Name: מדידה כמותית של חלבונים וγ Secretase-בתיווך קודמן עמילואיד, המחשוף דרגה ב מבוססת תא לוציפראז כתב Assay פלטפורמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: למד שיטת מדידה כמותית לפעילות γ-secretase בתאים באמצעות דיווח לוציפראז. שיטה זו מאפשרת זיהוי מסננים חדשים לטיפול במחלת אלצהיימר וחקר סלקטיביות רצפים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים המתקן הליבה של המכון של הסלולר, ביולוגיה אורגניזם, אקדמיה Sinica, על תמיכה טכנית. מחקר זה נתמך על ידי משרד המדע, הטכנולוגיה, טייוואן (ביותר 103-2320-B-001-016-MY3 עד י'-F. ל'), התוכנית לחדשנות Translational ההתפתחות ביולוגיות – טכנולוגיית התומכת פלטפורמה ציר ערכת (NP7 ל י'-F.L.), ו Sinica אקדמיה (לי'-F.L.).

1. מדידה של אותות כתב לוציפראז, אשר תואמות את המחשוף γ-Secretase של APP-C99 או NΔE
הערה: נא עיין על פרסומים קודמים על תיאורים מפורטים של הדור של CG ו NG תאים20,21.
<ol><li>
זרע תאים NG או CG (20, 000 תאים/טוב) על גבי microplates 96-ובכן-נפח סופי של 200 μL היטב במדיום הגידול המורכבת בינוני נשר שונה (DMEM) בתוספת 10% עוברית שור סרום של Dulbecco (FBS), blasticidin 5 μg/mL, אנטיביוטיקה μg/mL 250 (למשל zeocin), ואת μg/mL 200 hygromycin B.
	<ol>
<li>ספירת תאים hemocytometer.</li>
		<li>להעביר את microplates חממה2 CO humidified, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר μL 100 של מדיום הגידול מכל קידוח.</li>
	<li>להוסיף 100 μL/טוב של הצמיחה בינונית המכילה טטרציקלין μg/mL 2 עם או 0.2% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) או אחרים הקשורים מעכבי ErbB1/ErbB2.</li>
	<li>דגירה תאים CG או NG שטופלו ב- microplates ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>הסר 150 מדיום הגידול μL/טוב microplates.</li>
	<li>הוספת ריאגנט assay לוציפראז μL/טוב 50 (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>
להעביר את microplates קורא microplate הפריה חוץ גופית.
	<ol>
<li>לשמור את microplates בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות עם עצבנות עדין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לקבוע את גחלילית לוציפראז (פל)-הנפלטים הפריה חוץ גופית באמצעות תוכנית מוגדרת מראש מאוחסנים לקורא microplate הפריה חוץ גופית.
	<ol>
<li>פתח את תוכנת בקרת מכשיר (ראה טבלה של חומרים לפרטים כלי).</li>
		<li>מתפריט 'כלי', בחר 'Luminometry'.<ol>
<li>תחת ההגדרות 'פרמטרים', בחר מסנן' מסנן פליטה ' טיק 'רגיל' ' צמצם פליטה, נכנסים '1' עבור ספירת הזמן, לחץ על 'אישור' כדי להגדיר את קריאת הארה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>תחת הכרטיסיה 'כלי בקרה', גלול לאורך הרשימה של פרוטוקולים פעילים ובחר פרוטוקול מראש מאוחסנות עבור קריאת הפריה חוץ גופית.</li>
		<li>תחת לשונית 'חיים תצוגה', להגדיר את קנה המידה מתוך הרשימה הנפתח ובחר 'לוגריתם' או 'לינארית' עבור הסוג.</li>
		<li>תחת לשונית 'חום', בחרו 'Off' ' צלחת חימום.</li>
		<li>לחץ על לחצן 'התחל' כדי לבצע הפריה חוץ גופית את הקריאה.</li>
		<li>לפי הצורך, ייצוא תוצאות לתוך תבנית גיליון אלקטרוני באמצעות 'סייר' מוטבע בתוך תוכנת שליטה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. כימות של פעילות וγ-Secretase
<ol><li>
הגדר אות הפריה חוץ גופית הנפלטת CG או תאים NG שטופלו דימתיל סולפוקסיד 0.1% במדיום גידול המכילה טטרציקלין μg/mL 1 לבד כפעילות γ יחסית-secretase 100%.
	<ol>
