הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

המטרה הכוללת של הליך הדמיה פלואורסצנטי של אנזים מדווח זה היא להקל על זיהוי רגיש וספציפי של מיקובקטריום טוברקולוזיס במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים לפתוגנזה, טיפולים ומחקר חיסונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השחפת, כולל מנגנוני אלימות של מיני חיידקים, כמו גם יצירת טיפולים והבנת חיסונים. אז היתרון העיקרי של הטכניקה הזו הוא שהיא מאפשרת לדמות את אותה קבוצת בעלי חיים בכמה נקודות זמן.

זה מפחית מאוד את העלות, מאפשר לנו לחקור את האינטראקציות של הפתוגן המארח, וגם מגדיל את העוצמה הסטטיסטית מאחר שמספר רב יותר של חיות יכול להיות מוחזק בקלות בו זמנית. בתור התחלה, גדל כל חיידק M.tuberculosis במדיום MOADCTW ב-37 מעלות צלזיוס לצפיפות אופטית של 0.5 הנמדדת ב-600 ננומטר. כל ההליכים הכרוכים במניפולציה של חומרים זיהומיים חייבים להתבצע בתוך ארונות בטיחות ביולוגית או התקני בלימה פיזיים מאושרים אחרים.

לאחר שמוכן, הכינו סדרה של אחד עד 10 דילולים של התרבות באותו מדיום. לאחר מכן, צלחו את הדילולים בשלוש פעמים על לוחות 7H11 סלקטיביים כדי לבצע קביעה מדויקת של ה-CFU. דגרו על הצלחות במשך ארבעה שבועות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס או עד שניתן יהיה לספור במדויק את המושבות כדי לקבוע את ה-CFU.

לפני הגדרת חיסון, ודא תמיד שמכסה המנוע הביולוגי זורם אוויר במהירות של 50 ליטר לדקה. כדי להכין חיסון שיכול להדביק עד 90 עכברים, מדוד את ה-CFU הרצוי בצינור בז של 15 מיליליטר. בדרך כלל משתמשים בין 10,000 למיליון CFU.

ואז גלולה את החיידקים. לאחר מכן שטפו את החיידקים פעם אחת עם 10 מיליליטר מי מלח. ואז השעו אותם ב -15 מילילטר מי מלח.

לאחר מכן, בארון בטיחות ביולוגית, העמיסו את החיסון לצנצנת זכוכית שיכולה להתחבר לנבולייזר. לאחר מכן, חבר את יחידת הנבולייזר והתאם את צינור הנירוסטה האנכי כך שהקצה התחתון יהיה כרבע סנטימטר מתחת למניסקוס המתלה. כעת העבירו את המכלול לתא החיסון במיכל הובלה חסין דליפות.

כדי להמשיך, העמיסו בעלי חיים במשקל ידוע לתוך תא החיסון המופעל. החדר יכול להכיל עד 90 עכברים. ואז סגור את כל התפסים בדלת.

לאחר מכן, חבר את הנבולייזר באמצעות מהדק פלדה. לאחר מכן לחץ על כפתור ההתחלה בתא. והגדר את קצב זרימת האוויר בין שלושה לחמישה ליטר לדקה.

האוויר הדחוס יזרום במהירות של כ-22 עד 26 פאונד לאינץ' רבוע וחשוב מכך שיהיה אפשר לראות את ערפל החיסון בתא. לאחר 15 דקות תופיע נורה אדומה בחזית לוח הבקרה ואות קולי יציין את סיום הריצה. לאחר מכן לחץ על לחצן האיפוס כדי לאפס את הטיימרים.

כדי לשחרר את הוואקום, לחץ על הכפתור האדום הקטן בדלת החדר. לאחר מכן פתח את דלת החדר והחזיר את העכברים לכלובי הבית שלהם. בהמשך, החזיקו את החיות בחדר ההכלה.

לאחר מכן החזירו את הצנצנת ואת מיכל ההובלה לארון הבטיחות הביולוגית. שם, השליכו את תרחיף החיידקים שנותר למיכל פסולת ייעודי. לאחר מכן הניחו את צנצנת הנבולייזר המשומשת בתוך שקית ביולוגית ואטמו את השקית להובלה לחיטוי.

