שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca^{2 +} שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור עליות סידן בדנדריטים עצביים בתגובה לפרדיגמות גירוי שונות באמצעות הקלטות טלאי-מהדק של תאים שלמים בסומה עצבית במקביל להדמיית סידן דו-פוטונית בדנדריטים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנטר איתות סידן בתאים דנדריטיים קטנים, מה שמאפשר התבוננות מקרוב בתהליכים המתרחשים בענפים דנדריטיים במהלך אינטגרציה של כניסות סינפטיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לצפות בדפוסי איתות סידן ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה ובספציפיות.

הנח את מוח העכבר על צלחת פטרי המכילה סוכרוז ACSF מחומצן וקר באופן רציף. כדי להכין פרוסות היפוקמפוס מהמוח שחולץ, תנו למוח להתקרר במשך כשתי דקות. לאחר מכן, הניחו פיסת נייר סינון על צלחת פטרי עמוסה בקרח, והעבירו את המוח על נייר הסינון.

לאחר מכן, נתחו את המוח לשתי המיספרות. הדביקו את חצאי הכדור המנותחים על פלטפורמת חיתוך ויברטום, וטבלו אותה במגש החיתוך המלא בסוכרוז ACSF מחומצן קר כקרח. לאחר מכן, חתכו פרוסות בעובי 300 מיקרומטר במעלה אחת צלזיוס באמצעות מקרר ויברטום או הנחת הקרח סביב מגש הוויברטום.

בעזרת מברשת צבע, העבירו את הפרוסות המכילות את ההיפוקמפוס לאמבט של התאוששות ACSF מחומצן שחומם ל-37 מעלות צלזיוס. בשלב זה, העבירו פרוסת היפוקמפוס לאמבטיה תחת המטרה של מיקרוסקופ דו-פוטוני הסורק בלייזר. יש להחדיר את האמבטיה ברציפות עם ACSF מחומצן.

לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות אינפרא אדום כדי לאתר תא מעניין באמצעות גודלו, צורתו ומיקומו. לאחר מכן, מלאו פיפטה מגרה בתמיסה רגילה ACSF המכילה את הפלואורופור האדום. הורד אותו על גבי הפרוסה כך שהקצה יהיה באותו אזור כמו התא המבוקש.

לאחר מכן, מלאו את פיפטת התיקון בתמיסת תיקון, והצמידו אותה לשלב הראש. הנח אותו מעל הפרוסה כך שהקצה שלו יהיה ישירות מעל התא המבוקש. לאחר מכן, הכנס מזרק לתא העצירה התלת-כיווני, וחבר אותו לפיפטה התיקון דרך צינור פלסטיק.

הזרקו לחץ חיובי קבוע לתוך פיפטת התיקון, ושמרו על תא העצירה במצב קרוב. לאחר מכן, פתח את MultiClamp ampמודול תוכנת בקרת מגבר, ועבור למתח Clamp מצב על ידי לחיצה על כפתור VC. פתח את תוכנת רכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיה Clampex להקלטת אותות אלקטרופיזיולוגיים, ולחץ על סמל בדיקת הממברנה כדי לשלוח דופק מתח מרובע קבוע לניטור שינויים בהתנגדות הפיפטה.

כעת, הורידו את פיפטת התיקון עד שהיא נמצאת ממש על גבי התא הממוקד. עם יצירת מגע עם קרום התא, הסר את הלחץ על ידי סיבוב תא העצירה למצב פתוח. לאחר מכן, הפעל לחץ שלילי קל על פיפטת התיקון באמצעות מזרק ריק המותקן בתא העצירה עד שהתנגדות הפיפטה מגיעה לג'יגה-אוהם אחד.

בחלון בדיקת הממברנה של תוכנת רכישת הנתונים, מהדק את התא ב-60 מילי-וולט שלילי. המשך להפעיל לחץ שלילי עד שהתנגדות הפיפטה יורדת ותושג תצורת התא השלם. במודול תוכנת בקרת המגבר MultiClamp, הגדר את תצורת התיקון לזרם clamp על ידי לחיצה על כפתור ה-IC, ורשום את מאפייני הממברנה בתגובה להזרקות סומטיות של זרמי היפרפולריזציה ודפולריזציה.

המתן לפחות 30 דקות עד שהתא יתמלא במחוונים הקיימים בתמיסת התיקון. כדי להשיג תמונות, אתר דנדריט מעניין באמצעות אות הקרינה האדום. הבטח תגובה גלויה על ידי בחירת דנדריט פרוקסימלי קצר מ-50 מיקרומטר, שכן היעילות של התפשטות לאחור של AP עשויה לרדת משמעותית עם המרחק באינטרנוירונים GABAergic, ולעבור למצב xt.