<li>מעריכים רקע לומינסנציה מתאי CG או NG על ידי טיפול תאים עם מדיום הגידול שאינו כולל טטרציקלין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנרמל לוציפראז אותות התאים CG או NG מתורבתים עם מדיום הגידול המכילה טטרציקלין μg/mL 1 ו μM CL-387,785 או 1 או 1 μM של DAPT עם האות לוציפראז הנפלטת דימתיל סולפוקסיד שטופלו CG או NG תאים (100% וγ יחסית-secretase פעילות, כמו מוגדרות ב- 2.1.)</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease+at+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li>
<li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/18/3157">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li>
<li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer%27s+disease%3A+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li>
<li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+strategies+for+disease+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li>
<li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer%27s+disease%3A+regulation%2C+cell+biology%2C+function%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li>
<li>Parks, A. L., Curtis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+diversifies+its+portfolio%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Presenilin diversifies its portfolio.</a> Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).</li>
<li>Kukar, T. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18548070">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li>
<li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li>
<li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li>
<li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li>
<li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li>
<li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+substrates+of+presenilin%2Fgamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li>
<li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163%2C+a+Potent%2C+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li>
<li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+%28GSI-953%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li>
<li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15(2008).</li>
<li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).</li>
<li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+small+molecular+%28D%29-leucinamides+as+potent%2C+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li>
<li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha%2C+interleukin-1beta%2C+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li>
<li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li>
<li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li>
<li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li>
<li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li>
<li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li>
<li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer%27s+Disease+Patients%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מבטיח תוצאות ממשפט בשלב 1b של חיסוני aducanumab עבור לספירה הקימו בחוזקה את תפקיד קריטי Aβ בפתוגנזה של המודעה22 ולהציע כי גישות אנטי-Aβ הם עדיין אסטרטגיה קיימא עבור הפיתוח של תרופות אנטי-לספירה. כאן, אנו מתארים מבוססת תא מבחני לכימות תנועת proteolysis γ-secretase-מזורז של APP-C99 ו- NΔE שימוש גחלילית לוציפראז כתב במערכות. APP-C99 ו- NΔE סובסטרטים γ-secretase ביותר למד היטב שני, ביחד מייצגים שתי הפעילויות פתוגניים, פיזיולוגיים של γ-secretase13. הממצאים שלנו כי downregulation...

