו תא אוכלוסיות נוטים להשתנות בהתבסס על הקרבה בתוך החלל מח.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 10,000 x g 15 s בטמפרטורת החדר. ודא כי כל לשד סמוקות, מגורען בחלק התחתון של צינור 1.5 mL אמנם העצמות בתוך השרוול (גם 200 µL pipet עצה או 0.75 מ ל microcentrifuge tube). לאחר כל לשד נאסף, הסר את הכיסויים עם העצמות הצינורות אוסף. הערה: אם כל לשד התרוקן, העצמות יופיעו לבן. עם זאת, אם מח נותר בעצמות מסוימות, חיתוך הקצוות שוב ולנסות צנטריפוגה.</li>
</ol>3. תא השעיה
<ol><li>באמצעות מחט 25 גרם, למשוך התא. גללים למעלה ולמטה לאט לשבור את הגושים, לשלב את כל הדגימות לתוך צינור חרוטי בודד 15 מ"ל. להוסיף 10 מ של BMSC תרבות המדיה לכל µL 500 דוגמאות.</li>
	<li>מקום מסנן מיקרומטר 70 על גבי צינור חרוטי 50 מ ל, עוברים התליה תא במסנן זה כדי להסיר את שברי העצם אפשרי.</li>
</ol>4. ציפוי והתרבות של אוכלוסיות מעורבות של תאים במח העצם (כולל BMCs)
הערה: תאים מתורבתים ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור עם 5% CO2.
<ol><li>לחשב את מספר התאים, צלחת אותם ב- 1.0 x 10 תאים/ס מ6 2 בתקשורת תרבות. לאפשר 72 h של מעורב תרבות עבור תאים לצרף. הערה: אנו ממליצים דילול תא ההשעיה x 20 תרבות בתקשורת ודילול שוב ב- trypan כחול לפני ספירת התאים באמצעות hemocytometer. עבור עכברים C57Bl6/J זכר בן שבוע 7, אנחנו באופן שגרתי תשואות מספר התא בסביבות 50 x 106 תאים אבל גיל, מין ו זן יכול להשפיע על מספר הטלפון הנייד באופן משמעותי. הערה: אוכלוסיה מיקס של תאים צריך לצרף בחלק התחתון של התרבות היטב.</li>
	<li>לאחר 72 h, מסיר את המדיה ולהחליף אותו עם מדיה טריים. להמשיך לשנות את המדיה כל יום, בדוק אם confluency אחרים. כאשר התאים מגיעים 80-100% confluency, הם מוכנים בידול. הערה: כי תרבות זו הוא מעורב עם BMSCs וגם HSCs, זה יכול ישירות לשמש osteoblastogenesis, adipogenesis, כמו גם osteoclastogenesis.</li>
</ol>5. ציפוי והתרבות של האוכלוסייה פיצול של BMSCs (BMSCs חסיד)
הערה: תאים מתורבתים ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור עם 5% CO2.
<ol><li>צלחת כל התאים שנאספו מן עצמות הירך, tibias, עצמות iliac עכבר אחד לתוך תבשיל תרבות 10 ס מ (55 ס מ2 של תרבות). הערה: בעת צירוף 2-3 C57BL/6J עכברים, אנחנו צלחת בדרך כלל אוכלוסייה זו 'סה כ' מח עצם בבקבוקון2 150 ס"מ.</li>
	<li>לאחר 48 שעות של תרבות מעורבת, מסיר את המדיה תרבות (המכיל את הלא-מחסידי HSCs). אם osteoclastogenesis ניסויים שיש לבצע, להגדיר את אוכלוסיית תאים שאינם מחסידי הצידה (ראו סעיף 7), אם לא, וביופסיה ולמחוק את התאים האלה.</li>
	<li>לשטוף את הבקבוק/הצלחת עם PBS בזהירות כדי לא להפריע את התאים המצורפת.</li>
	<li>הסר PBS והרם את התאים על ידי הוספת 0.25% טריפסין המקננת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 מינימלית כבאות טריפסין על-ידי הוספת מדיה תא התליה תא. בשלב זה, BMSCs, אשר מוסרות כעת, ניתן לספור (שלב קודם לכן בוצע ב 4.1) מצופה לניסויים עתידיים.</li>
	<li>לחשב את מספר התאים הדרושים עבור ציפוי. Centrifuge הנפח הנדרש של תא ההשעיה-1000 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: תאים הם בדרך כלל מצופה בהתבסס על ניסויים מובילים. לדוגמה, אם חלבון/רנ א היא להיות מבודד אנחנו בדרך כלל לוחית רישוי-צפיפות גבוהה יותר (~1.0-2.0 x 106 תאים/טוב בצלחת. ובכן 6).</li>
	<li>הסר את המדיה, resuspend בגדר תא בהיקף של תרבות התקשורת לצורך ציפוי. צלחת התאים בתקשורת תרבות על פי הניסויים ולאפשר להם לצרף לכמה ימים. כאשר BMSCs מגיעים confluency, להמשיך לבצע בידול.</li>
</ol>6. הבידול של BMSCs
<ol><li>
תאי העצם
	<ol>
<li>לבצע אוסטאובלסט בידול מדיה על-ידי הוספת µL 800 של 1 מ' β-גליצרול פוספט PBS ו 200 µL של 0.5 M חומצה אסקורבית ב- PBS 99 מ של BMSC תרבות המדיה (ראה צעד 1.1 ההרכב של התקשורת התרבות BMSC).<ol>