עם בקרי עוצמת הלייזר, הגדר את הלייזר הדו-פוטוני ברמת הספק מינימלית שבה הקרינה הירוקה הבסיסית נראית רק מעט, כדי למנוע פוטוטוקסיות. לאחר מכן, בתוכנת רכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים של Clampex חלון פרוטוקול ותוכנת רכישת תמונה, צור ניסוי הקלטה של משך הזמן הרצוי המכיל הזרקת זרם סומטי של המשרעת הרצויה. לאחר מכן, לחץ על כפתור התחל הקלטה, ורכוש את הקרינה ברציפות למשך שנייה עד שתיים.

חזור על רכישת התמונה שלוש עד 10 פעמים. המתן לפחות 30 שניות בין סריקות בודדות כדי למנוע נזק לאור. כדי לתעד מעברי סידן דנדריטיים המושרים על ידי גירוי חשמלי, אתר דנדריט מעניין באמצעות אות הקרינה האדום.

הניחו את הפיפטה המגרה על פני הפרוסה מעל הדנדריט המעניין. הורד לאט את פיפטת הגירוי 10 עד 15 מיקרומטר מהדנדריט ומזער את התנועה כדי למנוע הפרעה לתצורת התא השלם. כדי לדמיין את מיקומם של מיקרו-דומיינים סינפטיים בנוירונים אספיניים, בתוכנת רכישת התמונה, עבור למצב xt ומקם את הקו לאורך הענף הדנדריטי המבוקש.

בחלון הפרוטוקול, צור ניסיון הקלטה שמפעיל את הגירוי. באמצעות תוכנת הרכישה, סרוק לאורך הדנדריט ברציפות למשך שנייה עד שתיים. חזור על הרכישה שלוש עד חמש פעמים, המתן 30 שניות בין סריקות כדי למנוע נזק לאור.

כדי לקבל מידע ראשוני על המורפולוגיה של התא ולשמור תיעוד של מיקום פיפטת הגירוי, רכשו מחסנית Z של התא בתעלה האדומה. באמצעות תוכנת הרכישה במצב xyz, הגדר את גבולות הערימה העליונים והתחתונים כדי לדמות את התא כולו עם כל התהליכים הכלולים. לאחר מכן, הגדר את גודל הצעד למיקרומטר אחד, והתחל את רכישת המחסנית באמצעות כפתור התחל הקלטה.

לאחר השלמת רכישת Z-stack, השתמש באפשרות ההקרנה המקסימלית בתוכנה כדי להניח את כל תוכניות המוקד של המחסנית ולאמת את איכות הרכישה. לאחר מכן, משוך לאט את פיפטת התיקון מהפרוסה. כדי לקבע את הפרוסה לזיהוי מורפולוגי לאחר הוק, הוציאו במהירות את הפרוסה מהאמבטיה בעזרת מברשת צבע, והניחו אותה בין שני ניירות סינון בצלחת פטרי מלאה ב-ACSF.

החלף את ACSF בתמיסת פרפורמלדהיד של 4%, והשאיר את המנה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. באיור זה, ההקרנה המקסימלית של ערימת Z של שני פוטונים מציגה אינטרנוירון טלאי מלא באלקסה-594. ראשי חץ לבנים מצביעים על מיקומם של מסופים אקסונליים בתוך השכבה הפירמידלית, מה שמרמז על כך שהנוירון הפנימי הוא תא סל.

איור זה מראה את הענף הדנדריטי שלידו הוצבה האלקטרודה המגרה. הקו המקווקו מציג את המיקום של סריקת הקו. התמונות כאן ממחישות את התוצאה של סריקת קווים בערוצים האדומים והירוקים.

העלייה בפלואורסצנטיות הירוקה בזמן הגירוי מעידה על עלייה בריכוז הסידן באזור זה. ניתן לחלק את התמונות למקטעים קטנים יותר, מה שמאפשר לנתח את התפשטות התגובה. העקבות הנראים כאן מראים את מעברי הסידן שנוצרו במקטעים שונים בתגובה לגירוי חשמלי שנרשם ברמה הסומטית במהלך ניסוי ההדמיה.

המשרעת של ארעי הסידן יורדת עם המרחק מהנקודה החמה המרכזית, מה שמצביע על כך שהתגובה היא מקומית מרחבית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית צבע רגישה למתח או אופטוגנטיקה על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו שינויים מקומיים בפוטנציאל הזיכרון בתוך ענפים דנדריטיים או שילוב של כניסות ספציפיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנטר תנודות סידן תלויות פעילות בדנדריטים עצביים באמצעות שילוב של טכניקות אופטופיזיולוגיות, שיהיו שימושיות לחקור את המורכבויות של אינטגרציה ופלסטיות של קלט דנדריטי.