Name: הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: למד הדמיה אופטית של שחפת Mycobacterium tuberculosis בעכברים באמצעות קרינה פלואורסצנטית של אנזים מדווח. שיטה זו מאפשרת גילוי רגיש וספציפי של החיידק במודלים טרום-קליניים, ותומכת במחקר מנגנוני פתוגנזה, תרפיות וחיסונים נגד שחפת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקרים שנעשו בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות שנקבעו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה של טקסס A & ז אוניברסיטת. סקירה ואישור הממונה על הבטיחות הביולוגי או ועדה במוסד שלך עשוי להידרש.
שים לב: כל ההליכים דורשים BSL3 הבלימה. אנשי נדרשים ללבוש ציוד מגן אישי בכל עת. כל המניפולציות מבוצעים בפנים אבטחה הקבינט (BSC) ואת כל שרפ יושלכו בצורה במיכלים שרפ. משטחי עבודה, BSC מנוקים עם אתנול פנול ו- 70% במאגר לפני ביצוע העבודה, אחרי העבודה. הליכים בדרך כלל ייעשה ברמה אבטחה 3 עם שחפת Mycobacterium, אך עבור איור ומטרות הצילומים, המחברים מדגימים הליכים אלה ברמת אבטחה 2 עם חיידקים פחות ארסית.
1. זנים, תרבות תנאים
הערה: מ. שחפת זן CDC1551 נעשה שימוש במחקר זה, אך כל זן מ. שחפת יכול לשמש באופן זהה.
<ol><li>לגדל את החיידקים ב- M-OADC-TW (7 שעות 9 מרק בתוספת גליצרול 0.5%, 10% חומצה אולאית דקסטרוז מורכבים ללא קטלאז, 0.05% Tween-80) בינוני שעומדים 37 ° C עד יתר600 של 0.5 (~ 0.2 x 107 CFU).</li>
	<li>לדלל את התרבות ב- M-OADC-TW (סדרה של 1:10 דילולים של החיידק). לוחית רישוי של דילולים של החיידקים (105, 106, 107, 108) דולר על גבי צלחות 11 סלקטיבי של 7 שעות כדי לאפשר קביעת CFU.</li>
	<li>דגירה הצלחות במשך ארבעה שבועות ב 37 מעלות צלזיוס, או עד מושבות ניתן לספור במדויק.</li>
	<li>Centrifuge את inoculum חיידקי ב g x 8,534 במשך 5 דקות כדי להשיג גלולה. לשטוף את גלולה פעם אחת עם 10 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl) ו מחדש להשעות את צניפה ב 15 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl).</li>
</ol>2. תרסיס זיהום של עכברים באמצעות תא מדיסון
<ol><li>לאפשר עכברים כדי להתאקלם הסביבה החדשה לשבוע.</li>
	<li>שוקלים העכברים לפני טעינת אותם אל החדר.</li>
	<li>לחבר מיתרי שלוש לתוך רצועת הכוח: הכוח בחלל המרכזי, את משאבת ואקום, מדחס אוויר, לפי הסדר הזה.</li>
	<li>בזהירות להתיר את צנצנת הזכוכית. להביא את צנצנת הזכוכית אבטחה ארון ולהוסיף את inoculum אתגר הושעו ב 15 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl) כדי להשיג ~ 104 - 106 CFU של חיידקים בתוך הריאות.</li>
	<li>סגור את מכסה צנצנת הזכוכית ב אבטחה הקבינט. לצרף את הצנצנת יחידת מפוחים ולהתאים את צינור נירוסטה אנכי כך הקצה התחתון (צריכת) הוא כרבע סנטימטר מתחת לגובה של הנוזל בצנצנת.</li>
	<li>לטעון את כל החיות לצורך הניסוי (החדר יכול להחזיק עכברים עד 90) אל החדר וסגור את כל הבריחים בדלת.</li>
	<li>בדוק הראשי (חדר) מד זרימת אוויר. ודא כי במרכז הבמה (כדור) מפעילה כ 50 ליטר/דקה כפי שנמדד בסולם בצד השמאל.</li>
	<li>לחץ על כפתור התחל בלוח הבקרה של התא. הגדר את קצב זרימת האוויר דרך המונה זרימת האוויר מדחס (המונה קטן בפינה השמאלית) 4 L/min בסולם. בדוק חזותית כדי לוודא כי הוא להיות nebulized inoculum האתגר.</li>
	<li>לאחר 15 דקות, כאשר מופיע האור האדום בחזית של לוח הבקרה אות נשמע מציין את סוף המרוץ, לחץ לחצן איפוס בפינה הימנית התחתונה של החלונית ' בקרה ' כדי לאפס את הטיימרים.</li>
	<li>החזק את לחצן אדום קטן על הדלת של החדר כדי לשחרר את הואקום.</li>
	<li>פתח את הדלת קאמרית ולהסיר את החיות. הצב והעכברים בחזרה לתוך הכלובים.</li>
	<li>הסר את צנצנת הזכוכית מפוחים ומניחים במיכל אטום, עמיד בפני נזילה תחבורה. הכנס את המיכל בפנים הארון ביולוגית ולמחוק את המתלים אתגר לתוך מיכל פסולת המיועדת.</li>
	<li>מניחים את הצנצנת מפוחים בשימוש בתוך שקית חומרים מסוכנים, לסגור את השקית על התחבורה החיטוי.</li>
	<li>בסוף ההליך זיהום, לרסס הפנימי של החדר עם אתנול פנול ו- 70% במאגר ומאפשרים לתא לשבת 10 דקות.</li>
	<li>לאחר מכן, נגב את כל משטחי הפנים נגיש באופן יסודי ביותר. היפטרו מכל מגבות נייר מזוהמים, וכו '. בפח האשפה חומרים מסוכנים. אוטוקלב האשפה, פסולת מיכל ומשמשת מפוחים צנצנות.</li>
	<li>מקם את החיות בחדר ההכלה עד נקודת-הזמן הדמיה.</li>
	<li>ביום הדמיה, העברת החיות במיכל משני לחדר ההדמיה.</li>
</ol>3. בעלי חיים הרדמה
<ol><li>עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין באמצעות מערכת אישית גז הרדמה.</li>
	<li>שוקלים כל אחד המיכל מסנן פחם שני הממוקמת על גבי יחידת הרדמה.</li>
	<li>החלף מיכל חדש אם המשקל הוא 50 גרם מעל המשקל ההתחלתי.</li>
	<li>בדוק את יחידת מכשיר אידוי כדי להבטיח איזופלוריין מספיק עבור ההליך.</li>
	<li>הצב בעל האף חרוט בתוך החדר הדמיה. מספר של הקונוסים האף הנדרש לקבלת ההליך, לסגור את הפתחים שנותרו עם חוסמי האף חרוט.</li>
	<li>להפעיל את אספקת החמצן מן הגליל בלחץ גבוה ולהגדיר אותו בבית 55 psi.</li>
	<li>תדליק את המשאבה פינוי ממוקם מול יחידת הרדמה ולהגדיר אותו 8 L/min.</li>
	<li>הפעל את דו-מצבי של חמצן ממוקם מול יחידת הרדמה.</li>
	<li>הפעל זרימת הגז אל התא אינדוקציה הרדמה יפעילו זרימת גז על 1.5 ליטר לדקה להפוך זרימת הגז.</li>
	<li>הפעל זרימת הגז לחדר ההדמיה יפעילו זרימת גז על 0.25 L לדקה להפוך זרימת הגז.</li>
	<li>הפעל את מכשיר אידוי איזופלוריין ולהגדיר אותו ב- 2-2.5%. התאם את רמת איזופלוריין בהתאם למספר ואת המשקל של חיות המשמשות את הניסוי על-ידי סיבוב החוגה על מכשיר אידוי איזופלוריין (2-2.5% לעכבר השוקל ~ 20 g; 4% עבור שפן במשקל של 300 גרם).</li>
	<li>מקום העכברים בבית הבליעה הרדמה, סגור את המכסה. הפעל זרימת הגז אל התא אינדוקציה הרדמה.</li>
	<li>יוצאים העכברים בבית הבליעה אינדוקציה הרדמה למשך 5-10 דקות עד מורדם לחלוטין.</li>
	<li>ברגע העכברים הם מרדימים, להחיל משחה אופטי לעיניים כדי להגן עליהם תוך הדמיה.</li>
	<li>מקום העכברים recumbency הגחוני או בחזה ובצלעות כך אפם מוצבים בתוך אצטרובל האף כדי להקל על הרדמה של עכברים במהלך ההליך הדמיה.</li>
</ol>4. כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט) הדמיה
<ol><li>להזריק את המצע (20 מיקרומטר, 2.5 µL/גר' משקל) על ידי הזרקת בקרום הבטן לתוך הנגועים, כמו גם בקרת עכברים. העכברים הם תחת הרדמה בתוך החדר הדמיה עבור פחות מ- 1 דקות.</li>
	<li>להפעיל את מערכת הדמיה.</li>
	<li>לאתחל את המערכת על ידי לחיצה על אתחל. המתן עד הבר טמפרטורה הופך לירוק. הערה: תא הדמיה מורכבת פלטפורמה מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה בזמן ההדמיה.</li>
	<li>הדמיה רכישה הגדרה, בחר פלורסנט | טרנס-תאורה עבור כל החיה או אפינפרין-תאורה בשביל לרקמות ריאות, המבנה של כיסוי בלוח הבקרה רכישה.</li>
	<li>הגדר שדה ראייה B עבור עכבר אחת ורמת מנורה גבוהה.</li>
	<li>להגדיר זמן חשיפה אוטומטית, binning בינוני, 2-3 f/להפסיק, שיטות עירור במסנן ב nm 745 ומסננים פליטה 780 nm 840 ננומטר.</li>
	<li>עבור התקנת רצף, לחץ על רצף ההתקנה, בחר 9-12 נקודות הטרנס-תאורה באזור הריאה.</li>
	<li>לחץ על ייבוא עבור רכישת התמונה.</li>
	<li>הנח את העכבר בחזרה לתוך כלוב ההדמיה שלאחר.</li>
	<li>לפקח על העכברים עד החלים לחלוטין או להקריב עבור לכימות CFU אם הדמיה ב נקודת הזמן של הניסוי. לבצע ניקוד Karnofsky ששונה כדי לפקח לרווחתם של עכברים פוסט-הדמיה.</li>
</ol>5. ניתוח של שופט הדמיה
<ol><li>פתח את תוכנת הדמיה.</li>
	<li>לטעון קבצי תמונה על-ידי לחיצה על עיון סמל.</li>
	<li>עבור unmixing ספקטרלי, לחץ על הפירוק הספקטרלי Unmixing הצבעים כלי ולחץ על ספקטרום הנדרש כדי unmix. לחץ על התחל unmixing.</li>
	<li>שיקום משטח אופטי, לחץ על השטח הטופוגרפי.</li>
	<li>בחר כיוון כדי הגבי, בכפוף פרווה העכבר, לחץ על פני שטח של צור.</li>
	<li>לצייר תמונה חיתוך ולהגדיר סף תמונה עבור אזור של עניין. לחץ על בוצע.</li>
	<li>לרישום איברים, עבור אל הכרטיסיה רישום תלת-ממד בתפריט הנפתח כלים אופטי.</li>
	<li>הירשם איברים עניין באטלס איברים.</li>
	<li>התאם גודל איבר או מיקום הטופוגרפיה משטח שנוצרו באמצעות הכלי שינוי צורה/ביטול ממוקם על הכלים לוח רישום.</li>
	<li>ללכת טומוגרפיה פלורסנט (פליט) שחזור תלת-ממד, ולנתח בחר בכרטיסיית בחר את התמונות כדי להיכלל לניתוח, תמונה סוג ליעילות פלורסצנטיות שידור מנורמל (NTF), לחץ על התחל.</li>
	<li>לבדוק כל בחירה, לשחזר בכרטיסיה תצוגה מקדימה של נתונים.</li>
	<li>על ידי קרינה פלואורסצנטית כימות, ללכת לכלים של אזור ריבית (ROI), להוסיף קוביה רועי האיבר עניין, להתאים את גודל הקוביה כדי לכסות את האיבר של עניין. לחץ על מדוד ROIs תלת-ממד.</li>
	<li>בחלון המידות רועי, ללכת למדידות רועי תלת-ממדיים, בחר סוג נתונים מקור יחידת voxels ומדידות pmolM-1ס מ-1.</li>
	<li>שמירה ו/או לייצא את התוצאה של פליט ניתוח שחזור תלת-ממד לקובץ נתונים או איור.</li>
</ol>6. כימות של חיידקים על ידי CFU
<ol><li>המתת חסד העכברים מאת בקרום הבטן הזרקת סודיום פנטוברביטל 0.1 מ"ל (390 מ"ג/מ"ל).</li>
	<li>בדוק אם פדלים רפלקס לוחצת את רפידות של כפות הרגליים של עכברים כדי להבטיח שאין תגובה רפלקס.</li>
	<li>Explant רקמת הריאה מן העכברים באמצעות מלקחיים סטרילי ומספריים. Homogenize רקמת הריאה ב 1 מ"ל של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
	<li>להפוך דילולים טורי 10-fold של homogenate הריאה עקר 1 x PBS.</li>
	<li>עבור ציפוי, במקום שלוש aliquots של 20 µL כל של דילול בהתאמה על הצלחת אגר.</li>
	<li>דגירה הלוחות באינקובטור 37 ° C, צג לצמיחה בקטריאלי.</li>
	<li>ספירת מושבות בכל נקודה לאחר זמן הדגירה ולבטא כמו CFU / mL על-ידי תיקון עבור אמצעי אחסון ודילול באמצעות המשוואה הבאה: CFU / מ"ל = (C/V) x-M איפה C = המושבה ספירות לכל מקום, V = אמצעי אחסון מדגם מחוסן על כל צלחת (mL) ו- M = פקטור הכפלה (הדדיים של הדילול בשימוש). הערה: אם המושבות 11 נספרות במקום אחד עבור נפח דגימה של 0.002 מ"ל לדילול מדגם של 10-4, באמצעות המשוואה, הרוזן המושבה יחושבו כפי (11/0.02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL</li>
</ol>