<li>לאחר BMSCs תרבויות (סה כ BMCs מ שלב 4.3) או מחסידי BMSCs מהשלב 5.6 confluent, להבדיל אותם לתוך תאי העצם על ידי מיתוג התקשורת תרבות אוסטאובלסט בידול מדיה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>החלף את המדיה בידול בכל יום אחר. התאים להתחיל בהפקת גושים לבנים של מינרליזציה. דמיינו אותם בעין בלתי מזוינת בתחתית הבאר; תהליך זה יכול להתרחש תוך מספר ימים עד שלושה שבועות.<ol>
<li>על מנת להעריך osteoblastogenesis, לבצע צביעת phosphatase אלקליין ו/או פון Kossa מכתים בכל הנוגע לבארות כמתואר בסעיף 8. הערה: לשנות את התקשורת בקפידה על-ידי הטיית הלוחות בזווית קלה על מנת למנוע שיבוש טפט תא.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>הפוך מדיה הבסיס adipocyte על ידי ערבוב יחד 90 מ"ל של גלוקוז גבוהה Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), 10 מ של העובר סרום שור, 1 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין, 100 µL 20 מ מ רוזיגליטזון 100 µL של 2 מ מ אינסולין. אם יש צורך, לאחסן מדיה זו ב 4 מעלות צלזיוס במשך השבוע במהלך הניסוי בידול.</li>
		<li>להפוך את המדיה אינדוקציה adipocyte על-ידי הוספת µL 200 של 62.5 מ מ 3-איזובוטיל-1-methylxanthine (IBMX), µL 25 של 1 מ מ דקסמתזון 25 מ של Adipocyte בסיס מדיה.</li>
		<li>לאחר BMSCs תרבויות (סה כ BMCs מ שלב 4.3) או מחסידי BMSCs מהשלב 5.6 confluent, לשנות את המדיה מדיה אינדוקציה adipocyte. שקול את? היום הזה 0 של בידול.</li>
		<li>לאחר 48 שעות, מסיר את המדיה ולרענן את התרבות עם מדיה אינדוקציה adipocyte.</li>
		<li>ביום הרביעי, לעבור מדיה הבסיס adipocyte. הערה: טיפות השומנים יכול להתחיל להופיע מוקדם ככל יום 2 או 4 ביום.</li>
		<li>יום 7, להתבונן כי תאים הצטברו טיפות השומנים המרבי ולהציג את הפנוטיפ דומה adipocyte בוגר. לא תרבות מעבר לנקודה הזאת, זה עלול לגרום לתא המוות/ניתוק.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. הבידול של HSCs לתוך Osteoclasts
<ol><li>להפוך אוסטאוקלסט בידול מדיה על-ידי הוספת µL 50 µg 25/mL של קולטן Activator של NFKB ליגנד (רנקל) ו 15 µL של µg/mL 25 של מקרופאג גורם מגרה המושבה (mCSF) 25 מ של BMSC תרבות המדיה.</li>
	<li>ברגע של BMCs הכולל (מתוך שלב 4.3) או את התאים שאינם מחסידי (מתוך שלב 5.2) מחוברים היטב, ניתן להחזירו תרבות המדיה אוסטאוקלסט בידול מדיה. לחדש בידול מדיה בכל יום אחר.</li>
	<li>להתבונן התרבויות אוסטאוקלסט כל יום תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 10. שים לב כי osteoclasts נתיך ויוצרים תאים multinucleated, בדרך כלל סביב יום 5-7 של בידול.</li>
</ol>8. מכתים
<ol><li>
תאי העצם הערה: אלקליין פוספטאז (AP) ההכתמה, אנחנו לעתים קרובות להשתמש AP צביעת קיט (ראה טבלה של חומרים) על פי ההנחיות.<ol>
<li>לבצע AP צביעת על-ידי ביצוע ההנחיות של ערכת היצרן.<ol>
<li>האחות מדיה ולשטוף תאים עם PBS. לתקן את התאים עם 4% Paraformaldehyde (PFA) ב- PBS במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>בינתיים, להפוך את הפתרון AP באמצעות של ריאגנטים מנקודת הגישה מכתים הערכה על-ידי הוספת 500 µL נתרן חנקיתי כדי פתרון FRV-אלקליין 500 µL ולערבב בעדינות; משהים 2 דק להוסיף 22.5 מ ל dH2O ו- 500 µL Naphthol AS-BI אלקליין. מערבבים בעדינות. התראה: PFA הוא רעיל, יש לטפל בזהירות.</li>
			<li>ברגע התאים קבועים, לשטוף עם PBS ולהוסיף AP פתרון מכל קידוח (1-2 מ לכל טוב). מכסים בנייר כסף ומכניסים הכתם לתת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. וארוקן את הפתרון, לשטוף עם מים מזוקקים, ולאפשר את הצלחת לייבש.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לרכוש תמונות של המושבות מוכתם בעזרת מצלמה על מנת לצפות תאים חיוביים phosphatase אלקליין.</li>
		<li>לחלופין, לבצע פון Kossa במקום phosphatase אלקליין מכתים. בשביל זה, בארות לשטוף ביסודיות עם מים מזוקקים כמו כל PBS הנותרים לזרז עם חנקת הכסף.
		<ol>
<li>לתקן את התאים עם 4% מחברים ב- PBS במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 5% מספיק כסף חנקתי לפתרון מכסה הבאר, לחשוף בפני אור חזק לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להסיר את חנקת ולשטוף כל טוב עם מים מזוקקים. להוסיף 5% נתרן תיוסולפט פתרון לתאים, משהים 3 דקות.</li>
