סינתזה של Functionalized 10-nm פולימר מצופה זהב חלקיקים אנדותל הכוונת משלוח סמים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסנתז ננו-כדורי זהב מצופים פולימר פונקציונליים בקוטר של 10 ננומטר, תואמים ביולוגית, בעלי זמן זרימה ממושך וניתן לצלם אותם במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בקרדיולוגיה לגבי חדירות אנדותל בתנאי מחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יוצרת חלקיקים קטנים במיוחד תואמים ביולוגית שיש להם קבוצות פונקציונליות זמינות להתאמה אישית נוספת.

ראשית, בצינור מיקרו צנטריפוגה, יש לדלל 12 מיקרוליטר של 80% THPC במיליליטר אחד של מים טהורים במיוחד. מהדקים בקבוק תחתון עגול של 100 מיליליטר מעל צלחת ערבוב מגנטית. מוסיפים לבקבוק 45 מיליליטר מים ומוט ערבוב קטן בצורת ביצה.

התחל לערבב את המים ב -300 סל"ד. הוסף לבקבוק 0.5 מיליליטר של תמיסת נתרן הידרוקסיד מולרית אחת, ומיליליטר אחד של תמיסת THPC המדוללת. המשיכו לערבב במרץ את תערובת התגובה במשך חמש דקות.

לאחר מכן, הוסיפו לתערובת התגובה שני מיליליטר של תמיסת חומצה כלורואורית של 25 מילי-מולרית תוך כדי ערבוב. אשר שתערובת התגובה הצהובה הופכת לחומה כהה תוך שניות, מה שמעיד על היווצרות ננו-חלקיקי זהב מכוסים ב-THPC וטעונים שלילית. המשיכו לערבב את התערובת במשך 15 דקות.

בזמן שהתערובת מערבבת, הכינו תמיסה מימית של אמין PEG תיול הטרופונקציונלי, תיול קרבוקסימתיל PEG ותיול מתוקסי PEG חד פונקציונלי. לאחר שתערובת תגובת ננו-חלקיקי הזהב ערבבה במשך 15 דקות, הפחיתו את מהירות הערבוב ל-100 סל"ד. מוסיפים את תמיסות ה-PEG לתערובת תוך כדי ערבוב.

המשיכו לערבב בעדינות את התערובת למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סגור קצה אחד של קרום תאית MWCO של 12-14 קילו-דלטון עם קליפ דיאליזה. השתמש בפיפטה כדי להעביר את תערובת התגובה לקרום.

סגור את הקצה השני של הממברנה עם קליפ דיאליזה שני. דיאליזה של תערובת הננו-חלקיקים כנגד ארבעה ליטר מים מעורבבים ב-60 סל"ד למשך 72 שעות. החליפו את המים כל שעתיים בשש השעות הראשונות, וכל שש עד 12 שעות לאחר מכן.

לאחר מכן, סנן את תערובת ננו-חלקיקי הזהב המטוהרת למחצה דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר, לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. הקפיאו את תמיסת הננו-חלקיקים המטוהרת בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס למשך כחמש שעות. ליופיליזציה של הננו-חלקיקים המטוהרים באמצעות מייבש הקפאה.

כדי להתחיל להכין את ננו-חלקיקי הזהב הפגיליים הפלואורסצנטיים, מהדקים בקבוק תחתון עגול של 100 מיליליטר מעל צלחת ערבוב מגנטית. מוסיפים לבקבוק 18 מיליליטר מים טהורים במיוחד ומוט ערבוב קטן בצורת ביצה, ומתחילים לערבב ב-100 סל"ד. בשפופרת חרוטית של ארבעה מיליליטר, שלב שני מיליגרם של ננו-חלקיקי זהב פגיליים עם שני מיליליטר מים.

לאחר מכן, העבירו את תמיסת הננו-חלקיקים לבקבוק התחתון העגול להמשך בנייה מחדש. הוסף מיליליטר אחד של מאגר קרבונט מולרי pH 8.8, 0.1 מולרי לננו-חלקיקים המשוחזרים תוך כדי ערבוב. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטר של תמיסה של 10 מיליגרם למיליליטר של אסטר אנהידרוקסיסוקסימיד פלואורסצנטי בדימתיל סולפוקסיד.

עטפו את הבקבוק בנייר כסף כדי לא לכלול לחלוטין אור. המשיכו לערבב את תערובת הננו-חלקיקים הפלואורסצנטיים למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דיאליזה של התערובת כנגד ארבעה ליטר מים למשך 72 שעות באמצעות ההליך המתואר בהכנת ננו-חלקיקי הזהב הפגיליים.

שמור את המיכל מכוסה בנייר כסף לאורך כל הדיאליזה. הניחו בצד מיליליטר אחד של ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים מטוהרים לאפיון. הקפאה, ליופיליזציה ואחסנו את הננו-חלקיקים הפלואורסצנטיים הנותרים בארבע מעלות צלזיוס.

כדי לדמיין את ליבת ננו-חלקיקי הזהב עם מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, הנח תחילה 10 מיקרוליטר של תמיסת ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים מטוהרת על רשת TEM מצופה פחמן. הניחו לטיפה לשבת במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש בנייר סינון כדי לנדף בזהירות עודפי נוזלים מקצה רשת ה-TEM, עד שרק סרט של ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים נשאר על הרשת.