<ol><li>Lewinson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Official+American+thoracic+society%2Finfectious+diseases+society+of+America%2F+centers+for+disease+control+and+prevention+clinical+practice+guidelines%3A+diagnosis+of+tuberculosis+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children.</a> Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensititre+MYCOTB+MIC+plate+for+testing+Mycobacterium+tuberculosis+susceptibility+to+first-+and+second-line+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Ch%22%5BJournal%5D)">Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs.</a> Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).</li>
<li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+transmission%2C+diagnosis%2C+and+management+of+multidrug-resistant%2C+extensively+drug-resistant%2C+and+incurable+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Resp+Med%22%5BJournal%5D)">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).</li>
<li>Behr, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+from+patients+smear-negative+for+acid-fast+bacilli%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli.</a> Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).</li>
<li>Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+aspirate+yield+for+children+with+suspected+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatric+Infect+Dis+Soc%22%5BJournal%5D)">Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis.</a> J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).</li>
<li>Monkongdee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yield+of+acid-fast+smear+and+mycobacterial+culture+for+tuberculosis+diagnosis+in+people+with+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus.</a> Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).</li>
<li>Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacteriology+of+pulmonary+tuberculosis+in+a+population+with+high+human+immunodeficiency+virus+seroprevalence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tuberc+Lung+D%22%5BJournal%5D)">The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence.</a> Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).</li>
<li>Yang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+Mycobacterium+tuberculosis%2C+using+a+novel+near-infrared+fluorescent+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate.</a> J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).</li>
<li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+excitation+increases+detection+sensivity+for+pulmonary+tuberculosis+by+whole-body+imaging+with+%CE%B2-lactamase+reporter+enzyme+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence.</a> J Biophotonics. , (2016).</li>
<li>Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+luciferase+to+image+bacterial+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using luciferase to image bacterial infections in mice.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+optical+imaging+to+study+of+extrapulmonary+spread+by+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis.</a> Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+assessment+of+drug+efficacy+against+Mycobacterium+tuberculosis+using+an+improved+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase.</a> J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria.</a> PLoS ONE. 5 (5), 10777(2010).</li>
<li>Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+excitation+in+whole-animal+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging.</a> PLoS ONE. 11 (2), 0149932(2016).</li>
<li>Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/8565/1/Multi-scale-fluorescence-imaging-of-bacterial-infections-in-animal-models/10.1117/12.2004690.short">Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models.</a> Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537(2013).</li>
<li>Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://spie.org/Publications/Proceedings/Paper/10.1117/12.896553">Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope.</a> Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A(2011).</li>
<li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+model+to+test+anti-tuberculosis+drugs+using+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging.</a> J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).</li>
<li>Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+probe+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+and+identifying+genes+critical+for+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry.</a> Front. Microbiol. 7, (2016).</li>
<li>Ordonez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Model+of+pulmonary+cavitary+tuberculosis+and+expression+of+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9.</a> Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).</li>
<li>Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of bacterial infections.</a> Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).</li>
<li>Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+humanized+mouse+model+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A humanized mouse model of tuberculosis.</a> PLoS ONE. 8 (5), 63331(2013).</li>
<li>Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+Usa%22%5BJournal%5D)">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).</li>
<li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tuberculosis+with+endogenous+%CE%B2-+lactamase+reporter+enzyme+fluorescent+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+Usa%22%5BJournal%5D)">Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice.</a> P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).</li>
<li>Kong, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+enzyme+fluorescence+%28REF%29+imaging+and+quantification+of+tuberculosis+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals.</a> Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).</li>
<li>Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Imaging in tuberculosis.</a> Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).</li>
<li>Lee, K. S., Im, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CT+in+adults+with+tuberculosis+of+the+chest%3A+characteristic+findings+and+role+in+management%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management.</a> Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).</li>
<li>Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+children+with+spinal+tuberculosis.+A+comparison+of+radiography%2C+computed+tomography+and+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Br%22%5BJournal%5D)">Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging.</a> J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).</li>
<li>Soussan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+pulmonary+tuberculosis+on+FDG-PET%2FCT%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT.</a> Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).</li>
<li>Sule, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+directions+using+reporter+enzyme+fluorescence+%28REF%29+as+a+tuberculosis+diagnostic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform.</a> Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).</li>
<li>Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+non-invasive+bioluminescent+imaging+to+assess+mycobacterial+dissemination+in+mice%2C+treatment+with+bactericidal+drugs+and+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity.</a> Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).</li>
<li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+protein+expressing+strains+to+evaluation+of+anti-tuberculosis+therapeutic+efficacy+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 11 (3), 0149972(2016).</li>
<li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+point-of-care+detection+of+the+tuberculosis+pathogen+using+a+BlaC-specific+fluorogenic+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe.</a> Nature Chem. 4, 802-809 (2012).</li>
<li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/9715/1/Whole-animal-imaging-of-bacterial-infection-using-endoscopic-excitation-of/10.1117/12.2213820.short">Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe.</a> Proc SPIE. 9715, 97150(2016).</li>
<li>Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s40475-015-0043-1">Advances in tuberculosis diagnostics.</a> Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).</li>
<li>Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+in+vivo%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging in vivo: recent advances.</a> Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).</li>
<li>Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-dose+intravenous+toxicity+study+of+IRDye+800CW+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).</li>
<li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Front Microbiol. 8, 717(2017).</li>
<li>2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. , 20150219653 A1 (2015).</li>
<li>Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Covalent+Reporter+of+%CE%B2-Lactamase+Activity+for+Fluorescent+Imaging+and+Rapid+Screening+of+Antibiotic-Resistant+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eur+J%22%5BJournal%5D)">A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria.</a> Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).</li>
<li>Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+Selective+Near-Infrared+Fluorescent+Off-On+Probe+and+Its+Application+to+Imaging+Different+Levels+of+%CE%B2-Lactamase+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus.</a> Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).</li>
<li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+lung+cancer+and+tuberculoma+in+the+same+lesion%3A+demonstration+by+high+resolution+and+contrast-enhanced+dynamic+CT%5BTitle%5D)+AND+%22BRIT+J+RADIOL%22%5BJournal%5D)">Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT.</a> BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).</li>
<li>Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+radiographic+differentiation+of+lung+nodules+caused+by+mycobacteria+and+lung+cancer%3A+a+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study.</a> BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).</li>
</ol>