		<li>האחות של נתרן תיוסולפט, לשטוף עם מים מזוקקים. תן את הצלחת לייבש ולבחון את הפיקדון מינרלים צבעונית בחום כהה/שחור בעין בלתי מזוינת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>עבור צביעת שמן אדום O (אורו), לתקן את התאים באמצעות 10% נייטרלי Buffered פורמלין לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>בינתיים, להפוך את הפתרון מניות אורו על ידי המסת 0.035 g ב- 10 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל. . זה מספיק בשביל צלחת 6-. טוב. לערבב ולהעביר את הפתרון באמצעות נייר סינון אחד (נקבוביות בגודל 11 מיקרומטר).</li>
		<li>הפוך את הפתרון עובד אורו על ידי דילול 9 מ של פתרון מניות אורו, עם 6 מ של מים מזוקקים. לעזוב את הפתרון על כיסא נדנדה עד מוכן לשימוש.</li>
		<li>להכין 60% אלכוהול איזופרופיל במים מזוקקים (מרוויח מספיק כדי לכסות את כל טוב).</li>
		<li>לאחר התאים קבועים, להסיר את פעם אחת לשבועיים, תשטוף עם מים מזוקקים. להחליף את המים עם הפתרון אלכוהול איזופרופיל 60% 1 דקות. הערה: להוסיף נוזלים באיטיות תוך המפנה את הצלחת; adipocytes מכך בקלות רבה.</li>
		<li>להסיר את אלכוהול איזופרופיל ולהוסיף פתרון עובד מספיק אורו כדי לכסות את כל התאים. תקופת דגירה של 15 דקות על כיסא נדנדה במהירות נמוכה בטמפרטורת החדר. להסיר את אורו, לשטוף פעמיים עם מים מזוקקים. הערה: בשלב זה, השומנים שהוכתמו אורו טיפות ניתן לאבחן מתחת למיקרוסקופ.</li>
		<li>כדי לכמת את אורו, destain את אורו על-ידי הוספת 1 מ"ל של 100% אלכוהול איזופרופיל כל טוב ועל ידי מתנדנד באיטיות במשך 10 דקות.</li>
		<li>בינתיים, להכין סדרה דילול ליצירת עיקול רגיל המבוסס על תקני 8 הבאים באמצעות פתרון עובד אורו (2,100 µg/mL), אלכוהול איזופרופיל כמו diluent: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 ו 0 µg/mL.</li>
		<li>לטעון µL 200 של הסטנדרטים ודוגמאות destained ב triplicates בצלחת ולקרוא את ספיגת 490 nm.<ol>
<li>לקבוע ריכוז של אורו עבור כל דגימה בהתבסס על העקומה סטנדרטי. הערה: מומלץ נרמול הריכוז אורו אל מספר הטלפון הנייד. ניתן לכמת את המספר על ידי קריסטל ויולט להכתים או כמות ה-DNA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoclasts הערה: כשאתה מוכן, אנו מציעים מכתים osteoclasts עבור שימוש ההכתמה מלכודת פוספטאז חומצה Tartrate עמידים (השמנה) קיט (ראה טבלה של חומרים).<ol>
<li>על מלכודת מכתים, לתקן תאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם גלוטראלדהיד 2.5% ב- PBS. בינתיים, להפוך את הפתרון מלכודת על ידי ערבוב יחדיו. µL 50 בפתרון מהיר נופך בסיס, 50 µL של נתרן חנקיתי, 4.55 מ ל מים מזוקקים, µL 50 Napthol AS-Biphosphate, µL 200 של אצטט פתרון, פתרון Tartrate µL 100.</li>
		<li>האחות הנחה לשבועיים, ולשטוף את התאים עם PBS פעמיים לפני הוספת פתרון מלכודת 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לשטוף עם מים מזוקקים לפני שספר osteoclasts תחת מיקרוסקופ (הגדלה 10 X). התאים מלכודת+ מופיעים סגול עם 3 או יותר גרעינים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li>
<li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li>
<li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li>
<li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9(2015).</li>
<li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60(2008).</li>
<li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li>
<li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li>
<li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li>
<li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li>
<li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li>
<li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40(2012).</li>
<li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li>
</ol>

