זיהוי, כימות של הפלזמודיום falciparum ב מימית כדוריות דם אדומות על ידי הקלוש הכולל השתקפות ספקטרוסקופית אינפרא אדום וניתוח נתונים Multivariate

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות מודל רגרסיה לחיזוי של טפיל מלריה באמצעות ספקטרוסקופיה ATR-FTIR עם ניתוח נתונים רב-תכליתי. שיטה זו יכולה לעזור לזרז אבחון נקודת טיפול אשר יכול לעזור לשפר את תוצאות המטופל בעתיד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי בעוד המודל עשוי לקחת קצת זמן לבנות, הוא נייד מאוד, ידידותי למשתמש, רגיש מאוד, ועלות נמוכה.

למרות שיטה זו מאפשרת כימות של טפילי מלריה, זה יכול לשמש גם כדי לבחון תגובה פנוטיפית לשינויים סביבתיים כגון שינויים בהרכב טפילים עקב סוכנים מיקרוביאלית. הרעיון התפתח מעבודה שעשינו בסנכרון האוסטרלי על תאים נגועים במלריה. זה היה ברמת התא הבודד.

משם החלטנו להשתמש בספקטרוסקופיית ATR-FTIR כדי לפתח את בדיקת האבחון. לפני תחילת הליך הסנכרון, תרבות 30 מיליליטר של טפילי פלסמודיום פלציפארום זן 3D7 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. באמצעות פיפטה אוטומטית, השתמש מחדש בתרבות והעבר אותה לצינור חרוט 50 מיליליטר.

צנטריפוגה התרבות ב 300 עד 400 פעמים g בתנאי מעבדה סטנדרטיים במשך חמש דקות. הסר את supernatant על ידי ציור אותו עם פיפטה אוטומטית מבלי להפריע גלולה. השלך את אמצעי הפסולת לתווך של 10%bleach.

לאט להוסיף 12 עד 15 מיליליטר של פתרון סורביטול 4% לכדור ולערבב את התרבות על ידי capping ו היפוך הצינור עד התרבות היא הומוגנית. הדגירה את התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, צנטריפוגה התרבות במשך חמש דקות.

השתמש פיפטה אוטומטית כדי להסיר את supernatant מבלי להפריע גלולה. מוסיפים 10 עד 15 מיליליטר של 0.9% מלוחים לכדור ומערבבים את הפתרון על ידי מכסה והפך את הצינור עד שהתרבות הומוגנית. חזור על צנטריפוגה ותמיסת מלח לשטוף פעמיים נוספות כדי להסיר את כל שרידי סורביטול.

כדי להתחיל בהליך זה, צנטריפוגה של תאי הדם האדומים במלאי, או RBCs. הסר את העל-טבעי ושטף עם 0.9% מלוחים בסך הכל שלוש פעמים. צנטריפוגה RBCs המניה ואת התרבות ב 300 עד 400 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant מכל צינור.

סמן שמונה צינורות מיקרוצנטריפוגה כמצוין. לאחר מכן השתמש פיפטה 0.2 כדי 20 microliter להוסיף את הכמות המתאימה של תרבות לכל צינור. לאחר מכן, להוסיף את הכמות המתאימה של RBCs מלאי לכל צינור כדי לקבל את דילול טפילים הרצוי.

צנטריפוגה הדם התורם טרי שנאסף צינורות נוגדי קרישה ב 1, 200 פעמים גרם ותנאי מעבדה סטנדרטיים במשך 10 דקות. הסר את הפלזמה על ידי ציור אותו עם פיפטה והשליך אותו לתוך פתרון 10%bleach. הוסף 900 microliters של RBCs תורם מבודד לתוך כל צינור microcentrifuge ומערבבים ביסודיות על ידי היפוך 10 פעמים.

ספסל פשוט השתקפות סה"כ השתקפות פורייה טרנספורמציה אינפרא אדום, או ספקטרומטר ATR-FTIR ישמש לרכישת הספקטרום. הכינו ונקו את הקריסטל באמצעות מגבונים נטולי מוך עם מים טהורים במיוחד כדי לקרצף בעדינות את הגביש בתנועה מעגלית. לאחר מכן, השתמשו בעוד מגבון ללא מוך לייבוש יסודי של הקריסטל.

קח מדידת רקע של האוויר על ידי לחיצה על מדידת רקע. כל 20 דקות, לנקות את הגביש ולחזור על מדידה זו. פתח את התצוגה החיה על-ידי לחיצה על תצוגה מקדימה.

שימו לב לקו בסיס שטוח ואופקי המציין שהקריסטל נקי. פיפטה 10 מיקרוליטרים של מים deionized ישירות על אמצע הגביש ולחץ על מדידת מדגם. יבש את הקריסטל באמצעות ניגוב ללא מוך ותנועה מעגלית עדינה.