בעת שימוש בטכניקות דימות, כגון REF, יש מפתח אסטרטגיות המאפשרות יצירה של נתונים חזקים ועקביים. הדמיה אופטית מייצרת אור הפזורים ברקמות אשר יכולים להשפיע את עומק החדירה, מאז זה קשה ללכוד את האור הנפלטת מכל הכיוונים. שימוש של fluorophore ליד אינפרא-אדום (ניר) המצע עבור REF הדמיה שיש גל של עירור, פליטה Querange של 700-900 ננומטר מקלה על הספיגה מינימלית של האות פלורסנט מאת בתרבית של רקמות. המצע מעוצב מותאם אישית נבנה על-ידי קישור של ניר fluorophore, IRDye 800Cw כ'חטיף, IRDye QC-1, על ידי טבעת לקטם ומאפשר פלורסצנטיות תהודה אנרגיה מבוססת על העברת שכבתה. IRDye יש חדירה מצוינת רקמת אור פיזור המאפיינים ואת אין כל השפעה מזיקה ניכר על יונקים36, פינה ממחזור הדם, באיברים מאת h 24 פלורסצנטיות אות משמעותית מגדיל מתחיל 4 שעות לאחר המצע מינהל, להגיע מקסימלי רמות 6 שעות לאחר ניהול.
מינון זיהומית חיידקית, מצב של מינהל במינון זיהומיות ואת המצע, כמו גם בזמן נקודות של הדמיה פוסט זיהום על-ידי ביצוע מחקרים טייס צריך להיות מוגדר לפני היציאה ניסויים גדולים ומורכבים,. יכול לימודי טייס לצמצם במידה ניכרת של זמן ועלות כאשר הדמיה מספר גדול של בעלי חיים כי תהליך סטנדרטי ניתן למטב לפני הניסוי מפתח. המון חיידקים צריך להיות נחוש ברקמות/האיברים עניין בעקבות כל הגוף הדמיה באמצעות הטרנס-תאורה ו- ex-vivo ריאות הדמיה באמצעות epi-תאורה כדי לאמת את מקור האות, לקבוע את איכות המתאם עם מספרים חיידקי נוכח8. לימודי טייס יספקו תובנה הסף של זיהוי, טווח דינמי של הטכניקה, כמו גם קביעת התנאים ניסיוני אופטימלית עבור הדמיה.
היתרונות העיקריים של שימוש REF הדמיה כמו בהשוואה אסטרטגיות זוהרים פלורסנט אחרים הם שלה רגישות גבוהה ויכולת תמונה טבעית מ. שחפת זנים. REF הדמיה מנצל את האנזים catalytically חזקים BlaC זה כולו כל מבודד קלינית מ. שחפת , שחפת-מתחם זנים. הרגישות הגדולה של שופט הדמיה הוא שיעור קטליטי מהירה BlaC בשילוב עם השמירה של המוצר פלורסנט cleaved התא המארח. אות ללא הרף עולה ככל המצע זמין וכתוצאה מכך הצטברות כמעט בלתי מוגבל של האות בתוך תאים נגועים, רקמות. רגישות מוגברת זו של שופט הדמיה לעומת גישות אלטרנטיביות הדמיה מאפשר זיהוי ספציפי של מ. שחפת בשני במבחנה ויוו8,23,24, 29.
REF הדמיה ניתן לגילוי חיידקי בלי שינויים גנטיים המאפשרים יישומו ישירה לכל זיהום מודל, מעבדה חיות8,37 או חומרים קליני האדם29,38 . שופט יכול לשמש לשם זיהוי של תמונה מגוון רחב של פתוגנים39,40, מאז fluorogenic דיאלקטריים ניתנים לפיתוח עבור מטרות אנזימטיות רבות מלבד BlaC כגון פרוטאזות, kinases, ureases וβ-galactosidases. עם זאת, זהיר מחשבה צריך להינתן למטרה על מנת להבטיח הוא מציג מאפיינים אופטימלית עבור הדמיה. BlaC מייצג אנזים מודל טוב עבור מאפיינים שיבטיחו יישום מוצלח של אסטרטגיה זו. REF הדמיה מספקת read-out מיידית של במשלוח חיידקי מתנת בריאות במהלך זיהומים, אשר במידה רבה מהירויות של התקדמות במחקר של שחפת פתוגנזה, מאז קביעת מספרי חיידקי דורש בדרך כלל שלושה עד שישה שבועות, אבל אפילו יותר אורגניזמים בצמיחה מהירה, גישה זו תוכלו לחסוך הרבה מאוד זמן. שופט יכול לשמש גם כדי להפלות קרצינומות מ שחפת, בעיה מפתח באבחון של נגעים אקנה קשרי מטופלים41,42. REF משמש ככלי הרומן להאיץ שחפת translational הדמיה, אפילו ניתן להחיל על בני אדם, פוטנציאל המאפשר חיזוי מהירה של תוצאות טיפוליות.