צורות oligomeric של עמילואיד-β (Aβ) מאמינים כי הגורם העיקרי הקשורים ניוון מוחיים במוחם של חולים הסובלים מחלת אלצהיימר (AD)1. Aβ פפטידים מופקים על ידי המחשוף stepwise של חלבון עמילואיד קודמן (APP), תחילה לפי β-secretase ולאחר מכן ב- γ-secretase2. בעשור האחרון, גישות טיפוליות כלפי הטיפול של המודעה התמקדו למניעת ייצור Aβ3. הרוב המכריע של המחקרים התמקדו גם הגדלת הפעילות α-secretase, אשר ניתן למנוע γ-secretase המחשוף של APP, ובכך להקטין את הייצור של Aβ, או עיכוב של פעילויות β-ו/או γ-secretase4. למרבה הצער, לא בררניים עיכוב של β - או γ-secretases תוצאות תופעות לוואי בלתי נמנע כי הם עקב הפרעה תפקוד אחרים סובסטרטים פיזיולוגיים של β - ו γ-secretase5,6. לגבי מעכבי γ-secretase, מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על הגילוי של מספר מאפננים כימי, גנטיים המווסתים Aβ הייצור תוך הפעלת אפקטים זניח על עיבוד וγ secretase-בתיווך חיוני חריץ7 ,8,9,10,11,12, עם זאת, הרפוי מוצלחת עדיין לא פותחו. לפיכך, בהמשך מסכי שיטתית הן מוצדקת לגלות מכפילי גנטי וכימיים הרומן זה באופן סלקטיבי יכול לווסת את עיבוד APP וγ secretase-בתיווך.
Γ-Secretase ידוע קליב יותר מ-90 חלבונים שונים המעוגנת ממברנה. בין אלה סובסטרטים הוא חריץ, שפעילותם היא קריטית עבור תא בנחישות גורל ובידול במהלך פיתוח13. באופן סלקטיבי להתכוונן APP וγ-secretase-מזורז עיבוד בהיעדרו של להשפיע על הרמה עיבוד יהיה חיוני ומזעור הקשורות חריץ תופעות לוואי של מעכבי γ-secretase, סלקטיביות זו נחשבת גורם העיקרי יהיה להכתיב את היעילות הביולוגי של פוטנציאל מאפננים γ-secretase לטיפול כרוני של המודעה. היו מספר נגזרות arylsulfonamide, כגון GSI-953 (begacestat) ועב מ- 708163 (avagacestat), נמצאו שהפגינו עיכוב חזק, סלקטיבי של γ-secretase14,15. מחקר קודם הראה כי עיכוב דיפרנציאלית של פצילות γ-secretase של האפליקציה, חריץ יכול להיות שנצפו שימוש assay מבוסס-אליסה כמותית בשילוב עם ויוו אימות באמצעות דג זברה16. יתר על כן, פרדיגמות assay מבוססת תא הוקמו לפנות את מידת הבררנות המצע פוטנציאלי של γ-secretase לכיוון APP ודרגה17,18. באמצעות פרוטוקולים דומה מהמתואר בזאת, לאחרונה גילינו מחלקה הרומן של (D)-leucinamides זה מנע בעוצמה לווסת את המחשוף γ-secretase של האפליקציה עם סלקטיביות ממעט דרגה19. יחד, זה אוסף של מחקרים מספק הוכחה-של-קונספט תומך התפישה. המצע סלקטיביות/הזמינות של γ-secretase יכול להיות כפופים אפנון כימי ואימות ניסיוני. עם זאת, פלטפורמות assay אלה מסתמכים בדרך כלל על המפרט תפוקה נמוכה יחסית וגישות מהגידולים שלא יכול לעמוד תקני התעשייה לתוכניות גילוי סמים.
יש לנו לאחרונה שנוצר לוציפראז מבוססת תא כתב ג'ין מבחני שיכול לקבוע באופן כמותי את פעילות קטליטית γ-secretase כלפי שני מצעים שונים, הרסיס C-מסוף חומצה אמינו 99 של האפליקציה (APP-C99) חוץ-תאית תחום שנמחקו חריץ פפטיד (NΔE). APP-C99 וגם NΔE היה בשימוש נרחב בשם דיאלקטריים ישירה של γ-secretase במבחני שונות. כדי ליצור הומוגניות ועקבית לוציפראז כתב ג'ין מבחני למחשוף γ-secretase של APP-C99 או NΔE, יצרנו נגזר HEK תא יציב שורה אחת (CG) המבטאת צורונים (כתב Gal4 לוציפראז מונחה יזם גחלילית Gal4-Luc), חלבון כימרי Gal4/VP16-מתויג APP-C99 (C99-GV). בנוסף, יצרנו עוד קו נגזר HEK תא יציב (NG) המבטאת צורונים Gal4-לוק ו מתויג-Gal4/VP16 NΔE (NΔE-GV). אנחנו עכשיו באמצעות מבחני הרומן המצע ספציפיים γ-secretase אלה, מספקות שיטה לכמת, להבחין בין פעילות קטליטית γ-secretase לכיוון סובסטרטים שונים (APP-C99 בתאים CG), או NΔE בתאים NG. יתר על כן, מבחני המצע ספציפיים γ-secretase נועדו תוליחתמ פלטפורמות הקרנה גבוהה-תוכן. מבחני החדש שנוצר γ-secretase אלה יכול לסלול את הדרך עבור גילוי מאפננים γ הרומן-secretase יכול לשפר את התפקוד הקוגניטיבי על-ידי דיכוי ייצור Aβ ללא העלאת עיכוב דרגה בלתי רצויים לטיפול הדור הבא של AD.

