Name: שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: למד שיטה לניטור תנודות סידן בדנדריטים עצביים באמצעות הדמיית סידן בשני פוטונים בשילוב עם רישומי פאץ'-קלאמפ. טכניקה זו מאפשרת תצפית ברזולוציה גבוהה של אותות סידן במחלקות דנדריטיות קטנות במוח עכברים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הקנדית מכוני הבריאות מחקר מדעי הטבע, מחקר הנדסי (NSERC גילוי גרנט) וקרן סבוי. OC נתמכה על ידי מלגת דוקטורט מ NSERC.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות רווחת החיה הגנה הוועדה של אוניברסיטת לאוול והמועצה קנדי על טיפול בעלי חיים.
1. הכנה ראשונית (אופציונלי: להכין יום מראש)
<ol><li>הכינו שלושה סוגים של נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) פתרון (רגילה, סוכרוז, התאוששות פתרונות, 1 ליטר לכל; ראה טבלה 1). התאם את osmolality של הפתרונות ± 10 300 mOsm25 . ומגניב כלנית חדד-סוכרוז עד נקודה ליד קירור (0-4 ° C). הערה: השימוש של פתרון חיתוך דל-נתרן (כלנית חדד-סוכרוז) מסייעת לשמר את הכדאיות של נוירונים בשכבות השטחיות של פרוסות חריפה26.</li>
	<li>להכין 0.75 מ של תיקון-פתרון הכולל של fluorophore אדום (למשל, אלקסה-594), מחוון ירוק סינתטי סידן (למשל, אורגון הירוקה BAPTA-1; ראה טבלה 1). כוללים biocytin (ראה טבלה 1) בפתרון התיקון-אם פוסט הוק זיהוי מורפולוגי של תאים מוקלטות נדרשת.</li>
	<li>התאם את osmolality של הפתרון 280 mOsm ± 5 ו- pH 7.35 ± 0.5. שמור את הפתרון במקרר או על קרח בכל עת. הערה: בחירה של מחוון סידן צריך להיות המבוססים על טווח דינמי שלה ועל אופיה של האירועים2 + Ca ובדוקים.</li>
	<li>שימוש של פולר micropipette, להכין טלאי פיפטות של נימים זכוכית בורוסיליקט (ראה טבלה של חומרים) עם טיפ 2 מיקרומטר ≈ (פיפטה ההתנגדות של MΩ 3-5), גירוי פיפטות של נימים תטא-זכוכית בורוסיליקט (ראה טבלה של חומרים) עם טיפ 2-5 מיקרומטר. הערה: ההגדרות פולר כדי להפוך פיפטות של קוטר נתון ו צורה ייקבעו לפי סוג נימה של פולר את תוצאות הבדיקה כבש עבור סוג מסוים של זכוכית.</li>
</ol>2. בהיפוקמפוס פרוסה הכנה
<ol><li>עזים ומתנגד העכבר (P13-20; את הלחץ ואת המין של העכבר נקבעת לפי השאלה ניסיוני שפנתה) עם 1 מ"ל של איזופלוריין להציב על גבי מגבת נייר בתוך תא הרדמה אינהלציה. כאשר החיה הוא מורדם עמוקות, כפי שמעידים חוסר תנועה, נשימה איטית, להסיר אותו מהתא הרדמה, לערוף באמצעות גיליוטינה.</li>
	<li>לחשוף את הגולגולת על ידי חיתוך העור עם זוג מספריים מהחלק האחורי של הגולגולת באף קטן. השתמש זוג קטן של העצם מיני rongeurs כדי לעשות חור ברמת bregma. ואז להשתמש המספריים לעשות חתך סימטרית-על-rostral לאורך התפר המשונן. עם rongeurs לאחוז האחורי של כל הגולגולת הכריכה, מעלית כלפי מעלה והחוצה כדי להסיר את הגולגולת כיסוי האונה כל.</li>
	<li>אחרי המוח נחשף במלואו, לערער העצבים האופטים עם מרית קטנה. מסירים את המוח מהגולגולת והכניס אותו לתוך צלחת פטרי המכילות ברציפות מחומצן, קר כלנית חדד-סוכרוז (ראה טבלה 1 ריכוז סוכרוז).<ol>
<li>אם הרקמה של עכברים בוגרים נדרש, לבצע זלוף intracardiac באמצעות מזרק (25 גרם) מלא 20 מ של חנה המבר כקרח-סוכרוז לפני החילוץ במוח כדי לקבל פרוסות באיכות טובה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין פרוסות בהיפוקמפוס מהמוח בעלי חיים שחולצו.<ol>
<li>תן הצינה המוח עבור בסביבות 2 דק מניחים חתיכת נייר סינון על צלחת פטרי וגדוש קרח, להעביר את המוח על גבי נייר הסינון. לנתח את שתי ההמיספרות.</li>
		<li>הדבק את ההמיספרות גזור (הכיוון נקבעת על-ידי המטרה ניסיוני כדי לקבל פרוסות הפרונטליים, חציה או אופקי) על גבי שולחן vibratome, לטבול אותו במגש vibratome מלא עם חנה המבר מחומצן כקרח-סוכרוז. להפוך 300-מיקרומטר פרוסות עבות בטמפרטורה של 1 ° C באמצעות vibratome קריר או הצבת הקרח סביב המגש vibratome.</li>
		<li>בעזרת מכחול שטוח, לצבור את פרוסות המכילות בהיפוקמפוס (עד 6 פרוסות לכל חצי הכדור) באמבט המכיל חמצן חנה המבר-שחזור מחומם ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להשאיר את הפרוסות באמבטיה כלנית חדד-התאוששות למשך לפחות 45 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות
<ol><li>להציב פרוסה בהיפוקמפוס באמבט מתחת המטרה (הגדלה: 40 x, מפתח נומרי: 0.8) של מיקרוסקופ שני הפוטונים סריקה בלייזר. ללא הרף perfuse האמבטיה עם חמצן חנה המבר-נורמלית מחומם ב 30-32 מעלות צלזיוס בשיעור של 2.5-3 מ לדקה.</li>
	<li>השתמש ניגודיות התערבות דיפרנציאלית אינפרא-אדום (IR-DIC) או Dodt-מפקדת הסטארגייט מיקרוסקופ כדי לאתר תא עניין באמצעות שלה גודל, צורה, מיקום. הערה: בהתאם האוכלוסייה נוירון יישוב, מודל הטרנסגניים העכבר ניתן לאתר בקלות תאים עניין. במקרה זה, שלב זה הרבה עם שימוש של מקור אור פלורסנט.</li>
	<li>למלא פיפטה גירוי של פתרון כלנית חדד-נורמלית המכיל את fluorophore אדום (למשל, אלקסה-594).</li>
	<li>להגדיר את פיפטה גירוי (מחוברים יחידת גירוי חשמלי) על הפרוסה כך הקצה הוא באותו אזור של התא עניין.</li>
	<li>לאחר מילוי של פיפטה תיקון עם פתרון תיקון וצירופם לשלב ראש, להגדיר אותו על הפרוסה כך את קצהו הוא ישירות מעל התא של ריבית.</li>
	<li>להשתלב מזרק צימוד-כיוונית וחבר אותו התיקון-פיפטה דרך הצינורית פלסטיק. להזריק לחץ חיובי קבוע לתוך פיפטה תיקון (≈ 0.1 מ"ל) באמצעות המזרק. שמור את צימוד במצב "סגור".</li>
	<li>להפעיל את המודול תוכנות שליטה מגבר, לעבור למצב המתח להדק בלחיצה על כפתור "VC". פתח אלקטרופיזיולוגיה נתונים רכישת התוכנה (למשל, clampex) עבור רכישת של אותות אלקטרופיזיולוגיות ולחץ על הסמל "קרום מבחן" לעשות זה לשלוח ללא הרף את מתח מרובע דופק (5 mV, 10 ms), אשר יש צורך לנטר שינויים בהתנגדות פיפטה.</li>
	<li>. תוריד את פיפטה תיקון עד שזה ישר לראש התא יישוב. בעת יצירת קשר עם קרום התא, להסיר את הלחץ על-ידי הפעלת את צימוד למצב 'פתח'. הערה: קשר עם קרום התא מזוהה בעת עלייה קטנה במחתרת פיפטה (≈ 0.2 MΩ) נתפסת והיא כניסה קטן על התא נגרמת על ידי לחץ אוויר חיובי.</li>
	<li>לחץ שלילי קלה חלות על פיפטה תיקון באמצעות על מזרק ריק מצויד לתוך צימוד עד ההתנגדות פיפטה שמספקת התוכנה מגיע 1 GΩ. בחלון "הבדיקה" קרום"של התוכנה רכישת נתונים, מהדק את התא ב-60 mV.</li>
	<li>המשך הפעלת לחץ שלילי עד התא נפתח תצורת כל-תא מושגת. זיהוי של מדינה תא מתבסס על השינוי הפתאומי ההתנגדות פיפטה (מתוך GΩ 1 ל 70-500 MΩ בהתאם לסוג interneuron) ואת המראה של תופעות מעבר קיבולי גדול בחלון "הבדיקה" קרום".</li>
</ol>4. שני הפוטונים Ca2 + הדמיה
<ol><li>אם מעוניינת התגובות postsynaptic סינאפסות, להוסיף את gabazine חוסם קולטן GABAA (10 מיקרומטר) ו את חוסמי קולטן GABAB CGP55845 (2 מיקרומטר) באמבטיה כלנית חדד.</li>
	<li>במודול תוכנת שליטה מגבר, הגדר את תצורת תיקון הנוכחי-קלאמפ על-ידי לחיצה על כפתור "CC" ולהקליט דפוס הירי של התא בתגובה סומאטית זריקות של depolarizing הנוכחי (0.8-1.0 nA, 1 s). המתן לפחות 30 דקות של התא תהיה מלאה האינדיקטורים נוכח הפתרון תיקון. הערה: ירי דפוס ומאפיינים פעיל של התא יכול לשמש כדי לזהות את סוג המשנה של התא; למשל, תאים עולה מהר. חשוב על ריכוז מחוון לייצב באמצעות דיפוזיה לפני שמתחילים להקליט חתולים (ראו טבלה 2 פתרון בעיות).</li>
	<li>AP-עורר חתולים<ol>
<li>באמצעות התוכנה רכישת התמונה, להתחיל רכישת תמונות. אתר של דנדריט עניין באמצעות האות פלואורסצנטי אדום. כדי להבטיח תגובה גלויה, ראשית, לבחור דנדריט צינתור (≤ 50 מיקרומטר) כמו היעילות של AP backpropagation עלולה לרדת באופן משמעותי עם מרחק GABAergic interneurons22.</li>
		<li>באמצעות הכלי' מלבני' בתוכנה רכישת התמונה, להגדיל האזור ולעבור "xt" מצב (linescan). מקם את הסריקה ברחבי הסניף דנדריטים של ריבית. עם עוצמת לייזר בקרי בתוכנת רכישה, להגדיר את הלייזר שני הפוטונים ברמה כוח מינימלי איפה בסיסית ירוק הוא גלוי רק מעט, כדי להימנע phototoxicity.</li>
		<li>באלקטרופיזיולוגיה נתונים רכישת התוכנה 'פרוטוקול' חלון ותמונה רכישת תוכנה, ליצור גירסת ניסיון הקלטה של משך הנסיעה המכיל זריקה הנוכחי סומאטית של משרעת הרצוי.<ol>
<li>באמצעות התוכנה רכישת התמונה, לחץ על לחצן "התחל רשומה" ולרכוש פלורסצנטיות ברציפות עבור חזור ס' 1-2 הרכישה תמונה 3 - 10 פעמים. חכה לפחות 30 s בין הסריקות יחיד כדי למנוע נזקי. אם רכישת linescans בנקודות מרובים לאורך דנדריט, לקחת אותם בסדר אקראי כדי למנוע תופעות סדר.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>חתולים עורר synaptically<ol>