שיעור הצמיחה האיטית של מ. שחפת נמצא מחסום מרכזי אבחון מהיר של שחפת-1,-2,-3. בעוד תרבות לפי האבחנה לוקח שבועות כדי להפיק תוצאות, השמצות acid-fast יש מגבלות האבחון4 ילדים5 ו חולים שנדבקו במשותף עם וירוס הכשל החיסוני האנושי6,7. טכנולוגיות הדמיה אופטית הוכרו לאחרונה כחלופה מסורתיים שיטות אבחון עבור שחפת8,9. קרינה פלואורסצנטית ו ביולומינסנציה יכול לשמש כדי שטיחות תמונה מ. שחפת בבעלי חיים בזמן אמת10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. דימות אופטי יש את היתרון של הערכה מהירה, מדויקת של זיהום עם מ. שחפת20,21,22.
אנחנו חלוקה לרמות פרטים עבור הדמיה אופטית של מ. שחפת בעכברים בשידור חי באמצעות מספר סידורי. שיטה זו היא רגישה וספציפית ביותר23,24 , בדומה לשיטות אחרות אופטי, הוא פחות יקר מאשר שיטות אחרות של שחפת (TB) הדמיה25, לרבות טומוגרפיה (CT)26, מגנטי תהודה הדמיה (MRI)27, סי-טי טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET/CT F-FDG) F-fluorodeoxyglucose28. REF מנצל סובסטרטים או זוהרים פלורסנט מותאם אישית אשר בעת ביקוע על ידי אנזים בקטריאלי, לייצר את המוצר פלורסנט8,29. לפיכך, יש את היתרון של שאינם דורשים30,זן רקומביננטי כתב mycobacterial31. המצע סריג תיאר מורכבת fluorochrome כ'חטיף המחוברים באמצעות טבעת β-לקטם hydrolyzed מאת BlaC (β לקטמאז), באופן טבעי צורונים לידי מורכבת שחפת Mycobacterium8, 32. החיידק לייצר ישירות אות עקב פעילות קטליטית REF המאפשר הגברה על ידי רבים סדרי גודל, זיהוי רגיש של מ. שחפת.
המצע REF השתמשו במחקר זה יש חדירה מעולה רקמה בבעלי חיים, מופחתת רקע בשל אורך גל ארוך שלה. עם סובסטרט זה ארוך באורך הגל זה אפשרי להשיג את הסף של זיהוי עבור מ. שחפת של כמעט 100 מושבת יחידות (CFU) במבחנה , < 1000 CFU בריאות של עכברים ויוו (כל בעלי חיים)8, 33. שופט יכול לשמש ככלי אבחון עבור ברוק, חומרים קליני, אפילו ישירות בחולים עם מיקרו מערכות אנדוסקופי16,32,33,34 בשל רגישות גבוהה וספציפיות שלה. REF ניתן ליישם כל זן קליני של שחפת, כי היא משתמשת אנזים בקטריאלי המיוצר באופן טבעי, BlaC, לצורך זיהוי נוכח כל זני. מאפיינים אלו REF הדמיה כלי רב ערך במחקרים קליניים שחפת באופן כללי כדי להקל על טיפולית, חיסון הערכה, כמו גם ניתוח של פתוגנזה, אך ניתן להחיל גם בסופו של דבר את האבחנה של שחפת מטופלים.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>CNIR800</td><td>תמיסת Fatal Plus מסונתזת</td><td></td><td></td>בהתאמה אישית</tr><tr><td></td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 מרק מידלברוק</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>העשרת OADC Middlebrook</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Sporcidin</td><td></td><td>RE-1284F</td><td></td></tr><tr><td>7H11 Middlebrook Agar</td><td>BD</td><td>212203</td><td></td></tr><tr><td>Madison Chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-gas מערכת הרדמה Perkin</td><td>Elmer</td> Living Imaging Software Perkin Elmer <td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin</td><td>Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קונוסים לאף שקוף</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M. tuberculosis זן CDC1551</td><td>עכברי BALB</td>/C נקבות ATCC<td></td><td></td></tr><tr><td>, 5-7 שבועות</td><td>מעבדת</td><td></td><td></td> ג'קסון</tr></tbody></table>