<table><tbody><tr><td>קורא צלחות זוהר VictorLight</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0010</td><td></td></tr><tr><td>Class II, סוג 2 ארון בטיחות ביולוגי</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 סדרה A2</td><td></td></tr><tr><td>CL-387,785</td><td>EMD Calbiochem</td><td>233100-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Merck</td><td>565770</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>12100046</td><td>המרכיב העיקרי של מדיום גידול</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytomer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717805 אולדריץ'</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות מיקרופלייט</td><td>Nunc</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>טטרציקלין</td><td>סיגמא</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>מגיב בדיקת לוציפראז Steady-Glo</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>חממת CO2 לח</td><td>Revco</td><td>Ultima II</td><td></td></tr><tr><td>T-REx293 קו תאים</td><td>Invitrogen</td><td>R71007</td><td></td></tr><tr><td>Wallac 1420 תוכנה גרסה 3.0</td><td>תוכנת בקרת מכשירים PerkinElmer</td><td></td><td>של קורא המיקרו-פלטות הזוהר</td></tr></tbody></table>

מדידה כמותית של חלבונים וγ secretase-בתיווך קודמן עמילואיד, המחשוף דרגה ב מבוססת תא לוציפראז כתב assay פלטפורמות

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

פיתחנו זוג כתב מבוססת תא מבחני ג'ין למדוד באופן כמותי את המחשוף γ-secretase של סובסטרטים ברורים. כתב יד זה מתאר הליכים בהם ניתן לעקוב אחר γ secretase-בתיווך המחשוף של APP-C99 או חריץ, באמצעות Gal4 מונחה יזם גחלילית לוציפראז כתב מערכת. מבחני אלה הוקמו על ידי stably משותפת transfecting תאים HEK293 עם הגן כתב לוציפראז מונחה-Gal4, או הרסיס Gal4/VP16-מתויגים ' C-מסוף של האפליקציה (APP-C99; תאים CG), או את Gal4/VP16-מתויגים ' החריץ-ΔE (NΔE; NG תאים). באמצעות אלה מבחני כתב במקביל, הראו כי מעכב ErbB2, CL-387,785, מעדיפים יכול לדכא γ-secretase המחשוף של APP-C99 בתאים CG, אבל לא NΔE בתאים NG. התגובות דיפרנציאלית הוצגו על ידי התאים CG ו- NG, כאשר מטופלים עם CL-387,785, מייצגים מאפיין המועדפת עבור γ-secretase מאפננים, תגובות אלה הן בניגוד הפאן-עיכוב של γ-secretase המושרה על ידי DAPT. המחקרים שלנו מספקים עדות ישירה כי ניתן להבחין γ-secretase פעילויות לקראת סובסטרטים בהקשר הסלולר. מבחני חדשים אלה ולכן ייתכן כלים שימושיים, גילוי תרופות טיפולים לספירה משופרת.

עיכוב של ErbB2 מאת CL-387,785 באופן שונה יכול לקדם את העיבוד של APP-C99 על ידי Γ -secretase מבלי להשפיע על הרמה המחשוף להקים assay מבוססת תא שיכול למדוד באופן כמותי את המחשוף הפרוטאוליטי של מצע מסוים γ-secretase, יצרנו את שורת התאים CG נגזר HEK293 על ידי תרביות תאים שותף יציב של טטרציקלין-inducible C-סופני Gal4/VP16-מתויג APP-C99, Gal4 מונחה יזם גחלילית לוציפראז כתב הגן. קו מקביל תא NG הוקמה גם כדי assay למחשוף γ-secretase של NΔE. בתאי...