המחברים לחשוף כי להם אין אינטרסים כספיים.

במאמר זה, שתי שיטות של התרבות של BMSCs מוצגים עם המגבלות והיתרונות שלהן. בידוד תאים מגיע ממח העצם הוא תהליך יחסית ללא מאמץ. עם זאת, קבלת אוכלוסיה תא נציג של גזע mesenchymal או אבות osteoclastic יכול להיות מאתגר בשל הסביבה התאית מגוונות של חלל מח.
Culturing מכלול של התכנים מח עצם מספק ייצוג קרוב של microenvironment ויוו . עדיין, לבודד תאים מקבוצות שונות של עכברים (אחרים, טיפולים, הגילאים, וכו ') עלולה להביא מספר שונה של BMSCs או HSCs על הקמתה של הניסוי במבחנה . לכן, ה...

BMSCs מאתר ראשי משמשות כמודל במבחנה של גזע mesenchymal מאז גילוין בתחילת שנות השמונים1. אכן, תרביות של תאים פלסטיק-חסיד מבניין את חלל מוח העצם של עצמות ארוכות לשמר את היכולת להיות מבודלים לתוך תאי העצם, osteoclasts, chondrocytes או adipocytes הרבה מחקרים2,3, 4 , 5. עם זאת, מח העצם היא רקמה ייחודית המורכבת רבים אוכלוסיות תאים שונים, לרבות אך לא מוגבל, BMSCs, HSCs, תאי אנדותל, ואת המערכת החיסונית. לפיכך, בידוד וטכניקות תרבות יכולות להניב תא אוכלוסיות בעלות הומוגניות שונות. שימוש בטכניקות כאלה כדי לבדוק את הבידול פוטנציאליים מתאי יכול להיות מאתגר. לדוגמה, בעת השוואה בין תאים של עכברים עם אחרים שונים, החל עם אוכלוסיה לתא מעורב מגביל את הפרשנות של הנתונים. לעומת זאת, קבלת אוכלוסיות הומוגנית של BMSCs ו- HSCs יכול להיות מבחינה טכנית קשה ולא ניתן גם נציג של דגם ex-vivo .
במעבדה שלנו, אנו מעוניינים בעיקר הניצול של BMSCs בשל הפוטנציאל שלהם כדי להיות מבודלים לתוך תאי העצם, osteoclasts ו- adipocytes. כאן, אנו מציגים שיטות בידוד BMSCs ו- HSCs והתרבות להערכת osteoblastogenesis או adipogenesis במבחנה, כמו גם תרבויות HSCs כדי להתמיין osteoclasts. שיטה אחת משתמשת אוכלוסייה מעורבת של תאים במח העצם (BMCs) המכילה BMSCs ו HSCs ישירות מתאים adipogenesis, osteoblastogenesis, osteoclastogenesis (נקרא BMCs סה כ). שיטה זו היא קרובה יותר ex-vivo ייצוג של הטרוגניות מצא בין התאים של microenvironment מח העצם. שיטה נוספת מפרידה מחסידי מתאי שאינו חסיד, בניסיון אוכלוסיות "מזוכך" תרבות של BMSCs ו- HSCs (נקרא חסיד BMSCs). שיטת מאוחר יותר מאפשרת התרבות התא ניסויים כדי להתחיל עם מספר מדויק יותר של BMSCs או HSCs ומפחית את הפוטנציאל של מורכבות השפעות עקיפות של אוכלוסיות אחרות-תא שנותרו בתרבות. שתי השיטות יש כבר בעבר לאור ולא להשתמש בו כדי לטפל מחקריות שונות שאלות6,7,8,9.