הדמיה שחפת mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט) מנצל סובסטרטים ספציפיות עבור אנזימים המצויים אורגניזמים היעד עניין לדימות או זיהוי על-ידי קרינה פלואורסצנטית או ביולומינסנציה. אנו מנצלים BlaC, אנזים צורונים לידי כל זני מ. שחפת . REF מאפשר כימות מהירה של חיידקים בריאות של עכברים נגועים. לאותה הקבוצה של עכברים יכולים לדימות בנקודות זמן רבים, הפחתת עלויות, ספירת חיידקים מהר יותר, ומאפשר תצפיות הרומן באינטראקציות פתוגן-פונדקאי ו הגברת עוצמה סטטיסטית, מאז יותר חיות לכל קבוצה נשמרים בקלות מאוד . שופט הוא רגיש בשל אופיו קטליטי של הכתב אנזימטי BlaC מאוד מסוים עקב העברת האנרגיה של תהודה flourescence מותאם אישית (סריג) או fluorogenic סובסטרטים בשימוש. שופט אינו דורש זנים רקומביננטי, הבטחת אינטראקציות פתוגן-פונדקאי נורמלי. אנו מתארים ההדמיה של מ. שחפת זיהום באמצעות מצע סריג עם פליטות מקסימלי 800 ננומטר. אורך הגל של המצע מאפשר הדמיה רקמות עמוק רגיש אצל יונקים. אנחנו מתאר תרסיס זיהום של עכברים עם מ. שחפת, הרדמה של עכברים, הניהול של המצע REF, וכן הדמיה אופטית. שיטה זו הוחלה בהצלחה על הערכת פתוגן-פונדקאי אינטראקציות והיעילות של אנטיביוטיקה מיקוד מ. שחפת.