<li>אתר של דנדריט עניין באמצעות האות פלואורסצנטי אדום.</li>
		<li>הגדר את פיפטה גירוי על פני השטח של הפרוסה מעל דנדריט עניין. הורידו לאט את פיפטה גירוי למקומו, צמצום התנועה כדי שלא להפריע למטופלים את תצורת כל תא. מקם פיפטה של 10-15 מיקרומטר של פיתוח.</li>
		<li>כדי להמחיש את המיקום של microdomains סינפטית ב aspiny דנדריטים, בתוכנה רכישת התמונה לעבור 'xt' (linescan) מצב ומקם את הקו לאורך הענף דנדריטים עניין.</li>
		<li>"פרוטוקול" חלון (אלקטרופיזיולוגיה נתונים רכישת תוכנה), תמונה רכישת תוכנה, ליצור משפט הקלטה שמפעיל את יחידת גירוי לאחר תחילת המשפט.</li>
		<li>באמצעות רכישת התוכנה, לחץ על לחצן "התחל רשומה" כדי לסרוק לאורך פיתוח ברציפות עבור רכישת חוזר ס' 1-2 3 - 5 פעמים, מחכה 30 s בין הסריקות כדי למנוע נזקי. הערה: האורך של הסריקה ניתן להתאים בהתאם קינטיקה של האירוע עורר, אך צריך להיות ממוזער כדי למנוע נזקי (ראו טבלה 2 פתרון בעיות).</li>
		<li>חזור על שלב 4.5.5 בתנאים שונים (למשל, העוצמה/אורך שונים של גירוי, הקדמה של חוסם הפריטים המוקפצים תרופתי, וכדומה) בהתאם לשאלה ספציפית נותרים ללא מענה.</li>
		<li>לעצור את הרכישה כאשר התא מראה סימנים של הידרדרות בריאות: דפולריזציה מתחת-45 mV, עלייה הבסיס Ca2 + רמה, הידרדרות מורפולוגי של דנדריטים (למשל, blebbing, פיצול; ראה בטבלה 2 פתרון בעיות).</li>
		<li>כדי לקבל מידע ראשוני על המורפולוגיה של התא לשמור רשומה של המיקום של פיפטה גירוי, רוכשים את Z -ערימה של התא ערוץ הצבע האדום. שימוש בתוכנת רכישה ב 'xyz' מצב, מציבה את הגבולות העליונים והתחתונים מחסנית לשיקוף את התא כולו עם כל התהליכים כללו. להגדיר את 'גודל צעד' ב 1 מיקרומטר וליזום הרכישה מחסנית באמצעות לחצן "התחל רשומה".</li>
		<li>כאשר Z-מחסנית הרכישה הושלמה, השתמש באפשרות "הקרנה מרבי" בתוכנה כדי להרכיב כל התכניות מוקד המחסנית של ולוודא את האיכות של רכישה. ואז, לאט לאט נסגרים על פיפטה תיקון מחוץ הפרוסה</li>
		<li>כדי לתקן את הפרוסה לזיהוי מורפולוגי פוסט הוק , להסיר את הפרוסה של האמבטיה באמצעות מכחול שטוח, ובמהירות במקום זה בין בשני העיתונים מסנן, צלחת פטרי מלא כלנית חדד. להחליף את חנה המבר פתרון paraformaldehyde (PFA) 4% ולהשאיר את המנה 4 ° C החדר או במקרר למשך הלילה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. אימונוהיסטוכימיה לזיהוי מורפולוגי פוסט הוק של תאים מוקלט
הערה: לאחר לילה 1 של קיבוע מחברים, הפרוסה ניתן לאחסן במאגר פוספט (PB) עם אזיד הנתרן (0.5%) עד כחודש.
<ol><li>הכניסו את הפרוסה באגירה טריס תמיסת מלח (TBS) עם טריטון X-100 (0.3%) ולבצע שוטף 4 (5-10 דקות כל אחד).</li>
	<li>הכניסו את הפרוסה TBS-טריטון 0.3% עם 10% נסיוב עז רגילה (הגדרות) 1 h.</li>
	<li>לשים את הפרוסה TBS-טריטון 0.3% 1% המיתרים, של Streptavidin מצומדת fluorophore (למשל, אלקסה עבור חיל הים 546-מצומדת Streptavidin, 1:200) עבור לילה הדגירה.</li>
	<li>לשטוף 4 פעמים (5-10 דקות) ב- TBS.</li>
	<li>הר פרוסות על שקופיות מיקרוסקופ, התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. כדי שיחזור תא מלאה, לרכוש Z-מחסנית (שלב גודל: 1 מיקרומטר) באמצעות מטרה 20 x. עבור הדמיה תווית של אלקסה-546-מצומדת, להגדיר שימוש בלייזר nm 543 וזיהוי nm 515-560 לסנן.</li>
</ol>6. ניתוח של חתולים
<ol><li>לחלץ את הערכים פלורסצנטיות מהאזורים של הריבית (ROIs) של תמונות linescan מן הערוצים אדום וירוק, ממוצע של הערכים של חוזר מרובים עבור כל תנאי להפחית את הרעש. הערה: כאשר linescan הרכישה מתבצעת לאורך פיתוח, זה אפשרי לחלץ נתונים מתוך ROIs מרובים, אשר יתאימו ל- microdomains דנדריטים (2-5 מיקרומטר), ובכך מאפשרים לימוד Ca2 + אות מידור.</li>
	<li>עבור כל רועי, לבטא את השינויים ב- Ca2 + משרעת כמו: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> הערה: כאן G הוא הערך פלורסצנטיות מערוץ ירוק; G0 הוא הערך פלורסצנטיות בסיסית בלבד לערוץ הצבע הירוק במהלך תקופת טרום גירוי; R הוא הערך זריחה של הערוץ האדום18. שני הפוטונים עירור הוא מקומי מאוד, אינו יוצר רקע משמעותי, חיסור של רקע זריחה אינה נדרשת.</li>
</ol>

