בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולתרבית תאי סטרומה של מח עצם, או BMSCs. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי העצם והשומן לגבי תאי אב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד BMSCs בצורה מהירה יחסית, ניתנת לחזרה וזולה.

הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית, מכיוון ששלבי הדיסקציה יכולים להיות קשים להסבר באמצעות טקסט בלבד. לפני תחילת הליך קצירת העצם, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי גזע של מח עצם לצינור מיקרו-צנטריפוגה אחד של 1.5 מיליליטר עבור כל שלוש עצמות שיש לקצור. וחתוך את הקצה מקצה פיפטה אחד של 200 מיקרוליטר לכל צינור מיקרוצנטריפוגה, כך שכל קצה יוכל להיכנס לצינור יחיד כשהמכסים סגורים.

לאחר מכן, הניחו את העכבר הראשון בן 78 שבועות שהומת בשכיבה על לוח דיסקציה ורססו את החיה באתנול 70%. השתמש במלקחיים כדי ליצור אוהל עור על הבטן, והשתמש במספריים סטריליים כדי לבצע חתך עור של כסנטימטר אחד. קלף את העור לאחור כדי לחשוף את הבטן התחתונה והרגליים.

חותכים לאורך פסגת הכסל של כל ירך כדי להפריד את ראשי עצם הירך מהאגן, ומבצעים חתך דרך קו האמצע של האגן כדי להפריד את עצמות הכסל, וחותכים מתחת למפרקי הקרסול כדי להסיר את כפות הרגליים. לאחר מכן, הפרד את השוקה מעצם הירך על ידי חיתוך במפרק הברך. לאחר מכן, השתמש במגבונים נטולי מוך כדי להסיר בזהירות את השריר מעצם הירך, השוקה ועצמות הכסל.

לאחר שכל העצמות נאספו, הניחו את הדגימות ב-PBS על קרח, והעבירו את הדגימות למכסה תרבית סטרילי. בטכניקה סטרילית, בצע חתכים של מילימטר עד שניים בקצה הפרוקסימלי והדיסטלי של כל עצם לפני הנחת שלוש עצמות בכל קצה מיקרופיפטה שונה בצינורות המיקרו-צנטריפוגה. קצרו את מח העצם מהעצמות על ידי צנטריפוגה, ואשרו אם המח הוכנס לחלוטין לתחתית כל צינור מיקרו-צנטריפוגה בסוף הסיבוב.

אם כל מח העצם נאסף, העצמות ייראו לבנות. הסר את קצות המיקרופיפטות ואת העצמות מצינורות האיסוף לסילוק בטיחות ביולוגית נאותה. כדי לצלחת תאי מח העצם, השתמש תחילה במזרק של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 25 כדי לתלות מחדש את הכדורים לאט ולפרק את כל הגושים, ולאגד את הדגימות לצינור חרוטי יחיד של 15 מיליליטר.

הוסף 10 מיליליטר של מדיום תרבית תאי גזע של מח עצם לכל 500 מיקרוליטר דגימה, וסנן את תרחיף התאים דרך מסנן של 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי להסיר שברי עצם. לאחר הספירה, זרעו את תאי מח העצם בצפיפות של 10 עד 6 תאים לסנטימטר רבוע במדיום תרבית טרי למשך 72 שעות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. ביום השלישי, החליפו את הסופרנטנט במדיום טרי, והחליפו את המדיום כל יומיים לאחר מכן עד שהתאים מגיעים למפגש של 80% עד 100%.

כדי לצלחת תרבית אוכלוסיית תאי מח עצם מפוצלת, צלחת את תאי מח העצם שנקטפו מעכבר אחד לתוך צלחת תרבית תאים בגודל 10 סנטימטר למשך 48 שעות במדיום תרבית טרי בחממת תרבית תאים. ביום השני של התרבית, הסר את הסופרנטנט המכיל תאי גזע המטופויאטיים שאינו נדבק, ושטוף בזהירות את הצלחת עם PBS, מבלי להפריע לתאי מח העצם הדבקים. החלף את ה-PBS ב-0.25% טריפסין.

לאחר דקה עד שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הרוו את התגובה עם מדיום תרבית תאים טרי, וספרו את התאים בתרחיף התאים שנוצר. צנטריפוגה את מספר התאים המתאים לציפוי, ותלה מחדש את הגלולה במדיום תרבית טרי מספיק לצפיפות הציפוי הרצויה. לאחר מכן, הניחו את הצלחות בחממת תרבית התאים עד למפגש.

כדי לגרום להתמיינות של תאי גזע של מח עצם, החלף את מדיום תרבית התאים במדיום התמיינות כל יומיים, עד שהתאים מתחילים לייצר גושים לבנים של מינרליזציה שניתן לצפות בהם באופן מקרוסקופי. כדי לגרום להתמיינות תאי גזע של תאי גזע של מח עצם, החלף את מדיום תרבית התאים של תרבית תאי מח עצם משולבת במדיום אינדוקציה של אדיפוציטים. לאחר יומיים של תרבית, החלף את הסופרנטנט במדיום אינדוקציה טרי של אדיפוציטים, ועבור למדיום בסיס אדיפוציטים ביום הרביעי.

ביום השביעי, ודא שלתאים יש טיפות שומנים, ושהם מציגים פנוטיפ הדומה לאדיפוציטים בוגרים. כדי להבדיל את תאי הגזע ההמטופויאטיים לאוסטאוקלסטים, כאשר תרבית תאי מח עצם כוללת או תרבית תאים שאינה דבקה נדבקת, החלף את מדיום תרבית התאים במדיום התמיינות אוסטאוקלסטים. החלף את המדיום כל יומיים, ובדוק אם יש התמיינות אוסטאוקלסטים מדי יום תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 10 עד שהאוסטאוקלסטים מתמזגים ויוצרים תאים מרובי גרעינים, בדרך כלל בסביבות הימים החמישי עד השביעי של ההתמיינות.

ניתן להבדיל תרביות קונגלואנט של BMSCs לאוסטאובלסטים באמצעות מדיום אוסטאוגני המורכב מחומצה אסקורבית ובטא-גליצרופוספט. לאחר מספר ימים של התמיינות, האוסטאובלסטים מתחילים לבטא פוספטאז אלקליין. והתמיינות נוספת תפעיל ייצור מטריצת אוסטאואידים, ובסופו של דבר מינרליזציה של מטריצה זו.

מעניין שרק חלק מהתאים יתמיינו לאוסטאובלסטים במבחנה, כפי שמתגלה על ידי צביעה סגולה קריסטלית. בין אם משתמשים באוכלוסיות מעורבות או באוכלוסיות תאי מח עצם מפוצלים, רק חלק מהתאים יתמיינו לאדיפוציטים, המופיעים כתאים עגולים עם ואקואולים ליפידים מרובים שניתן לצבוע בצבע O אדום שמן. תרביות תאי גזע אנושיים בתוספת גורם מגרה תאי עכברים ו-RANKL יתמזגו במהירות ליצירת תאים מרובי גרעינים הצבועים חיוביים ל-TRAP.

אוסטאוקלסטים אלה מסוגלים לספוג מחדש מטריצת מינרלים במבחנה, וניתן להשתמש בהם להערכת פעילות אוסטאוקלסטית. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך פחות משעה, אם היא מבוצעת כראוי, תלוי במספר העכברים. בזמן הניסיון בהליך זה, חשוב לזכור לעקר את הכלים ולהכין את המדיה מראש, כדי שתוכלו לעבוד במהירות ובאספטיות ככל האפשר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולתרבית תאי סטרומה של מח עצם.