<table><tbody><tr><td>200&mu; טיפים לפיפט&nbsp;</td><td>Rainin</td><td>17014401</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 15 מ"ל&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 50 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר מדע</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>כלי</td><td></td><td></td><td></td>דיסקציה</tr><tr><td>70 &mu; m מסננים</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.25% טריפסין</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ערכת פוספטאז אלקליין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86R</td><td></td></tr><tr><td>כסף חנקתי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>נתרן תיוסולפט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7026</td><td></td></tr><tr><td>שמן אדום O</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>10% ניטרלי חוצץ פורמלין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>ווטמן מסנן כיתה 1</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>Z274852</td><td></td></tr><tr><td>ערכת פוספטאז</td> <td>חומצה עמידה בפני טרטרטסיגמא-אולדריץ'</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>גלוטראלדהיד</td><td>אלקטרון</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>MEM&alpha;</td><td>Gibco</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-גליצרול פוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>רוזיגליטזון</td><td>קיימן כימיקל</td><td>717410</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>פפרוטק</td><td>310-01</td><td></td></tr><tr><td>mCSF</td><td>פפרוטק</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מהפך Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

מח עצם סטרומה תאים (BMSCs) מהווים אוכלוסיה תא בשימוש שגרתי כייצוג של גזע mesenchymal אין ויטרו. הם מתגוררים בתוך החלל מח העצם לצד hematopoietic תאי גזע (HSCs), אשר יכולים להצמיח תאי דם אדומים, מחוסן. אבות ו osteoclasts. לפיכך, עקירות של אוכלוסיות תאים מתוצאות מח עצם תערובת הטרוגנית מאוד של אוכלוסיות תאים שונים, אשר ניתן להציג את האתגרים בעיצוב ניסיוני, וחיסול פרשנות הנתונים. מספר בידוד וטכניקות תרבות פותחו במעבדות כדי לקבל אוכלוסיות פחות או יותר הומוגנית של BMSCs ו- HSCs invitro. כאן, אנו מציגים שתי שיטות בידוד של BMSCs ו- HSCs של עצמות ארוכות העכבר: שיטה אחת המניבה אוכלוסייה מעורבת של BMSCs ו- HSCs ובשיטת אחד שמנסה להפריד בין האוכלוסיות תא שני המבוסס על הדבקות. שתי השיטות מספקות תאים מתאים osteogenic ו- adipogenic בידול ניסויים מבחני גם פונקציונלית.