יש לנו בהצלחה שנוצר שני מבחני המצע ספציפיים γ-secretase. שני מבחני מבוססת תא המובאת כאן נועדו לכמת פעילויות אנזימטיות γ-secretase דרך הפלט של גחלילית לוציפראז כתבים.

מדידה כמותית של חלבונים וγ Secretase-בתיווך קודמן עמילואיד, המחשוף דרגה ב מבוססת תא לוציפראז כתב Assay פלטפורמות

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

המטרה הכוללת של בדיקת גן מדווח כמותית מבוססת תאים עבור גמא-סקרטאז היא לבחון את ההשפעה הדיפרנציאלית של מאפנני גמא-סקרטאז משוערים על מחשוף בתיווך גמא-סקרטאז. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלת האלצהיימר, כגון זיהוי מודולטורים חדשים של גמא-סקרטאז לטיפול במחלת אלצהיימר. היתרון בטכניקה זו הוא שמדובר במערכת בדיקה יעילה ביותר, והיא יכולה לזהות בקלות מאפנני גמא-סקרטאז.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלת אלצהיימר באמצעות גילוי פוטנציאלי של תרופות נגד אלצהיימר עם תופעות לוואי מינימליות. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי סלקטיביות הסובסטרט של גמא-סקרטאז. ניתן ליישם אותו גם במחקרים של מחלות אחרות, כגון נוירובלסטומה.אדם חדש בשיטה זו עלול להיאבק בהסרה זהירה והוספת אמצעי תרבית תאים ל-96 מיקרו-פלטה, מכיוון שהפרעה רבה מדי עלולה לסבך את התוצאות הסופיות. התחל הליך זה בהכנת תאי NG ו-CG, כפי שמוזכר בפרוטוקול הטקסט. ספרו תאי NG או CG בעזרת המוציטומטר.לאחר מכן, זרעו את התאים ב-20,000 תאים לבאר על מיקרו-לוחות של 96 בארות בנפח סופי של 200 מיקרוליטר לבאר במצע הגידול. העבירו את המיקרו-צלחות לחממת פחמן דו חמצני לחות, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה של הלילה, הסר 100 מיקרוליטר של מצע גידול מכל באר.הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של מצע גידול המכיל שני מיקרוגרם למיליליטר של טטרציקלין עם 0.2% דימתיל סולפוקסיד, שני מיקרו-מולרי CL-387, 785, שני DPT מיקרומולרי, או מעכבי ErbB1/ErbB2 קשורים אחרים. דגרו על התאים המטופלים והמיקרו-פלטות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, הסר 150 מיקרוליטר לבאר של מצע גידול מהמיקרו-פלטות.לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר לבאר של מגיב לבדיקת לוציפראז. לאחר מכן, העבירו את המיקרו-לוחות לקורא מיקרו-פלטות זוהר, ושמרו אותם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. קבע את הזוהר הנפלט מלוציפראז באמצעות תוכנית מוגדרת מראש המאוחסנת בקורא המיקרו-לוחות הזוהר.ראשית, פתח את תוכנת בקרת המכשירים. לאחר מכן, מתפריט הכלי, בחר Luminometry. תחת ההגדרה פרמטרים, בחר ללא מסנן עבור מסנן פליטה, סמן רגיל עבור צמצם פליטה, הזן אחד לספירת זמן ולחץ על אישור כדי להגדיר את קריאת הזוהר.תחת הכרטיסייה בקרת מכשירים, גלול ברשימת הפרוטוקולים הפעילים ובחר את הפרוטוקול המאוחסן מראש לקריאת זוהר. תחת הכרטיסייה תצוגה חיה, הגדר את קנה המידה מהתפריט הנפתח ובחר לוגריתם או ליניארי עבור הסוג. תחת הכרטיסייה טמפרטורה, בחר כבוי לחימום צלחת.לבסוף, לחץ על התחלה כפתור לביצוע קריאת הזוהר. ייצא את התוצאות לפורמט גיליון אלקטרוני באמצעות הסייר המוטמע בתוכנת הבקרה. הערכת זוהר הרקע מתאי CG או NG שטופלו במצע גידול שאינו כולל טטרציקלין.הגדר אות זוהר הנפלט על ידי תאי CG או NG שטופלו ב-0.1% DMSO במדיום גידול המכיל מיקרוגרם אחד למיליליטר טטרציקלין בלבד כ-100% פעילות גמא-סקרטאז יחסית. לבסוף, לנרמל אותות לוציפראז מתאי CG או NG המתורבתים עם מצע גידול המכיל טטרציקלין ו-CL-387, 785 או DAPT לאות הלוציפראז הנפלט מתאי CG או NG שטופלו ב-DMSO. מוצגות כאן תוצאות מייצגות המדגימות את המדידות הכמותיות של מחשוף גמא-סקרטאז של APP-C99 בתאי ה-CG.התאים טופלו במיקרוטולר אחד של CL-387, 785 או DAPT בנוכחות מיקרוגרם אחד למיליליטר טטרציקלין ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. הזוהר שמקורו בפרוטאוליזה בתיווך גמא-סקרטאז של C99-GV כומת לאחר תוספת של 100 מיקרוליטר לבאר של מגיב בדיקת לוציפראז. אות הלוציפראז הנפלט על ידי תאים שטופלו ברכב בלבד נקבע כ-100% זוהר יחסי.תוצאות מייצגות המדגימות את המדידות הכמותיות של מחשוף גמא-סקרטאז של N-delta-E בתאי ה-NG מוצגות כאן. באופן דומה, התאים טופלו במיקרו-טולר אחד של CL-387, 785 או DAPT בנוכחות מיקרוגרם אחד למיליליטר טטרציקלין ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. הזוהר שמקורו בפרוטאוליזה בתיווך גמא-סקרטאז של N-delta-E-GV כומת לאחר תוספת של 100 מיקרוליטר לבאר של מגיב בדיקת לוציפראז.אות הלוציפראז הנפלט על ידי תאים שטופלו ברכב בלבד נקבע כ-100% זוהר יחסי. לאחר השליטה, טכניקה זו דורשת רק זמן מעשי של שעה עד שעתיים, בהמתנה למספר התרכובות לבדיקה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקר בתחום מחלת האלצהיימר לחקור את השינוי הגנטי והכימי של גמא-סקרטאז במרדף אחר טיפולים חדשים למחלת אלצהיימר.