כדי לנקות את החדר, יש לרסס את המשטחים הפנימיים בפנול חוצץ ואתנול 70%. אפשר לפתרונות אלה להגיב על משטחים אלה למשך 10 דקות. לאחר מכן נגב אותם ביסודיות.

השלך את כל המגבונים לאשפה הביולוגית. לאחר מכן חיטוי האשפה, מיכל הפסולת וצנצנות נבולייזר משומשות. העבירו את בעלי החיים לחדר ההדמיה.

שם, יש להרדים בעל חיים על פי פרוטוקול הטקסט ולהזריק לו מצע ניגוד על ידי הזרקה תוך צפקית. בתוכנת מערכות ההדמיה, אתחל את המערכת והמשך כאשר סרגל הטמפרטורה הופך לירוק. לאחר אתחול המערכת, הנח את העכבר בתא ההדמיה.

ודא שהנחיריים שלו נמצאים בתוך חרוט האף כך שהוא יקבל חומר הרדמה במהלך ההדמיה. כעת חזור למחשב. בלוח הבקרה של הרכישה, בחר פלואורסצנטיות, טרנסה-אור, להדמיה של בעלי חיים שלמים, או אפי-תאורה לצפייה ברקמות הריאה.

עבור עכבר בודד, הגדר את שדה הראייה ל-B ואת מפלס המנורה לגבוה. עבור החשיפה, השתמש בזמן אוטומטי, בשילוב בינוני ובשניים או שלושה עבור F/Stop. לאחר מכן הגדר את מסנן העירור ל-745 ננומטר ומסנני פליטה מ-780 עד 840 ננומטר.

לאחר מכן, עבור להגדרת הרצף ובחר תשע עד 12 נקודות הדלקה באזור העניין. כעת לחץ על כפתור הרכישה כדי לאסוף תמונות. ניתוח תמונות מכוסה בפרוטוקול הטקסט.

כדי לנתח את היקף הזיהום, המתת חסד של העכבר באמצעות נתרן פנטוברביטל. הקפד לבדוק אם יש רפלקס דוושה כדי להבטיח שהחיה מורדמת. ואז לשתול את הריאות באמצעות דיסקציה סטנדרטית.

לאחר מכן הומוגניזציה של רקמת הריאה במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן בצע דילול סדרתי פי עשרה של ההומוגנין באמצעות PBS. צלחת את ההומוגניות המדוללת בשלוש עותקים ודגירה על הצלחת ב -37 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לספור מושבות.

לאחר מכן השתמש בציון CFU כדי למדוד את חומרת הזיהום. העכברים טופלו כמתואר. נעשה שימוש במצע REF כדי לצפות בהתקדמות של M.tuberculosis.

הקרינה כומתה באמצעות טרנסאורציה. וזה עלה משבוע שני לשבוע שישי בעכברים הנגועים. ניתן לייחס את הירידה הקלה באות בעכברי הביקורת לעלייה במסת הגוף ובנפח במהלך ששת השבועות.

שחזור FLIT תלת מימדי של מקורות פלואורסצנטיים נעשה ממספר נקודות טרנס-הארה תוך שימוש באותה עירור וסדרה של מסנני פליטה. מפות יעילות NTF נעשו כדי לבדוק את איכות השחזור. התמונה שצולמה ממסנן העירור הספציפי נורמלה לתמונת השידור שנעשתה עם אותו מסנן פליטה ומסנן עירור פתוח.

זה מספק אות המופק על ידי המצע בלבד. כמעט ולא הייתה טעות בשחזור. בחינת יעילות ה-NTF של הנתונים הן במבט האופקי והן במבט האנכי הראתה מתאם הדוק.

לפיכך, לשחזור התלת-ממדי היו מעט חפצים, מיקום אותות משופר ורגישות משופרת בהשוואה לשיטות אחרות. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום השחפת לחקור את היעילות הטיפולית של תרופות נגד מיקובקטריום טוברקולוזיס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להדביק עכברים באמצעות נתיב אירוסול עם מיקובקטריום טוברקולוזיס עם הדמיה אופטית מעקב באמצעות מצע REF.