פיפטה 10 מיקרוליטרים של מדגם על אמצע הגביש ולחץ על מדידת מדגם. נקה את הגביש בין הדגימות. בהדגמה זו, ניתוח נתונים רב-תכליתיים יתבצע באמצעות MATLAB.

כדי להתחיל בטיפול בנתונים, ניתוח קלט לחלון הפקודה כדי לפתוח את ממשק המשתמש הגרפי. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התיבה X כדי לחפש נתוני ייבוא. בחר את סוג הקובץ לניתוח.

יבא ספקטרום לדוגמה, מים וספקטרום בסיסי כערכות נתונים במקום העבודה על-ידי בחירת כל הספקטרום בכל קבוצה בנפרד, לחיצה על פתח ומתן שם קצר לכל קבוצה. לחצו על 'משתנה חדש' בחלון הפקודה ותנו לווקטור את השם Parasitemia. הזן את הטפילים של כל דגימה.

לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התיבה X כדי למצוא נתוני התוויה. לחץ על סמל התווה נתונים כדי להתוות את הנתונים. בדוק את הספקטרום עבור אפקטים אדי מים על ידי לחיצה על זום התקרבות על 1, 800 כדי 1, 400 אחוזים, נצפה בבירור כמו קצר, חד, פסגות צרות לאורך המדרונות של הלהקות Amide I ו Amide II.

במקרים של אדי מים קיצוניים, פתחו את הכרטיסייה 'עריכת תהליך מקדים' ובחרו 'החלקה'. צמצם את הרעש ו/או את תרומת אדי המים החזקים על-ידי החלקת הדגימה וספקטרום המים. לאחר טיפול נוסף בנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, פתח את הכרטיסיה עריכת נתונים, ובמקתני עמודה, בחר 2980 עד 2800 ס"מ ו- 1750 עד 850 ס"מ על-ידי כך שתוודא שרק התיבות שלהם מסומנות.

הנתונים מוכנים כעת לניתוח. כדי לבצע ניתוח רכיבים ראשיים, או PCA, לחץ על פירוק ניתוח ובחר PCA. לחץ על בנה מודל.

שים לב למגבלת הביטחון של 95%,, הטבעת המקווקות, על חלקת הציונים בין מחשב 1 למחשב 2. השתמשו בכלי בחירת ספקטרום כדי לסמן את הספקטרום לדוגמה עם ציונים המתרחשים מחוץ למגבלה כחריגים פוטנציאליים. כדי לבצע רגרסיה חלקית פחות ריבועים, או PLSR, לחץ על רגרסיה ניתוח ובחר PLSR.

לחצו לחיצה ימנית על בלוק ה-Y ובחרו במודל הבנייה הווקטורי Parasitemia. לנתח את מודל הרגרסיה ואת וקטור הרגרסיה ולזהות את הרצועות הביולוגיות. חלק חלקי פחות ריבועים רגרסיה העלילה של RBCs זינק בין אפס לאחוז אחד Parasitemia יצר ערך R בריבוע של 0.87 ו ממוצע שורש בריבוע צלב אימות שגיאה של 0.13%Parasitemia.

זה מדגים את היכולת של המודל לחזות אתטפילים בכל מדגם עם Parasitemia הידוע על ציר x ואת Parasitemia החזוי על ציר y. מקדם הרגרסיה המשויך מתאר את תרומתו של כל רצועה ליכולת החיזוי של המודל. ככל שהרצועה אינטנסיבית יותר, כך היא תורמת יותר למודל, וכך הטפיל משנה את ההרכב הכימי של הדם.

התוצאות מראות כי האות מפני טפילים נבדלים מספיק מן RBCs כי הם יכולים לשמש כדי ליצור מודל רגרסיה ליניארית לחיזוי של טפילים בערכות נתונים עתידיות. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להימשך פחות משלוש דקות לכל מדגם אם מבוצע כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנקות את גבישי ATR של כל השאריות.

בעקבות הליך זה, מינים אחרים של מלריה כגון P vivax ו P מלריה ניתן לדגמן על מנת לענות על שאלות כגון, האם ספקטרוסקופיה ATR-FTIR רגיש מספיק כדי להבחין בין מינים? לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביוספקטרוסקופיה לחקור את הגילוי והכימות של פתוגנים אחרים המועברים בדם ואף לנתח בדם כגון גלוקוז ואוריאה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של ספקטרוסקופיה ATR-FTIR וניתוח NVDA כדי לבנות מודל רגרסיה.

אל תשכח כי עבודה עם דגימות דם ומלריה החולה יכול להיות מסוכן, אימון ברמה biosafety מתאים בלימה תמיד צריך להיעשות בעת ניסיון הליך זה.