השלכות התנהגותיות, הרבייה לטווח ארוך של חשיפה עובריים חשיפה לרעלים במינון נמוך

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא לחקור את ההשפעות ארוכות הטווח של חשיפה ל-BPA במינון נמוך באמבריוגנזה מוקדמת. עוברי C.elegans נחשפים ל-BPA לתקופה מוגבלת ונבדקים בהגיעם לבגרות לפוריות והתנהגות למידה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות להשפעות ההתפתחותיות ארוכות הטווח של חשיפה לחומרים רעילים כגון ביספנולים ותרכובות משבשות אנדוקריניות אחרות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בדיקה של השפעות ארוכות טווח ועדינות של חומרים רעילים על התפתחות באמצעות מבחנים התנהגותיים כמותיים במודל מעבדה חסרי חוליות קל לשימוש. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הבנת הבסיס ההתפתחותי והעצבי של ההשפעות הבריאותיות המזיקות של חשיפה לחומרים רעילים גם במינונים נמוכים. הרעיון לניסויים האלה עלה לנו לראשונה כשהבנו שלמספר הפרעות מורכבות או רב-גורמיות יש מרכיב התפתחותי כזה או אחר.

מה שעשוי להשפיע בחלקו באמצעות ביטוי חריג של גנים קריטיים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי הרגלת המגע הפנימיים יכולים להיות קשים ללימוד אך ורק באמצעות הוראות מבוססות טקסט. יום לפני הסנכרון, העבירו תולעי N2 ללוחות של 100 מילימטר המכילים מדיה NGM, המפוזרים עם E.coli OP50.

על ידי חיתוך לוח של כסנטימטר מרובע. אפשר לתולעים לגדול במשך שלושה ימים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר שלושה ימים, כאשר הצלחות מאוכלסות במבוגרים בוגרים מוזנים היטב המכילים עוברים גלויים, התחל בסנכרון על ידי שטיפה ראשונה של כל צלחת עם חמישה מילימטרים של מאגר M9, והעברת הנוזל לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 3,000 למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. לאחר האישור, השתמש בפיפטה של עשרה מיליליטר כדי להסיר בזהירות את הסופרנטנט מכל כדור רופף של תולעים בוגרות. לאחר מכן מוסיפים 5 מיליליטר תמיסת היפוכלוריט טרייה שהוכנה לכל כדור תולעים, ומערבבים בעדינות.

צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 3,000 בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. זה קריטי להשיג אוכלוסיות מסונכרנות. הכנת תמיסת היפוכלוריט טרייה מסייעת במניעת זיהום ובעלי חיים לא מסונכרנים.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה של עשרה מיליליטר כדי להסיר את הסופרנטנט, ושטוף את שבעת המיליליטר של מאגר M9. חזור על שלב זה פעמיים. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו לביצים כ-100 מיקרוליטר של מאגר M9.

לאחר מכן העבירו כ-50 מיקרוליטר ביצים לשני צינורות מיקרופוגה של מיליליטר המכילים BPA מדולל במאגר S. התאם את כמות מאגר ה-S כדי להבטיח את הריכוז הסופי הנכון של BPA לכל צינור, כפי שמוצג בטבלה. הנח את הצינורות על נדנדה, או שייקר סיבובי, נע במהירות של 25 הטיות לדקה, או 25 סל"ד למשך ארבע שעות ב-20 מעלות צלזיוס.

לאחר ארבע שעות, הכניסו את הצינורות למחזיקי צינורות ואפשרו לתולעים להתיישב. השליכו את הסופרנטנט והעבירו את התולעים לצלחות NGM שנזרעו ב-OP50 E.coli. אפשר לתולעים לגדול במשך 60 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

בדוק את הצלחות כל יום לאיתור זיהום. לוחות NGM מזוהמים בדרך כלל דהויים ומלווים במושבות בודדות. בדוק תולעים מתחת למיקרוסקופ אם יש צפיפות.

ראשית, השתמש בחוט פלטינה מעוקר אש בקוטר 30 כדי להעביר כעשר תולעים צעירות מסונכרנות ללוחות NGM חדשים ללא זרעים. השאירו את התולעים ללא הפרעה למשך חמש דקות כדי לאפשר להן זמן להתאקלם לצלחת החדשה. לאחר מכן עקרו שיער גבות המחובר לקצה שיפוד עץ או קיסם על ידי טבילה באתנול 70%.

נגב עם טישו נקי ונטול מוך והמתן דקה אחת עד שהאתנול יתאדה. גע בעדינות בתולעת על הראש באמצעות שיער הגבות. חזור על הנגיעות, אפשר עשר שניות בין נגיעות כדי לאפשר לתולעת להתאושש.

המשך לגעת, אפשר מרווחי גירוי של עשר שניות עד שהתולעת כבר לא זזה לאחור. רשום את מספר הנגיעות הנדרשות כדי שהתרגלות זו תתרחש. חשוב לאפשר מרווח של עשר שניות בין נגיעות מכיוון שזה מאפשר לבעל החיים זמן התאוששות ומסייע בהשגת מבחני התנהגות הרגלה עקביים.

בעלי חיים בוגרים שנחשפו למיקרו-מולרית אחת או לריכוז גבוה יותר של BPA הטילו פחות ביצים באופן משמעותי בהשוואה לביקורת המיוצגת על ידי הקו האופקי. בעלי חיים בוגרים שמקורם בעוברים שנחשפו לריכוזי BPA נמוכים עד 0.1 מיקרוטוחנת מציגים ליקויים לא אסוציאטיביים המבוססים על המספר המוגבר של נגיעות קדמיות הנדרשות להתרגלותם. בעת הכנת עוברים לחשיפה ל-BPA, חשוב לבחור צלחת עם C.elegans בוגרים מוזנים היטב עם ביציות בוגרות הנראות במיקרוסקופ הדיסקציה על מנת לקבל גודל מדגם מספיק.

טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הטוקסיקולוגיה הסביבתית להעריך את ההשפעות של רעלים ותרכובות משבשות אנדוקריניות אחרות על התנהגות ולתכנן ניסויים מכניסטיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחשוף עוברי C.elegans בשלב מוקדם ל-BPA וכיצד לבחון התנהגות הרגלה אצל הבוגרים שנוצרו שמקורם בעוברים שנחשפו ל-BPA.