REF הדמיה של עכברים נגועים עם מ. שחפת יחד עם נגוע השליטה בעכבר מוצגות באיור איור 1א'. העכברים הנגועים המיוצר באופן משמעותי (P = 0.0057) אות גבוה יותר קרינה פלואורסצנטית מהריאות ב 6 שבועות לאחר הפגיעה לעומת שליטה על המצע המינהל. קורס טיפוסי זמן ללמוד את היעילות הטיפולית נגד מ. שחפת באמצעות שופט יכול להיות הדמיה בשבוע 1, 2, 4, 6, 15, 24 שעות לאחר הפגיעה. עוצמת קרינה פלואורסצנטית הוא לכמת באמצעות epi-תאורה בשביל לרקמות ריאות (איור 1B). האות באופן עקבי הולך וגדל משבוע 2 שבוע 6 בריאות של עכברים נגועים מציע REF זו בהצלחה יכול לזהות את מ. שחפת ויוו. ירידה האות רקע של בקרת עכברים בנקודת זמן מאוחרת יותר (איור 1B) ניתן לייחס את הגידול בגוף מסה ונפח של עכברים על פני תקופה של 6 שבועות, ובכך מקצר את החדירה גל עירור. שחזור תלת-ממד פליט של מקורות קרינה פלואורסצנטית עכברים נגועים מ. שחפת מיוצג באיור 2א. רצפי תמונות נרכשים בנקודות הטרנס-תאורה מרובים באמצעות עירור באותה סדרה של מסננים פליטת עכבר. רצפי תמונות אלה משמשים מכן שחזור תלת-ממד פליט להפצה פלורסנט מקור בתוך נושא בעלי חיים. איור 2 A-D מדגים לזרמים שונים (הפרונטליים, הווריד ו- transaxial) של העכבר טומוגרפיה עם ריאות איברים רישום. יעילות NTF מפות לבדיקת איכות שחזור מיוצגים איור 2E. NTF מאפשר הפחתה רקע זליגות אור הטרנס-תאורה תמונות באמצעות דימוי נוסף שנתפסו עם דחיסות נייטרלית מסנן. התמונה שצולמה עם המסנן עירור ספציפי (איור 2נמדד-E) הוא מנורמל לתמונה השידור נמדד עם פליטה באותו המסנן, מסנן פתוח עירור (איור 2E - מדומה) לתת האות המיוצר על ידי המצע לבד. דומה נמדד, מדומה NTF פרופיל יעילות הן אופקי (איור 2F) ופרופילים (איור 2G) אנכי עם כמעט 0% אחוז שגיאה (איור 2E-% שגיאה) מספק ראיות של שחזור תלת-ממד באיכות טובה עם חפצים מופחתת, אות משופרת לוקליזציה ורגישות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> איור 1 . הדמיה של מ. שחפת עם הפניה למעורר (א) אין ויוו הדמיה של עכברים uninfected, שנדבקו בשחפת מ - 2, 4 ו- 6 שבועות לאחר הפגיעה. סרגל הצבע מייצג את עוצמת האות פלורסנט בפוטונים לשניה לכל ס מ2 נמוך (צהוב) גבוהה (אדום). (ב) כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית של עכברים נגועים עם מ. שחפת. קרינה פלואורסצנטית ערכים עבור שני פקד (שחור), נגוע (אדום) מוצגים יחד עם שגיאת התקן עבור כל נקודת זמן. המשמעות של תוצאות נקבע על ידי סטודנטים t-לבדוק, p ערכים של &lt; 0.05 נחשבו משמעותית. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> איור 2 . שחזור תלת-ממד פליט של מקורות קרינה פלואורסצנטית עכברים נגועים בשחפת מ. טומוגרפיה העכבר ייצג לכיוונים שונים; א) הפרונטליים, ב) הווריד, ו- C) transaxial עם ריאות ד) איברים רישום. האזור תלת-ממד של הריבית (ROI) מיוצג קובייה אדומה בריאה למדידות מקור. (E) NTF יעילות מפות של נמדד, סימולציה לבדיקת איכות הבנייה מחדש. פרופיל יעילות NTF מדומה הסלסולים נמשל, לספק איכות טובה של שחזור תלת-ממד (דומה מדומה הסלסולים NTF יעילות). האות אנכי אופקי F) ו- G) פרופילים ייצוג נמדד (כחול), מדומה (אדום) NTF יעילות עיקול. הסורגים האדומים אופקיים ואנכיים מציינות את מיקום המקור. סרגל הצבע מייצג את עוצמת האות פלורסנט בפוטונים לשניה לכל ס מ2 נמוך (כחול) גבוהה (אדום). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

אנו מתארים את הדמיה אופטית של עכברים נגועים עם שחפת Mycobacterium (מ. שחפת) באמצעות כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט). פרוטוקול זה מאפשר את זיהוי רגיש וספציפי של מ. שחפת במודלים של בעלי חיים פרה-קליניים למחקר פתוגנזה, therapeutics וחיסון.