<ol><li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li>
<li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+upmanship%3A+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li>
<li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li>
<li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li>
<li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li>
<li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li>
<li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li>
<li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li>
<li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2%2B+signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li>
<li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2%2B+signaling+in+hippocampal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li>
<li>Camiré, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li>
<li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thespread+of+Na%2B+spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2%2B+entry+into+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li>
<li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+release+of+Ca2%2B+from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li>
<li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca%282%2B%29+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li>
<li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites%3A+contribution+of+Ca2%2B-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li>
<li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones%3A+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li>
<li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li>
<li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5(2004).</li>
<li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10777761">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li>
<li>Camiré, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/225093837_Functional_compartmentalisation_and_regulation_of_postsynaptic_Ca2_transients_in_inhibitory_interneurons">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li>
<li>Guet-McCreight, A., Camiré, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+%28IS3%29+cells+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li>
<li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2%2B+signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li>
<li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li>
<li>Camiré, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons%3A+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259(2012).</li>
<li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+RevNeurosci%22%5BJournal%5D)">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li>
<li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li>
<li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+two-photon+uncaging%3A+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li>
<li>Salomé, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li>
<li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li>
</ol>

המחברים יש אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים.

השיטה המוצגת כאן מדגים כיצד ניתן להשתמש השילוב של שני הפוטונים Ca2 + הדמיה electrophysiology תיקון-קלאמפ ללמוד דנדריטים Ca2 + איתות של דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות. שיטה זו מאפשרת ניטור של שניהם מקומי Ca2 + הגבהים עורר על ידי חשמל AP גירוי או backpropagating מקטעים דנדריטים, ואת התגובה סומאטית של התא. זה עושה את זה כלי מצוין ללמוד חלקים שונים איך בעץ הדנדריטי לשלב תשומות ולתקשר עם סומא. אבל בהינתן אורך הניסוי, תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם הבריאות תא על-ידי הגבלת השימוש של עוצמת ה...