quantitative-measurement-secretase-mediated-amyloid-precursor-protein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את הליך מדידת פעילות γ-secretase בתאים אנושיים מהונדסים גנטית באמצעות מערכת השראת טטרציקלין. התהליך כולל השראת ביטוי גן APP עם טטרציקלין, יצירת פפטידים β עמילואיד והפעלת ייצור לוציפראז. לאחר מכן נמדדת הביולומינסנציה הנובעת מתגובת לוציפראז-סובסטרט, המשקפת את פעילות γ-secretase.

בדיקת לוציפראז למדידת פעילות γ-secretase בתאים אנושיים

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

העברה מתא לתא של אגרגטים חלבונים, או זרעים פרוטאופתיים, עשויה להיות הבסיס להתקדמות הפתולוגיה במחלות ניווניות. כאן, מתוארת בדיקת ציטומטריית זרימת FRET חדשה המאפשרת זיהוי ספציפי ורגיש של פעילות זריעה מדגימות רקומביננטיות או ביולוגיות.

איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

דוח זה מתאר פרוטוקולים למדידת שיעורי פירוק של חלבונים לא מקופלים על ידי כתם מערבי או מבחנים מבוססי פלואורסצנטיות. ניתן ליישם את השיטות לניתוח של חלבונים אחרים שקופלו בצורה לא נכונה ולסינון תפוקה גבוהה.