סקירה של התרבויות תא טכניקות תרבות שני אפשר לפצל ההערכה של בידול על אוכלוסייה מעורבת של BMCs של BMSCs ו- HSCs (סה כ BMCs, איור 1A) או אוכלוסייה של BMSCs מ- HSCs (מחסידי BMSCs, איור 1B). hr 48 לאחר בתאים ממח מבודדים, מצופה (איור 1C), הם במהירות לצרף התחתית לצלחת פלסטיק תרבות, נוטים ליצור של טפט. ברגע התאים להגיע למפגש (איור 1D), הם יכולים לשמש עבור מבח...

במאמר זה, נציג שיטות כדי לבודד, להבדיל תאי סטרומה מח עצם של תאי גזע hematopoietic עצמות ארוכות העכבר. שני פרוטוקולים שונים מוצגים מניב אוכלוסיות תאים שונים עבור הרחבת ובידול לתוך תאי העצם, adipocytes ו osteoclasts.

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולתרבית תאי סטרומה של מח עצם, או BMSCs. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי העצם והשומן לגבי תאי אב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד BMSCs בצורה מהירה יחסית, ניתנת לחזרה וזולה.הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית, מכיוון ששלבי הדיסקציה יכולים להיות קשים להסבר באמצעות טקסט בלבד. לפני תחילת הליך קצירת העצם, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי גזע של מח עצם לצינור מיקרו-צנטריפוגה אחד של 1.5 מיליליטר עבור כל שלוש עצמות שיש לקצור. וחתוך את הקצה מקצה פיפטה אחד של 200 מיקרוליטר לכל צינור מיקרוצנטריפוגה, כך שכל קצה יוכל להיכנס לצינור יחיד כשהמכסים סגורים.לאחר מכן, הניחו את העכבר הראשון בן 78 שבועות שהומת בשכיבה על לוח דיסקציה ורססו את החיה באתנול 70%. השתמש במלקחיים כדי ליצור אוהל עור על הבטן, והשתמש במספריים סטריליים כדי לבצע חתך עור של כסנטימטר אחד. קלף את העור לאחור כדי לחשוף את הבטן התחתונה והרגליים.חותכים לאורך פסגת הכסל של כל ירך כדי להפריד את ראשי עצם הירך מהאגן, ומבצעים חתך דרך קו האמצע של האגן כדי להפריד את עצמות הכסל, וחותכים מתחת למפרקי הקרסול כדי להסיר את כפות הרגליים. לאחר מכן, הפרד את השוקה מעצם הירך על ידי חיתוך במפרק הברך. לאחר מכן, השתמש במגבונים נטולי מוך כדי להסיר בזהירות את השריר מעצם הירך, השוקה ועצמות הכסל.לאחר שכל העצמות נאספו, הניחו את הדגימות ב-PBS על קרח, והעבירו את הדגימות למכסה תרבית סטרילי. בטכניקה סטרילית, בצע חתכים של מילימטר עד שניים בקצה הפרוקסימלי והדיסטלי של כל עצם לפני הנחת שלוש עצמות בכל קצה מיקרופיפטה שונה בצינורות המיקרו-צנטריפוגה. קצרו את מח העצם מהעצמות על ידי צנטריפוגה, ואשרו אם המח הוכנס לחלוטין לתחתית כל צינור מיקרו-צנטריפוגה בסוף הסיבוב.אם כל מח העצם נאסף, העצמות ייראו לבנות. הסר את קצות המיקרופיפטות ואת העצמות מצינורות האיסוף לסילוק בטיחות ביולוגית נאותה. כדי לצלחת תאי מח העצם, השתמש תחילה במזרק של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 25 כדי לתלות מחדש את הכדורים לאט ולפרק את כל הגושים, ולאגד את הדגימות לצינור חרוטי יחיד של 15 מיליליטר.הוסף 10 מיליליטר של מדיום תרבית תאי גזע של מח עצם לכל 500 מיקרוליטר דגימה, וסנן את תרחיף התאים דרך מסנן של 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי להסיר שברי עצם. לאחר הספירה, זרעו את תאי מח העצם בצפיפות של 10 עד 6 תאים לסנטימטר רבוע במדיום תרבית טרי למשך 72 שעות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. ביום השלישי, החליפו את הסופרנטנט במדיום טרי, והחליפו את המדיום כל יומיים לאחר מכן עד שהתאים מגיעים למפגש של 80% עד 100%.