התרומה של נוירון לפעילות הרשת נקבעת במידה רבה על ידי באופי הדינמי של הקלט סינפטית שהיא מקבלת. באופן מסורתי, השיטה הדומיננטית של אפיון פעילות סינפטיים בנוירונים הסתמך על תיקון שלם-תא הסומטית-קלאמפ הקלטות של זרמי postsynaptic עורר על ידי גירוי חשמלי של אקסונים של המעבר. עם זאת, הפעילות היחידה של הסינפסות ממוקם הציר הקרוב הוא דיווח בכנות במקרה הזה1. בנוסף, כדי להעריך את המנגנונים הספציפיים סינפסה, שימשו הקלטות זוגות נוירונים ומן דנדריטים במיקום ספציפי למטרה הסינפסות עניין ולפי המנגנון של אינטגרציה דנדריטים, בהתאמה. פריצת דרך בתחום הפיזיולוגיה סינפטית הושג באמצעות נישואים של טכניקות אופטי אלקטרופיזיולוגיות. סריקת מיקרוסקופ (2PLSM) בשילוב עם Ca2 + הדמיה וכלים optogenetic לייזר שני הפוטונים עירור עלול לחשוף פרטים עצומה של הארגון הדינאמי של פעילות סינפטית ספציפי חיבורים עצביים במוח פרוסות חוץ גופית ו ויוו.
מספר יתרונות מרכזיים שנעשו 2PLSM להתבלט מיקרוסקופ עירור קונבנציונאלי, פוטון אחד2: (1) בשל אופי לא לינארית של שני הפוטונים עירור, נוצר על ידי קרינה פלואורסצנטית רק באמצעי אחסון מוקד ולאחר כל הפוטונים הנפלטים מייצגים שימושי אותות (אין צורך חריר); (2) אורכי הגל, בשימוש 2PLSM, לחדור את הרקמה פיזור ביעילות רבה יותר; בנוסף, פוטונים מפוזר הם גם לדלל לייצר שני הפוטונים עירור, רקע זריחה; (3) נזקי phototoxicity מוגבלים גם למישור מוקד. לכן, למרות העלות הגבוהה של פוטון 2 מערכות בהשוואה מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי, נשאר 2PLSM שיטת הבחירה לחקירה ברזולוציה גבוהה של מבנה העצבית ותפקוד ברקמת החיים עבה.
היישום הראשון של 2PLSM ברקמות פיזור היתה תמונת המבנה והתפקוד של הדנדריטים3. 2PLSM בשילוב עם Ca2 + הדמיה חשפה שהפונקציה קוצים כמו תאים מבודדים הביוכימי. מאז בסוגי עצביים רבים יש התאמה של אחד לאחד בין קוצים בודדים הסינפסות4, שני הפוטונים Ca2 + הדמיה בקרוב הפך להיות כלי שימושי דיווח הפעילות של הפרט סינפסות רקמות ללא פגע5, 6,7,8. יתר על כן, Ca2 + דימות מבוסס 2PLSM שימש בהצלחה כדי לפקח על הפעילות של ערוצי סידן יחיד, יחסי גומלין לא לינארית conductances פנימי וסינפטית, כמו גם כדי להעריך את מצב פעילות ותלוי רגולציה של Ca2 + איתות דנדריטים עצביים5,6,7,8,9,10,11.
סידן הוא שליח השני תאיים בכל מקום, ייתכן האירגון subcellular קובע את הכיוון של תגובות פיזיולוגיות, מפני שינויים סינפטיים כוח ברגולציה של יון ערוצי, צמיחה דנדריט ועמוד השדרה, כמו כמו מוות של תאים, הישרדות. Ca דנדריטים2 + הגבהים להתרחש באמצעות הפעלה של נתיבים מרובים. פוטנציאל פעולה (APs), backpropagating אל דנדריטים, פתיחת ערוצי סידן ממותגת מתח12 ומפיקים יחסית הכללית Ca2 + תופעות מעבר (חתולים) דנדריטים, קוצים13. הסינאפסית מזוהה עם ההפעלה של Ca postsynaptic2 +-קולטנים חדיר (NMDA, Ca2 +-חדיר אמפא, kainate), מפעילה סינפטית חתולים14,6,15. לבסוף, ניתן להפיק supralinear Ca2 + אירועים של דנדריטים תחת מסוים התנאים11,12,13,16.
שני הפוטונים Ca2 + הדמיה בשילוב עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תיקון-קלאמפ מעסיקה Ca סינתטי2 +-אינדיקטורים פלורסנט רגיש, אשר מועברים בדרך כלל דרך האלקטרודה תיקון במהלך הקלטות שלם-תא . שיטה סטנדרטית על כימות של Ca2 + דינמיקה מבוסס על כביש17,שיטת מחוון כפול18. הוא משתמש fluorophores שני עם ספקטרום הפליטה מופרדים היטב (למשל, שילוב של אדום Ca2 +-צבע אטום עם ירוק Ca2 + אינדיקטורים, כגון אורגון הירוקה BAPTA-1 או Fluo-4) יש מספר יתרונות בהשוואה שיטת אינדיקציה יחידה. ראשית, Ca2 +-צבע רגישות משמש כדי לאתר מבנים קטנים עניין (סניפים דנדריטי ואת עמוד השדרה) שבו יבוצעו Ca2 + הדמיה. שנית, היחס בין שינוי ירוק ואדום קרינה פלואורסצנטית (ΔG/R) מחושבת כאמצעי של [Ca2 +], המהווה במידה רבה רגישות לשינויים בסיסית פלורסצנטיות עקב תנודות [Ca2 +]017 , 18. יתר על כן, התפקיד פלורסצנטיות השינויים מבחינת מוחלטת Ca2 + ריכוזים19.
דאגה כללית בעת הפעלת שני הפוטונים Ca2 + הדמיה ניסויים בפרוסות חריפה היא בריאות ויציבות של רכישת התמונה עקב עוצמת הלייזר גבוהה משמש בדרך כלל. בנוסף, Ca2 + ניסויים הדמיה, קיים חשש על ההפרעות, ניכר מופרזת של Ca subcellular2 + דינמיקה בשל העובדה כי Ca2 + מחוונים לשמש ניידים במיוחד אקסוגני Ca2 + מאגרים. לכן, הבחירה של מחוון Ca2 + והריכוז שלו תלוי על סוג עצביים, משרעת הצפויה של חתולים, השאלה ניסיוני.
שינינו את שיטת שני הפוטונים Ca2 + הדמיה עבור חקירת Ca2 + תנודות דנדריטים של GABAergic interneurons9,10,11,20,21 , 22. בעוד עיקר מוקדם Ca2 + הדמיה מחקרים נעשו בו נוירונים העיקרי, interneurons מעכבות להציג לראווה מגוון גדול של תפקודי Ca2 + מנגנונים נבדלים אלה תאים כפירמידה20 , 23 , 24. מנגנונים אלה interneuron ספציפיים (למשל, Ca2 + חדיר אמפא רצפטורים) עשוי לשחק תפקידים ספציפיים בוויסות פעילות התאים. בעוד דנדריטים Ca2 + איתות ב interneurons הוא מטרה מפתה לחקירה נוספת, שני הפוטונים Ca2 + דימות in דנדריטים של תאים אלה מציגה אתגרים נוספים, מ בקוטר דק יותר של דנדריטים וחוסר קוצים כדי גבוהה במיוחד אנדוגני Ca2 + מחייב קיבולת. כל תחומי המחקר שלנו המחקר של interneurons בהיפוקמפוס, פרוטוקול הבאות, בעוד החלים על אוכלוסיות עצביים שונים, הותאם להתמודד עם האתגרים הללו.
פרוטוקול זה הוצא להורג עם מיקרוסקופ שני הפוטונים מסחרי קונפוקלי, אשר מצויד עם גלאים חיצוניים, שאינם descanned שני (NDDs), אפנן אלקטרו-אופטיים (לבחירות) Dodt סריקת צבע ניגודיות (מפקדת הסטארגייט), מותקן על טבלת אופטי. המיקרוסקופ היה בשילוב עם Ti:Sapphire לייזר multiphoton במצב נעול ב 800 nm (> 3 W, 140 פעימות fs, 80 הרץ חזרה שער). מערכת ההדמייה היה מצויד מעטה אלקטרופיזיולוגיה רגיל, כולל תא זלוף עם בקרת טמפרטורה, פלטפורמה תרגום עם שני micromanipulators, מגבר microelectrode מבוקרת מחשב, של התקן דיגיטציה, גירוי היחידה, הנתונים רכישת התוכנה.