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

אנו מתארים שיטה לכמת את המצבור של חלבונים misfolded. פרטי פרוטוקול שלנו lentiviral המושרה תא יציב קו הדור הדמיה קונאפוקלית אוטומטיות, ניתוח תמונות של אגרגטים חלבון. כיישום המחשה, למדנו את ההשפעה של מולקולות קטנות בקידום SOD1 צבירת באופן זמן ותלוי במינון.

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

יש דרישה לעשות ניסויים פרה-קליניים של בדיקות עבור מחלקה הרומן של תרופות היתום"בשם מלווים תרופתי לשחזור, מהיר ויעיל. פיתחנו assay המבוסס על תרבות של תאים פשוטים מאוד מתוקננת, תכליתי למסך המטופלים זכאים, כמו גם רומן המלווה תרופתי סמים.

במבחנה אנזים המדידה לנקודת מבחן תגובתיות המלווה תרופתי פאברי, מחלת הפומפה

הדמיה מולקולרית עם מטריקס בסיוע לייזר מבוססת על desorption/יינון הדמיה ספקטרומטר מסה (MALDI-IMS) מאפשרת את המיפוי סימולטני של analytes מספר דגימות ביולוגיות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול זיהוי, ויזואליזציה של חלבון עמילואיד β על רקמות המוח של מחלת אלצהיימר ודוגמאות angiopathy עמילואיד במוח באמצעות MALDI-IMS.

ויזואליזציה של הפקדות β עמילואיד במוח האנושי עם Desorption לייזר בסיוע מטריקס/הדמיה ספקטרומטר מסה יינון

פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את פעילות הפרוטאוליטי פרוטאז תחלופה נמוכה-פעילות מהותית, יחיד בהקשר הסלולר. באופן ספציפי, שיטה זו מוחלת כדי להעריך את הפעילות הפרוטאוליטי של PCSK9, נהג מפתח של מטבולי הפעילות הפרוטאוליטי נדרש עבור תפקידה hypercholesterolemic האולטימטיבי.

Assay לוציפראז תפוקה גבוהה כדי להעריך את Proteolysis של PCSK9 יחיד-מחזור פרוטאז

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מהירה בעלות נמוכה לוציפרראז בחני בתפוקה בינונית באמצעות העברת אינסולין מקושרת של גאוסיה לוציפראז כפרוקסי עבור הפרשת אינסולין מתאי בטא. ניתן לבצע את האפשרות עם מרבית קוראי הצלחות והפיפטות רב ערוצית.

מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז

פרוטוקול זה מסביר כיצד למדוד את ההשפעה של שונות גנטית הקשורה להפרעות נוירו-התפתחותיות על פעילות האנזים דאוביקוויטילציה על ידי שילוב טיהור חלבונים רקומביננטיים עם מבחני מחשוף שרשרת יוביקוויטין.

מדידת הפעילות האנזימטית של אנזימים דאוביקוויטילציה הקשורים להפרעה נוירו-התפתחותית באמצעות בדיקת מחשוף שרשרת יוביקוויטין במבחנה

כאן, אנו מתארים מערכת שמרים המשחזרת γ-הפרשה אנושית. מערכת זו מאפשרת זיהוי ומחקר של מוטציות המשפיעות על הפעילות ובדיקת מעכבי γ-סקרטאז (GSI). תוך ניצול תכונות אובדן התפקוד של מוטציות משפחתיות של מחלת אלצהיימר, ניתן לסנן מאפנני γ-סקרטאז (GSM).

שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae) מודלים של מחלת אלצהיימר לסינון גנים, מוטציות וכימיקלים המשפיעים על ייצור בטא עמילואיד על ידי γ-secretase

למד שיטת מדידה כמותית לפעילות γ-secretase בתאים באמצעות דיווח לוציפראז. שיטה זו מאפשרת זיהוי מסננים חדשים לטיפול במחלת אלצהיימר וחקר סלקטיביות רצפים.

מדידה כמותית של חלבונים וγ Secretase-בתיווך קודמן עמילואיד, המחשוף דרגה ב מבוססת תא לוציפראז כתב Assay פלטפורמות

גלה סרטונים נוספים