דמיינו את הננו-חלקיקים ב-80 קילו-וולט, בהגדלה של 50,000 עד 150,000. כדי למדוד את גודל הננו-חלקיקים ההידרודינמיים, הנח מיליגרם אחד של ננו-חלקיקי זהב מצופים THPC ליופיליזציה בצינור מיקרו צנטריפוגה. הוסף מיליליטר מים לכל צינור, והעביר את התמיסות לקובטות פלסטיק שקופות של מיליליטר אחד.

להעריך כל פתרון עם פיזור אור דינמי, ולמדוד את הקוטר ההידרודינמי הכדורי של החלקיקים. לאחר מכן, העבירו את הקובט המכיל את ננו-חלקיקי הזהב הפגיליים הפלואורסצנטיים לספקטרופלואורומטר. הגדר את אורך גל הפליטה ל-633 ננומטר, וקרא את אותות הפליטה מ-650 עד 800 ננומטר.

לאחר מכן, כדי להעריך תאימות ביולוגית בריכוזים של 7 ננו-חלקיקים, תחילה פיפטה 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי אנדותל כרית שומן של חולדה ב-DMEM לכל אחת מ-21 בארות של צלחת מטופלת בתרבית רקמה סטרילית תחתונה שקופה היטב. דגרו על התאים עד להשגת מפגש, ואז השיגו שבע תמיסות של ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים ב-DMEM בריכוזים הנעים בין אפס ל-1000 מיקרוגרם למיליליטר. שאפו את ה-DMEM מהבארות.

הנח 100 מיקרוליטר מכל אחת משבע תמיסות הננו-חלקיקים בכל אחת מהבארות הנפרדות בשלוש עותקים. אפשר לתאים ולננו-חלקיקים לדגור יחד במשך 16 שעות. לאחר מכן, שאפו את ה-DMEM וננו-חלקיקים תלויים או מחוברים באופן רופף מהבארות.

הוסף 100 מיקרוליטר של DMEM טרי המכיל 20 מיקרוליטר של תמיסת MTS/PES לכל באר. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, העריכו את כדאיות התא על ידי ניתוח כלורומטרי ב-492 ננומטר עם קורא הצלחות.

לאחר מכן, תאי אנדותל כרית שומן של חולדות זרעים על כיסוי זכוכית סטרילי של 12 מיליליטר מחליק ב-10,000 תאים לסנטימטר מרובע. האכילו את התאים ב-DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% סטרפטומיצין פניצילין. דגרו על התאים עד להשגת מפגש מלא.

שנה את הגליקוקליקס האנדותל אם תרצה, ולאחר מכן, דגר על התאים עם 550 מיקרוגרם למיליליטר של ננו-חלקיקי זהב פלואורסצנטיים למשך 16 שעות. הכן את התאים למיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. התקן כל החלקת כיסוי על שקופית מיקרוסקופ עם אמצעי הרכבה נגד דהייה המכיל DAPI.

אטום את קצוות החלקה של הכיסוי בעזרת לק. דמיין את תאי האנדותל המוכתמים במערכת החיסון במיקרוסקופיה קונפוקלית. דמיין את הגרעינים, את הפרין סולפט גליקוקליקס ואת הננו-חלקיקים עם תעלות כחולות, ירוקות ואדומות רחוקות, בהתאמה.

TEM של ננו-חלקיקי זהב מצופים THPC, הראה קוטר חלקיקים של שניים עד שלושה ננומטרים. TEM של הננו-חלקיקים הפגילטים יכול רק לאשר את נוכחותם של חלקיקים מפוזרים, מכיוון ש-PEG אינו נראה בתמונות TEM. DLS של ננו-חלקיקים מצופים THPC ופגיל הראה שינוי בקוטר השיא של החלקיקים מ-2.5 ננומטר ל-10.5 ננומטר

לפליטת הפלואורסצנט היה מקסימום בין 660 ל-672 ננומטר כאשר נרגש באור של 633 ננומטר, מה שהיה עקבי עם הפליטה המקסימלית הצפויה של 665 ננומטר עבור הגשושית הפלואורסצנטית בה נעשה שימוש. תאי אנדותל כרית שומן של חולדה הראו רמות דומות של כדאיות לאחר 16 שעות של דגירה משותפת עם ננו-חלקיקי זהב פלואורסצנטיים בריכוזים של עד מיליגרם אחד למיליליטר, מה שמעיד על חוסר רעילות משמעותית מהננו-חלקיקים. ספיגה מינימלית של ננו-חלקיקים נצפתה בתאי אנדותל כרית שומן של חולדות עם גליקוקליקסים בריאים.

ספיגה גדולה יותר באופן משמעותי התרחשה בתאים עם גליקוקליקסים מושפלים, כפי שמוצג על ידי העלייה באותות פלואורסצנטיים אדומים מהננו-חלקיקים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שינויים נוספים כגון צימוד על הקבוצות הפונקציונליות הפתוחות כדי לשנות את החלקיקים למיקוד ספציפי של רכיב אנדותל או מתן תרופה.