<table><tbody><tr><td>זן בעלי חיים: עכבר CD1</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 הידרוכלוריד</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי הפטהידראט</td> אבקת פרפורמלדהיד <td>230391</td><td></td><td>סיגמא-אולדריץ</td></tr>'<tr><td>, 95%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן גלוקונאט&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>בסיס טריזמה&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>טריזמה הידרוכלוריד&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט די-בסיסי דיהידרט&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td> נתרן פוספט מונו-בסיסי מונוהידרט&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>ביוציטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 הידרזיד</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (גבזין)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td> אדנוזין טריפוספט (ATP)-טריס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td> גואנוזין (GTP)-Na+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td> אורגון ירוק BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td> מלח פוספוקריאטין די(טריס)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-conjugated Alexa-546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td> תיקון נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>מכשירים דיוק עולמיים</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td> נימי זכוכית בורוסיליקט תטא</td> מכשיר <td>סאטר</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td> P-97 חולץ מיקרופיפטה בוער/חום</td> מכשיר <td>סאטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCS SP5 מיקרוסקופ מולטיפוטוני קונפוקלי</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> זיקית Ultra II Ti:לייזר רב-פוטוני ספיר&nbsp;</td>תוכנה <td>קוהרנטית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לרכישת הדמיה של LAS AF</td> בקר טמפרטורה <td>בקר טמפרטורה Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> מגבר MultiClamp 700B</td><td>התקנים</td><td></td><td></td> מולקולריים</tr><tr><td> Digidata 1440A Digitizer</td><td>התקנים</td><td></td><td></td> מולקולריים</tr><tr><td> קונפוקלי מתרגם</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרומניפולטור</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> pClamp תוכנה לרכישת נתונים</td><td>התקנים</td><td></td><td></td> מולקולריים</tr><tr><td> A365 מבודד גירוי זרם קבוע</td><td>מכשירים מדויקים</td><td></td><td></td> עולמיים</tr><tr><td> מערכות</td><td></td><td></td> <td>קינטיות</td> של שולחן אופטי Vibraplane</tr></tbody></table>

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

הדמיית סידן (Ca2 +) הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את הדינמיקה ייתכן של אותות תאיים2 + Ca בדנדריטים עצביים. Ca2 + תנודות יכול להתרחש באמצעות מגוון רחב של הממברנה, מנגנונים תאיים, לשחק תפקיד מכריע של אינדוקציה של פלסטיות סינפטית, ויסות דעתנית דנדריטים. מכאן, היכולת להקליט סוגים שונים של Ca2 + אותות בענפים דנדריטים הוא יקר עבור קבוצות לומדים איך דנדריטים לשלב מידע. כניסתו של מיקרוסקופ שני הפוטונים עשה מחקרים כאלה קל יותר באופן משמעותי על ידי פתרון הבעיות כדי הדמיה ברקמה חיה, כגון פיזור אור, נזקי. יתר על כן, באמצעות שילוב של שיטות אלקטרופיזיולוגיות קונבנציונאלי עם שני הפוטונים Ca2 + הדמיה, זה אפשרי לחקור המקומי Ca2 + תנודות דנדריטים עצביים במקביל עם הקלטות של פעילות סינפטית סומה. כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד את הדינמיקה של רשות מקומית2 + תופעות מעבר (חתולים) בדנדריטים של GABAergic interneurons מעכבות. השיטה ניתן להחיל גם ללמוד דנדריטים Ca2 + איתות סוגים עצביים במוח חריפה פרוסות.

באמצעות פרוטוקול המובאת כאן, השגנו חתולים עורר סומאטית נוכחי הזרקת ועל ידי גירוי חשמלי של דנדריטים של oriens/alveus interneurons באזור CA1 של ההיפוקמפוס. לאחר תיקון נוירון, מזוהה המבוסס על הצורה והמיקום שלה, השגנו linescans על פני דנדריט הפרוקסימלית נקודות מרובות-נתן מרחקים סומא (איור 1 א'). . הבחנו בירידה משרעת של חתולים שנגזרות backpropagating APs כמו המרחק בין סומא מוגברת (מצביע על כך משרעת AP מופחתת או ירידה מרחק תלויי סידן ערוץ הפצה, <strong class="xfig"...

אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca2 + שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור עליות סידן בדנדריטים עצביים בתגובה לפרדיגמות גירוי שונות באמצעות הקלטות טלאי-מהדק של תאים שלמים בסומה עצבית במקביל להדמיית סידן דו-פוטונית בדנדריטים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנטר איתות סידן בתאים דנדריטיים קטנים, מה שמאפשר התבוננות מקרוב בתהליכים המתרחשים בענפים דנדריטיים במהלך אינטגרציה של כניסות סינפטיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לצפות בדפוסי איתות סידן ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה ובספציפיות.הנח את מוח העכבר על צלחת פטרי המכילה סוכרוז ACSF מחומצן וקר באופן רציף. כדי להכין פרוסות היפוקמפוס מהמוח שחולץ, תנו למוח להתקרר במשך כשתי דקות. לאחר מכן, הניחו פיסת נייר סינון על צלחת פטרי עמוסה בקרח, והעבירו את המוח על נייר הסינון.לאחר מכן, נתחו את המוח לשתי המיספרות. הדביקו את חצאי הכדור המנותחים על פלטפורמת חיתוך ויברטום, וטבלו אותה במגש החיתוך המלא בסוכרוז ACSF מחומצן קר כקרח. לאחר מכן, חתכו פרוסות בעובי 300 מיקרומטר במעלה אחת צלזיוס באמצעות מקרר ויברטום או הנחת הקרח סביב מגש הוויברטום.בעזרת מברשת צבע, העבירו את הפרוסות המכילות את ההיפוקמפוס לאמבט של התאוששות ACSF מחומצן שחומם ל-37 מעלות צלזיוס. בשלב זה, העבירו פרוסת היפוקמפוס לאמבטיה תחת המטרה של מיקרוסקופ דו-פוטוני הסורק בלייזר. יש להחדיר את האמבטיה ברציפות עם ACSF מחומצן.לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות אינפרא אדום כדי לאתר תא מעניין באמצעות גודלו, צורתו ומיקומו. לאחר מכן, מלאו פיפטה מגרה בתמיסה רגילה ACSF המכילה את הפלואורופור האדום. הורד אותו על גבי הפרוסה כך שהקצה יהיה באותו אזור כמו התא המבוקש.לאחר מכן, מלאו את פיפטת התיקון בתמיסת תיקון, והצמידו אותה לשלב הראש. הנח אותו מעל הפרוסה כך שהקצה שלו יהיה ישירות מעל התא המבוקש. לאחר מכן, הכנס מזרק לתא העצירה התלת-כיווני, וחבר אותו לפיפטה התיקון דרך צינור פלסטיק.הזרקו לחץ חיובי קבוע לתוך פיפטת התיקון, ושמרו על תא העצירה במצב קרוב. לאחר מכן, פתח את MultiClamp ampמודול תוכנת בקרת מגבר, ועבור למתח Clamp מצב על ידי לחיצה על כפתור VC. פתח את תוכנת רכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיה Clampex להקלטת אותות אלקטרופיזיולוגיים, ולחץ על סמל בדיקת הממברנה כדי לשלוח דופק מתח מרובע קבוע לניטור שינויים בהתנגדות הפיפטה.כעת, הורידו את פיפטת התיקון עד שהיא נמצאת ממש על גבי התא הממוקד. עם יצירת מגע עם קרום התא, הסר את הלחץ על ידי סיבוב תא העצירה למצב פתוח. לאחר מכן, הפעל לחץ שלילי קל על פיפטת התיקון באמצעות מזרק ריק המותקן בתא העצירה עד שהתנגדות הפיפטה מגיעה לג'יגה-אוהם אחד.בחלון בדיקת הממברנה של תוכנת רכישת הנתונים, מהדק את התא ב-60 מילי-וולט שלילי. המשך להפעיל לחץ שלילי עד שהתנגדות הפיפטה יורדת ותושג תצורת התא השלם. במודול תוכנת בקרת המגבר MultiClamp, הגדר את תצורת התיקון לזרם clamp על ידי לחיצה על כפתור ה-IC, ורשום את מאפייני הממברנה בתגובה להזרקות סומטיות של זרמי היפרפולריזציה ודפולריזציה.המתן לפחות 30 דקות עד שהתא יתמלא במחוונים הקיימים בתמיסת התיקון. כדי להשיג תמונות, אתר דנדריט מעניין באמצעות אות הקרינה האדום. הבטח תגובה גלויה על ידי בחירת דנדריט פרוקסימלי קצר מ-50 מיקרומטר, שכן היעילות של התפשטות לאחור של AP עשויה לרדת משמעותית עם המרחק באינטרנוירונים GABAergic, ולעבור למצב xt.עם בקרי עוצמת הלייזר, הגדר את הלייזר הדו-פוטוני ברמת הספק מינימלית שבה הקרינה הירוקה הבסיסית נראית רק מעט, כדי למנוע פוטוטוקסיות. לאחר מכן, בתוכנת רכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים של Clampex חלון פרוטוקול ותוכנת רכישת תמונה, צור ניסוי הקלטה של משך הזמן הרצוי המכיל הזרקת זרם סומטי של המשרעת הרצויה. לאחר מכן, לחץ על כפתור התחל הקלטה, ורכוש את הקרינה ברציפות למשך שנייה עד שתיים.חזור על רכישת התמונה שלוש עד 10 פעמים. המתן לפחות 30 שניות בין סריקות בודדות כדי למנוע נזק לאור. כדי לתעד מעברי סידן דנדריטיים המושרים על ידי גירוי חשמלי, אתר דנדריט מעניין באמצעות אות הקרינה האדום.הניחו את הפיפטה המגרה על פני הפרוסה מעל הדנדריט המעניין. הורד לאט את פיפטת הגירוי 10 עד 15 מיקרומטר מהדנדריט ומזער את התנועה כדי למנוע הפרעה לתצורת התא השלם. כדי לדמיין את מיקומם של מיקרו-דומיינים סינפטיים בנוירונים אספיניים, בתוכנת רכישת התמונה, עבור למצב xt ומקם את הקו לאורך הענף הדנדריטי המבוקש.בחלון הפרוטוקול, צור ניסיון הקלטה שמפעיל את הגירוי. באמצעות תוכנת הרכישה, סרוק לאורך הדנדריט ברציפות למשך שנייה עד שתיים. חזור על הרכישה שלוש עד חמש פעמים, המתן 30 שניות בין סריקות כדי למנוע נזק לאור.כדי לקבל מידע ראשוני על המורפולוגיה של התא ולשמור תיעוד של מיקום פיפטת הגירוי, רכשו מחסנית Z של התא בתעלה האדומה. באמצעות תוכנת הרכישה במצב xyz, הגדר את גבולות הערימה העליונים והתחתונים כדי לדמות את התא כולו עם כל התהליכים הכלולים. לאחר מכן, הגדר את גודל הצעד למיקרומטר אחד, והתחל את רכישת המחסנית באמצעות כפתור התחל הקלטה.לאחר השלמת רכישת Z-stack, השתמש באפשרות ההקרנה המקסימלית בתוכנה כדי להניח את כל תוכניות המוקד של המחסנית ולאמת את איכות הרכישה. לאחר מכן, משוך לאט את פיפטת התיקון מהפרוסה. כדי לקבע את הפרוסה לזיהוי מורפולוגי לאחר הוק, הוציאו במהירות את הפרוסה מהאמבטיה בעזרת מברשת צבע, והניחו אותה בין שני ניירות סינון בצלחת פטרי מלאה ב-ACSF.החלף את ACSF בתמיסת פרפורמלדהיד של 4%, והשאיר את המנה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. באיור זה, ההקרנה המקסימלית של ערימת Z של שני פוטונים מציגה אינטרנוירון טלאי מלא באלקסה-594. ראשי חץ לבנים מצביעים על מיקומם של מסופים אקסונליים בתוך השכבה הפירמידלית, מה שמרמז על כך שהנוירון הפנימי הוא תא סל.איור זה מראה את הענף הדנדריטי שלידו הוצבה האלקטרודה המגרה. הקו המקווקו מציג את המיקום של סריקת הקו. התמונות כאן ממחישות את התוצאה של סריקת קווים בערוצים האדומים והירוקים.העלייה בפלואורסצנטיות הירוקה בזמן הגירוי מעידה על עלייה בריכוז הסידן באזור זה. ניתן לחלק את התמונות למקטעים קטנים יותר, מה שמאפשר לנתח את התפשטות התגובה. העקבות הנראים כאן מראים את מעברי הסידן שנוצרו במקטעים שונים בתגובה לגירוי חשמלי שנרשם ברמה הסומטית במהלך ניסוי ההדמיה.המשרעת של ארעי הסידן יורדת עם המרחק מהנקודה החמה המרכזית, מה שמצביע על כך שהתגובה היא מקומית מרחבית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית צבע רגישה למתח או אופטוגנטיקה על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו שינויים מקומיים בפוטנציאל הזיכרון בתוך ענפים דנדריטיים או שילוב של כניסות ספציפיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנטר תנודות סידן תלויות פעילות בדנדריטים עצביים באמצעות שילוב של טכניקות אופטופיזיולוגיות, שיהיו שימושיות לחקור את המורכבויות של אינטגרציה ופלסטיות של קלט דנדריטי.