כדי לצלחת תרבית אוכלוסיית תאי מח עצם מפוצלת, צלחת את תאי מח העצם שנקטפו מעכבר אחד לתוך צלחת תרבית תאים בגודל 10 סנטימטר למשך 48 שעות במדיום תרבית טרי בחממת תרבית תאים. ביום השני של התרבית, הסר את הסופרנטנט המכיל תאי גזע המטופויאטיים שאינו נדבק, ושטוף בזהירות את הצלחת עם PBS, מבלי להפריע לתאי מח העצם הדבקים. החלף את ה-PBS ב-0.25% טריפסין.לאחר דקה עד שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הרוו את התגובה עם מדיום תרבית תאים טרי, וספרו את התאים בתרחיף התאים שנוצר. צנטריפוגה את מספר התאים המתאים לציפוי, ותלה מחדש את הגלולה במדיום תרבית טרי מספיק לצפיפות הציפוי הרצויה. לאחר מכן, הניחו את הצלחות בחממת תרבית התאים עד למפגש.כדי לגרום להתמיינות של תאי גזע של מח עצם, החלף את מדיום תרבית התאים במדיום התמיינות כל יומיים, עד שהתאים מתחילים לייצר גושים לבנים של מינרליזציה שניתן לצפות בהם באופן מקרוסקופי. כדי לגרום להתמיינות תאי גזע של תאי גזע של מח עצם, החלף את מדיום תרבית התאים של תרבית תאי מח עצם משולבת במדיום אינדוקציה של אדיפוציטים. לאחר יומיים של תרבית, החלף את הסופרנטנט במדיום אינדוקציה טרי של אדיפוציטים, ועבור למדיום בסיס אדיפוציטים ביום הרביעי.ביום השביעי, ודא שלתאים יש טיפות שומנים, ושהם מציגים פנוטיפ הדומה לאדיפוציטים בוגרים. כדי להבדיל את תאי הגזע ההמטופויאטיים לאוסטאוקלסטים, כאשר תרבית תאי מח עצם כוללת או תרבית תאים שאינה דבקה נדבקת, החלף את מדיום תרבית התאים במדיום התמיינות אוסטאוקלסטים. החלף את המדיום כל יומיים, ובדוק אם יש התמיינות אוסטאוקלסטים מדי יום תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 10 עד שהאוסטאוקלסטים מתמזגים ויוצרים תאים מרובי גרעינים, בדרך כלל בסביבות הימים החמישי עד השביעי של ההתמיינות.ניתן להבדיל תרביות קונגלואנט של BMSCs לאוסטאובלסטים באמצעות מדיום אוסטאוגני המורכב מחומצה אסקורבית ובטא-גליצרופוספט. לאחר מספר ימים של התמיינות, האוסטאובלסטים מתחילים לבטא פוספטאז אלקליין. והתמיינות נוספת תפעיל ייצור מטריצת אוסטאואידים, ובסופו של דבר מינרליזציה של מטריצה זו.מעניין שרק חלק מהתאים יתמיינו לאוסטאובלסטים במבחנה, כפי שמתגלה על ידי צביעה סגולה קריסטלית. בין אם משתמשים באוכלוסיות מעורבות או באוכלוסיות תאי מח עצם מפוצלים, רק חלק מהתאים יתמיינו לאדיפוציטים, המופיעים כתאים עגולים עם ואקואולים ליפידים מרובים שניתן לצבוע בצבע O אדום שמן. תרביות תאי גזע אנושיים בתוספת גורם מגרה תאי עכברים ו-RANKL יתמזגו במהירות ליצירת תאים מרובי גרעינים הצבועים חיוביים ל-TRAP.אוסטאוקלסטים אלה מסוגלים לספוג מחדש מטריצת מינרלים במבחנה, וניתן להשתמש בהם להערכת פעילות אוסטאוקלסטית. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך פחות משעה, אם היא מבוצעת כראוי, תלוי במספר העכברים. בזמן הניסיון בהליך זה, חשוב לזכור לעקר את הכלים ולהכין את המדיה מראש, כדי שתוכלו לעבוד במהירות ובאספטיות ככל האפשר.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולתרבית תאי סטרומה של מח עצם.