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

המטרה הכוללת של הליך הדמיה פלואורסצנטי של אנזים מדווח זה היא להקל על זיהוי רגיש וספציפי של מיקובקטריום טוברקולוזיס במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים לפתוגנזה, טיפולים ומחקר חיסונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השחפת, כולל מנגנוני אלימות של מיני חיידקים, כמו גם יצירת טיפולים והבנת חיסונים. אז היתרון העיקרי של הטכניקה הזו הוא שהיא מאפשרת לדמות את אותה קבוצת בעלי חיים בכמה נקודות זמן.זה מפחית מאוד את העלות, מאפשר לנו לחקור את האינטראקציות של הפתוגן המארח, וגם מגדיל את העוצמה הסטטיסטית מאחר שמספר רב יותר של חיות יכול להיות מוחזק בקלות בו זמנית. בתור התחלה, גדל כל חיידק M.tuberculosis במדיום MOADCTW ב-37 מעלות צלזיוס לצפיפות אופטית של 0.5 הנמדדת ב-600 ננומטר. כל ההליכים הכרוכים במניפולציה של חומרים זיהומיים חייבים להתבצע בתוך ארונות בטיחות ביולוגית או התקני בלימה פיזיים מאושרים אחרים.לאחר שמוכן, הכינו סדרה של אחד עד 10 דילולים של התרבות באותו מדיום. לאחר מכן, צלחו את הדילולים בשלוש פעמים על לוחות 7H11 סלקטיביים כדי לבצע קביעה מדויקת של ה-CFU. דגרו על הצלחות במשך ארבעה שבועות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס או עד שניתן יהיה לספור במדויק את המושבות כדי לקבוע את ה-CFU.לפני הגדרת חיסון, ודא תמיד שמכסה המנוע הביולוגי זורם אוויר במהירות של 50 ליטר לדקה. כדי להכין חיסון שיכול להדביק עד 90 עכברים, מדוד את ה-CFU הרצוי בצינור בז של 15 מיליליטר. בדרך כלל משתמשים בין 10,000 למיליון CFU.ואז גלולה את החיידקים. לאחר מכן שטפו את החיידקים פעם אחת עם 10 מיליליטר מי מלח. ואז השעו אותם ב -15 מילילטר מי מלח.לאחר מכן, בארון בטיחות ביולוגית, העמיסו את החיסון לצנצנת זכוכית שיכולה להתחבר לנבולייזר. לאחר מכן, חבר את יחידת הנבולייזר והתאם את צינור הנירוסטה האנכי כך שהקצה התחתון יהיה כרבע סנטימטר מתחת למניסקוס המתלה. כעת העבירו את המכלול לתא החיסון במיכל הובלה חסין דליפות.כדי להמשיך, העמיסו בעלי חיים במשקל ידוע לתוך תא החיסון המופעל. החדר יכול להכיל עד 90 עכברים. ואז סגור את כל התפסים בדלת.לאחר מכן, חבר את הנבולייזר באמצעות מהדק פלדה. לאחר מכן לחץ על כפתור ההתחלה בתא. והגדר את קצב זרימת האוויר בין שלושה לחמישה ליטר לדקה.האוויר הדחוס יזרום במהירות של כ-22 עד 26 פאונד לאינץ' רבוע וחשוב מכך שיהיה אפשר לראות את ערפל החיסון בתא. לאחר 15 דקות תופיע נורה אדומה בחזית לוח הבקרה ואות קולי יציין את סיום הריצה. לאחר מכן לחץ על לחצן האיפוס כדי לאפס את הטיימרים.כדי לשחרר את הוואקום, לחץ על הכפתור האדום הקטן בדלת החדר. לאחר מכן פתח את דלת החדר והחזיר את העכברים לכלובי הבית שלהם. בהמשך, החזיקו את החיות בחדר ההכלה.לאחר מכן החזירו את הצנצנת ואת מיכל ההובלה לארון הבטיחות הביולוגית. שם, השליכו את תרחיף החיידקים שנותר למיכל פסולת ייעודי. לאחר מכן הניחו את צנצנת הנבולייזר המשומשת בתוך שקית ביולוגית ואטמו את השקית להובלה לחיטוי.כדי לנקות את החדר, יש לרסס את המשטחים הפנימיים בפנול חוצץ ואתנול 70%. אפשר לפתרונות אלה להגיב על משטחים אלה למשך 10 דקות. לאחר מכן נגב אותם ביסודיות.השלך את כל המגבונים לאשפה הביולוגית. לאחר מכן חיטוי האשפה, מיכל הפסולת וצנצנות נבולייזר משומשות. העבירו את בעלי החיים לחדר ההדמיה.שם, יש להרדים בעל חיים על פי פרוטוקול הטקסט ולהזריק לו מצע ניגוד על ידי הזרקה תוך צפקית. בתוכנת מערכות ההדמיה, אתחל את המערכת והמשך כאשר סרגל הטמפרטורה הופך לירוק. לאחר אתחול המערכת, הנח את העכבר בתא ההדמיה.ודא שהנחיריים שלו נמצאים בתוך חרוט האף כך שהוא יקבל חומר הרדמה במהלך ההדמיה. כעת חזור למחשב. בלוח הבקרה של הרכישה, בחר פלואורסצנטיות, טרנסה-אור, להדמיה של בעלי חיים שלמים, או אפי-תאורה לצפייה ברקמות הריאה.עבור עכבר בודד, הגדר את שדה הראייה ל-B ואת מפלס המנורה לגבוה. עבור החשיפה, השתמש בזמן אוטומטי, בשילוב בינוני ובשניים או שלושה עבור F/Stop. לאחר מכן הגדר את מסנן העירור ל-745 ננומטר ומסנני פליטה מ-780 עד 840 ננומטר.לאחר מכן, עבור להגדרת הרצף ובחר תשע עד 12 נקודות הדלקה באזור העניין. כעת לחץ על כפתור הרכישה כדי לאסוף תמונות. ניתוח תמונות מכוסה בפרוטוקול הטקסט.כדי לנתח את היקף הזיהום, המתת חסד של העכבר באמצעות נתרן פנטוברביטל. הקפד לבדוק אם יש רפלקס דוושה כדי להבטיח שהחיה מורדמת. ואז לשתול את הריאות באמצעות דיסקציה סטנדרטית.לאחר מכן הומוגניזציה של רקמת הריאה במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן בצע דילול סדרתי פי עשרה של ההומוגנין באמצעות PBS. צלחת את ההומוגניות המדוללת בשלוש עותקים ודגירה על הצלחת ב -37 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לספור מושבות.לאחר מכן השתמש בציון CFU כדי למדוד את חומרת הזיהום. העכברים טופלו כמתואר. נעשה שימוש במצע REF כדי לצפות בהתקדמות של M.tuberculosis.הקרינה כומתה באמצעות טרנסאורציה. וזה עלה משבוע שני לשבוע שישי בעכברים הנגועים. ניתן לייחס את הירידה הקלה באות בעכברי הביקורת לעלייה במסת הגוף ובנפח במהלך ששת השבועות.שחזור FLIT תלת מימדי של מקורות פלואורסצנטיים נעשה ממספר נקודות טרנס-הארה תוך שימוש באותה עירור וסדרה של מסנני פליטה. מפות יעילות NTF נעשו כדי לבדוק את איכות השחזור. התמונה שצולמה ממסנן העירור הספציפי נורמלה לתמונת השידור שנעשתה עם אותו מסנן פליטה ומסנן עירור פתוח.זה מספק אות המופק על ידי המצע בלבד. כמעט ולא הייתה טעות בשחזור. בחינת יעילות ה-NTF של הנתונים הן במבט האופקי והן במבט האנכי הראתה מתאם הדוק.לפיכך, לשחזור התלת-ממדי היו מעט חפצים, מיקום אותות משופר ורגישות משופרת בהשוואה לשיטות אחרות. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום השחפת לחקור את היעילות הטיפולית של תרופות נגד מיקובקטריום טוברקולוזיס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להדביק עכברים באמצעות נתיב אירוסול עם מיקובקטריום טוברקולוזיס עם הדמיה אופטית מעקב באמצעות מצע REF.