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד.

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

פעילות ספונטנית של פיתוח רשתות נוירונים ניתן למדוד באמצעות AM-אסתר צורות של סידן רגיש צבעים אינדיקטור. שינויים סידן תוך תאי, המציין ההפעלה העצבית, מזוהים כמו שינויים חולפות הקרינה אינדיקטור עם אחד או שני פוטונים הדמיה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאמים עבור מגוון של רשתות נוירונים התפתחותית...

סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים

בפרוטוקול זה, אנו מעדכנים את ההתקדמות האחרונה בתחום ההדמיה...

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

טכניקת הדמיה למעקב אחר שינויים אפשריים בממברנה עם רזולוצית המשנה מיקרומטר מרחבית ותת זמנית האלפית השנייה מתוארת. הטכניקה, המבוססת על ליזר עירור של צבעי מתח רגישים, מאפשרת מדידות של אותות באקסונים וטחונות האקסון, סניפי מסוף דנדריטיים, וקוצים הדנדריטים בודדים.

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

סרטון זה מדגים פרוטוקול לרישום מהדק טלאי של תא שלם והדמיית סידן של שני פוטונים בפרוסות בהיפוקמפוס במוח. שיטה זו מאפשרת ללמוד את הדינמיקה של Ca2+ transients המקומי (CaTs) בדנדריטים של סוגים עצביים שונים בפרוסות מוח חריפות.

יצירת תצורה של תאים שלמים להדמיית סידן דו-פוטון של פרוסות מוח

מתוארים נהלים לביצוע הקלטות בו זמנית של פוטנציאל הממברנה או זרם ושינויים בריכוז הסידן התוך תאי. נוירוני גרעין סופרכיאזמטיים ממולאים במחוון הסידן ביס-פורה-2 באמצעות אלקטרודת מהדק טלאי בכל תצורת מהדק התיקון של התא.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

הדמיית זמן-lapse בבעל חיים חי מספקת מידע רב ערך על ארגון מחדש מבני במוח השלם. כאן, אנו מציגים תכשיר גולגולת דק המאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית של מבנים סינפטיים בעלי תווית פלואורסצנטית בקליפת העכבר החי על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

אנו מתארים את השילוב של תמונה-הפעלה מושרה UV מוקד של תרכובות נוירו פעיל עם כל תא תיקון מהדק והדמיה רב פוטון של עוברי נתרן תאיים בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב בהיפוקמפוס בחתכי רקמה חריפים של מוח העכבר.

רב פוטון תאית נתרן הדמיה בשילוב עם משחרר רפרוף מיקוד בתיווך UV של גלוטמט בCA1 פירמידת נוירונים

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

למד שיטה לניטור תנודות סידן בדנדריטים עצביים באמצעות הדמיית סידן בשני פוטונים בשילוב עם רישומי פאץ'-קלאמפ. טכניקה זו מאפשרת תצפית ברזולוציה גבוהה של אותות סידן במחלקות דנדריטיות קטנות במוח עכברים.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

גלה סרטונים נוספים