מדידה כמותית של חלבונים וγ Secretase-בתיווך קודמן עמילואיד, המחשוף דרגה ב מבוססת תא לוציפראז כתב Assay פלטפורמות

יש לנו בהצלחה שנוצר שני מבחני המצע ספציפיים γ-secretase. שני מבחני מבוססת תא המובאת כאן נועדו לכמת פעילויות אנזימטיות γ-secretase דרך הפלט של גחלילית לוציפראז כתבים.

המטרה הכוללת של בדיקת גן מדווח כמותית מבוססת תאים עבור גמא-סקרטאז היא לבחון את ההשפעה הדיפרנציאלית של מאפנני גמא-סקרטאז משוערים על מחשוף בתיווך גמא-סקרטאז. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלת האלצהיימר, כגון זיהוי מודולטורים חדשים של גמא-סקרטאז לטיפול במחלת אלצהיימר. היתרון בטכניקה זו הוא שמדובר במערכת בדיקה יעילה ביותר, והיא יכולה לזהות בקלות מאפנני גמא-סקרטאז.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלת אלצהיימר באמצעות גילוי פוטנציאלי של תרופות נגד אלצהיימר עם תופעות לוואי מינימליות. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי סלקטיביות הסובסטרט של גמא-סקרטאז. ניתן ליישם אותו גם במחקרים של מחלות אחרות, כגון נוירובלסטומה.

אדם חדש בשיטה זו עלול להיאבק בהסרה זהירה והוספת אמצעי תרבית תאים ל-96 מיקרו-פלטה, מכיוון שהפרעה רבה מדי עלולה לסבך את התוצאות הסופיות. התחל הליך זה בהכנת תאי NG ו-CG, כפי שמוזכר בפרוטוקול הטקסט. ספרו תאי NG או CG בעזרת המוציטומטר.

לאחר מכן, זרעו את התאים ב-20,000 תאים לבאר על מיקרו-לוחות של 96 בארות בנפח סופי של 200 מיקרוליטר לבאר במצע הגידול. העבירו את המיקרו-צלחות לחממת פחמן דו חמצני לחות, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה של הלילה, הסר 100 מיקרוליטר של מצע גידול מכל באר.

הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של מצע גידול המכיל שני מיקרוגרם למיליליטר של טטרציקלין עם 0.2% דימתיל סולפוקסיד, שני מיקרו-מולרי CL-387, 785, שני DPT מיקרומולרי, או מעכבי ErbB1/ErbB2 קשורים אחרים. דגרו על התאים המטופלים והמיקרו-פלטות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, הסר 150 מיקרוליטר לבאר של מצע גידול מהמיקרו-פלטות.

לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר לבאר של מגיב לבדיקת לוציפראז. לאחר מכן, העבירו את המיקרו-לוחות לקורא מיקרו-פלטות זוהר, ושמרו אותם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. קבע את הזוהר הנפלט מלוציפראז באמצעות תוכנית מוגדרת מראש המאוחסנת בקורא המיקרו-לוחות הזוהר.

ראשית, פתח את תוכנת בקרת המכשירים. לאחר מכן, מתפריט הכלי, בחר Luminometry. תחת ההגדרה פרמטרים, בחר ללא מסנן עבור מסנן פליטה, סמן רגיל עבור צמצם פליטה, הזן אחד לספירת זמן ולחץ על אישור כדי להגדיר את קריאת הזוהר.

תחת הכרטיסייה בקרת מכשירים, גלול ברשימת הפרוטוקולים הפעילים ובחר את הפרוטוקול המאוחסן מראש לקריאת זוהר. תחת הכרטיסייה תצוגה חיה, הגדר את קנה המידה מהתפריט הנפתח ובחר לוגריתם או ליניארי עבור הסוג. תחת הכרטיסייה טמפרטורה, בחר כבוי לחימום צלחת.

לבסוף, לחץ על התחלה כפתור לביצוע קריאת הזוהר. ייצא את התוצאות לפורמט גיליון אלקטרוני באמצעות הסייר המוטמע בתוכנת הבקרה. הערכת זוהר הרקע מתאי CG או NG שטופלו במצע גידול שאינו כולל טטרציקלין.

הגדר אות זוהר הנפלט על ידי תאי CG או NG שטופלו ב-0.1% DMSO במדיום גידול המכיל מיקרוגרם אחד למיליליטר טטרציקלין בלבד כ-100% פעילות גמא-סקרטאז יחסית. לבסוף, לנרמל אותות לוציפראז מתאי CG או NG המתורבתים עם מצע גידול המכיל טטרציקלין ו-CL-387, 785 או DAPT לאות הלוציפראז הנפלט מתאי CG או NG שטופלו ב-DMSO. מוצגות כאן תוצאות מייצגות המדגימות את המדידות הכמותיות של מחשוף גמא-סקרטאז של APP-C99 בתאי ה-CG.

התאים טופלו במיקרוטולר אחד של CL-387, 785 או DAPT בנוכחות מיקרוגרם אחד למיליליטר טטרציקלין ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. הזוהר שמקורו בפרוטאוליזה בתיווך גמא-סקרטאז של C99-GV כומת לאחר תוספת של 100 מיקרוליטר לבאר של מגיב בדיקת לוציפראז. אות הלוציפראז הנפלט על ידי תאים שטופלו ברכב בלבד נקבע כ-100% זוהר יחסי.

תוצאות מייצגות המדגימות את המדידות הכמותיות של מחשוף גמא-סקרטאז של N-delta-E בתאי ה-NG מוצגות כאן. באופן דומה, התאים טופלו במיקרו-טולר אחד של CL-387, 785 או DAPT בנוכחות מיקרוגרם אחד למיליליטר טטרציקלין ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. הזוהר שמקורו בפרוטאוליזה בתיווך גמא-סקרטאז של N-delta-E-GV כומת לאחר תוספת של 100 מיקרוליטר לבאר של מגיב בדיקת לוציפראז.

אות הלוציפראז הנפלט על ידי תאים שטופלו ברכב בלבד נקבע כ-100% זוהר יחסי. לאחר השליטה, טכניקה זו דורשת רק זמן מעשי של שעה עד שעתיים, בהמתנה למספר התרכובות לבדיקה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקר בתחום מחלת האלצהיימר לחקור את השינוי הגנטי והכימי של גמא-סקרטאז במרדף אחר טיפולים חדשים למחלת אלצהיימר.