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטות הדמיה של פליטת אור זיהומים חיידקיים בבעלי חיים החיים המתוארים. פתוגנים הם שונה להביע בלוציפראז הדמיה אופטית המאפשרת לגוף שלם של זיהומים בבעלי חיים. במודלים של בעלי חיים יכול להיות נגוע פתוגנים להביע בלוציפראז ואת כמובן כתוצאה של המחלה דמיינו בזמן אמת על ידי הדמיה פליטת אור.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

מקור: דה וריס, ס. ר. ואח', מודל חיסון מאוחר של זיהום פצע כרוני בפסאודומונס אארוגינוסה . J. Vis. Exp. (2020).הסרטון הזה מדגים טכניקת הדמיה ביולומינצנטית למעקב אחר התקדמות זיהום חיידקי במודל עכבר חי. חיידקים פתוגניים שהונדסו באמצעות מערכת הדיווח luxABCDE פולטים אור באתר הזיהום, ומאפשרים ויזואליזציה של חיידקים פעילים מטבולית. על ידי הדמיית העכבר לאורך זמן, החוקרים יכולים לעקוב באופן לא פולשני אחר דינמיקת הזיהומים ולכמת את עוצמת האות הביולומינצנטי.

הדמיית ביולומינסציה של זיהומים חיידקיים בעכברים

מקור: ולנטיין, מ. א. ואחרים, יצירת מוטנטים למחיקת גנים בתוך המסגרת ב-Pseudomonas aeruginosa ובדיקת החלשת אלימות במודל פשוט של זיהום בעכברים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את השימוש בגישה של הדמיה מבוססת ביולומינסצנציה לניטור זיהום חיידקי במודל עכבר חי. הדמיה ביולומינצנטית רציפה וצילום רנטגן מאפשרת הדמיה בזמן אמת ומיקום אנטומי של הזיהומים המתפשטים ברחבי המארח.

הדמיה בזמן אמת של זיהום חיידקי במודל עכבר באמצעות ביולומינסציה

מקור: בהרה, ר. ק. ואחרים. שיטה מבוססת פלואורסצנציה לחקר ויסות גנים של חיידקים ברקמות נגועות. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים שיטה להכנת רקמת כליה נגועה בעכברים, צביעת DNA וזיהוי ביטוי גנים של חיידקים באמצעות דיווחים פלואורסצנטיים כפולים. אדום מסמן את כל החיידקים, והירוק מדגיש תאים המגיבים לזיהום.

הדמיית פלואורסצנציה של קולוניזציה חיידקית ברקמת כליה בעכברים

סרטון זה מדגים את ההדמיה הפלואורסצנטית של אנזים הכתב (REF) לזיהוי in vivo של זיהום Mycobacterium tuberculosis. העכברים הנגועים מוזרקים תוך צפקית עם מצע להדמיית REF. עם הידרוליזה על ידי אנזים חיידקי β-לקטמאז, המצע פולט פלואורסצנטיות, אשר זיהויה מסייע להערכת זיהום.

כתב הדמיית אנזים פלואורסצנטי למעקב In Vivo אחר זיהום חיידקי

סרטון זה מדגים שיטה למעקב אחר זיהומים נגיפיים במודלים של עכברים באמצעות וירוס רקומביננטי של לוציפראז וחלבון פלואורסצנטי המבטא חלבון פלואורסצנטי שפעת A. שיטה זו מאפשרת הן מחקרי in vivo והן מחקרי ex vivo, ומאפשרת לחוקרים לקבל תובנות לגבי דינמיקה נגיפית והשפעות של התערבויות.

וירוס שפעת של כתב לוציפראז-פלואורסצנטי למעקב אחר זיהומים ויראליים

הדמיה רבת שיטה היא גישה יקרת ערך לחקר התישבות חיידקים במודלים של בעלי חיים קטנים. פרוטוקול זה מתאר זיהום של עכברים עם...

הדמיה של multimodality 4D<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; זיהומים בעכברים

בשילוב הדמיה אופטית וμCT במודל של עכברים של זיהום שתל אורתופדים, ניצול זן מהונדס bioluminescent של Staphylococcus aureus, סיפק את היכולת noninvasively ואורכים כדי לפקח על הדינמיקה של זיהום החיידקים, כמו גם את התגובה הדלקתית המקבילה ושינויים אנטומיים ב עצם.

בשילוב<em&gt; בvivo</em&gt; אופטי וμCT הדמיה למעקב אחר זיהום, דלקת, ועצם אנטומיה בזיהום אורטופדיים שתל בעכברים

המתוארים כאן היא שיטה לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים ברמה התאית. שיטה זו מספקת משאב ללמוד את הגיוון פנוטיפי המתרחשים בתוך אוכלוסיה חיידקי בתגובה הסביבה רקמות במהלך זיהום.

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

שפעת וירוסים (IAVs) הם פתוגנים הנשימה מדבקת הגורמות מגיפה שנתית ומדי פעם גיפות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר זיהומים ויראליים בvivo באמצעות רומן רקומביננטי לוציפראז והבעת הביטוי הדו-כתבת b IAV (בירפעת). גישה זו מספקת לחוקרים כלי מצוין כדי ללמוד IAV ב-vivo.

לוציפראז-כתבת פלורסנט וירוס שפעת עבור הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של Mycobacterium tuberculosis המאושר על ידי BSL-2 מוחלש. מאמץ בריאה העכברית באמצעות חלון ריאה קבוע. גישה זו מאפשרת ניתוח אורך ברזולוציה תאית אחת של אינטראקציות מוקדמות בין מארח לפתוגן, כולל מיקום חיידקים, דינמיקת כלי דם וספיגת מקרופאגים באותה מיקרוסביבה ריאתית.

הדמיה תוך-חיונית של מיקובקטריום טוברקולוזיס אוקסוטרופי מוחלש בריאות עכברי במהלך זיהום תוך-כלי מוקדם

למד הדמיה אופטית של שחפת Mycobacterium tuberculosis בעכברים באמצעות קרינה פלואורסצנטית של אנזים מדווח. שיטה זו מאפשרת גילוי רגיש וספציפי של החיידק במודלים טרום-קליניים, ותומכת במחקר מנגנוני פתוגנזה, תרפיות וחיסונים נגד שחפת.

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

גלה סרטונים נוספים