isolation-culture-differentiation-bone-marrow-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

וידאו זה מדגים את נוהל המבדילים תאים דנדריטים מיאלואידית ממח העצם העכבר. בידוד של השוקה העכבר הירך, ועיבוד של מח העצם הם הפגינו. תמונות הוכחת מורפולוגיה תא לפני ואחרי בידול, דמויות המתארות פנוטיפ התא IL-12 בייצור התבגרות הבאות באמצעות CPG מוצגים.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

בסרטון זה אנו מדגימים את הבידוד והתרבית של תאי סטרומה ממח עצם מהעצמות הארוכות של עכברים. ניתן להשתמש ב- BMSCs הדבקים המבודדים לניתוח נוסף.

בידוד ותרבית של תאי סטרומה ממח עצם משוקה עכברית

Osteoclasts הוא תא resorbing-עצם העיקרי בגוף. יכולת לבודד osteoclasts במספרים גדולים הביאה התקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה האוסטאוקלסטים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבידוד, טיפוח וכימות פעילות האוסטאוקלסטים במבחנה.

גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

איתות חריץ הוא צורה של תקשורת סלולרית המסתמכת על מגע ישיר בין תאים. כדי לגרום כראוי לאיתות Notch במבחנה, יש להציג ליגנדים של Notch לתאים במצב משותק. פרוטוקול זה מתאר שיטות לגירוי חוץ גופי של איתות Notch במבשרי אוסטאוקלסטים של עכברים.

גירוי של מערכת איתות Notch עכבר osteoclast המבשר

כתב יד זה מתאר פרוטוקול כדי לנתק את ותרבות osteoclasts במבחנה ממח העצם העכבר, וכדי ללמוד את התפקיד של מטרת מידע יונקים/מכניסטית rapamycin 1 מורכבים במבנה אוסטאוקלסט.

מבוסס רנקל אוסטאוקלסט תרבות וזמינותו של העכבר מח העצם כדי לחקור את התפקיד של mTORC1 במבנה אוסטאוקלסט

נדגים כיצד לזהות ולבודד 6 קבוצות משנה של אבות מיאלואידית ממח העצם מאתר באמצעות שילוב של מגנטי קרינה פלואורסצנטית מיון (מקינטוש ו- FACS). פרוטוקול זה יכול לשמש in vitro לקשרי תרבות מבחני (תרבויות methylcellulose או נוזל), ויוו המאמצת העברת הניסויים של RNA/חלבון ניתוחים.

זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר

אוסטאופנוקיים הם מקרופאג polykaryons רקמות שמקורם השושלת המונציט מקרופאג של תאי גזע המטפאות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד את התאים מח עצם כך כמויות גדולות של אוסטאוקלמות מתקבלים תוך צמצום הסיכון של תאונות שנמצאו בשיטות מסורתיות.

בידוד, טיהור, והבידול של אוסטאוקלסט מקדים של מח עצם חולדה

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית ויעילה לבודד וליצור תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם בטוהר גבוה מעכברים לאחר 7 ימים של תרבית עם 10 ננוגרם/מ"ל GM-CSF/IL-4.

פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים.

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

פרוטוקול זה מציג את ההתמיינות של אוסטאוקלסטים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) ומתאר שיטות לאפיון אוסטאוקלסטים ומבשרי אוסטאוקלסט.

התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

למדו לבודד ולתרבת תאי סטרומה מח עצם מעכברים ולהבדילם לאוסטאובלסטים ואדיפוציטים. שיטה זו מאפשרת מחקר מהיר וחוזר בביולוגיית עצם ותאי גזע.

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

גלה סרטונים נוספים