הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אילו אזורים של mRNA מתורגמים לחלבונים למדוד כמותית את תרגום החלבון בשמרים ניצנים saccharomyces cerevisiae ברמת הגנום כולו. ניתן להשתמש בפרופיל ריבוזום כדי לנטר את קצב החלבונים והמחלות ולחקור את מנגנוני הבקרה התרגומיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מוסיפה רגישות הרבה יותר גדולה בהשוואה לשיטות אחרות, ומתוכן, מדידת חלבונים ומחלות in vivo ברזולוציית מגע בודד.

למרות שפרוטוקול זה ספציפי לשמרים מתפתחים, הוא שימושי גם לחוקרים המנסים לבסס פרופיל ריבוזום במערכות מודל אחרות, כגון תאי יונקים ורקמות. תמציות יוכנו מתאי שמרים שגדלו עד אמצע שלב העץ. השתמש במכלול מסנן מחזיק זכוכית כדי לסנן את התרבית דרך מסנני מיקרוממברנה של 0.45

מגרדים את הגלולה בעזרת המרית, מקפיאים בחנקן נוזלי ושומרים במינוס 80 מעלות צלזיוס. הכניסו שלושה חרוזי פלדת כרום 3.2 מילימטר לצינור נירוסטה של 1.8 מיליליטר וצננו מראש את הצינור בחנקן נוזלי. מוסיפים את הכדורים הקפואים ומכסים את צינור הפלדה במכסה גומי סיליקון.

הומוגניזציה של הדגימה על ידי טחינה קריו למשך 10 שניות ב-4200 סל"ד. כדי לשמור על הדגימות קפואות במהלך כל הליך הטחינה, קריטי לצנן את הצינור בחנקן נוזלי למשך 10 שניות לפחות בין כל טחינה. בסיום ההומוגניזציה, הוסף לדגימה מיליליטר אחד של מאגר ליזה המכיל ציקלוהקסימיד.

מערבבים היטב על ידי פיפטינג ומעבירים את הדגימה לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר.

העבירו 100 מיקרוליטר ליזאט לצינור חדש אחר של 1.5 מיליליטר לבידוד poly(A)mRNA. הבזק הקפיא את הצינורות עם דגימות ה-mRNA על שאר הליזאט, שישמש למיצוי טביעת רגל בחנקן נוזלי, ויאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. בלילה שלפני מיצוי טביעת הרגל, הפשירו בעבר שיפועי סוכרוז שהוכנו בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, הפשירו את התא ליזאט על קרח. העבירו כמות גדולה של ליזאט תאים המכיל 50 יחידות OD260 לצינור חדש של 1.5 מיליליטר, הוסיפו מאגר ליזה טרי עד מיליליטר אחד ו-10 מיקרוליטר של RNase אחד. דגירה בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין על מסובב ראש מעל עקבים למשך שעה.

לאחר מכן, שכבו בעדינות את דגימת הליזאט על גבי שיפוע סוכרוז של 10% עד 50% בצינורות פולימרים. באמצעות רוטור טי SW41, אולטרה צנטריפוגה ב-35,000 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. במהלך האולטרה צטריפוגה, הגדר את מערכת פיצול השיפוע.

הפעל את הרכיבים ואפשר לצג ה-UV להתחמם למשך 30 דקות לפחות. מלאו את המזרק בתמיסת מרדף והסירו את כל בועות האוויר בתוך המזרק והצינורית. לאחר השלמת האולטרה-צנטריפוגה, התקן ונקב את צינור האולטרה-צנטריפוגה המכיל את שיפוע הסוכרוז.

הפעל את משאבת המזרק במיליליטר אחד לדקה ואסוף שברים של מיליליטר תוך ניטור ערכי A254. שברים המייצגים את שיא המונוזום של ADS נאספים ומאוגדים. מסננים את השברים דרך מסננים צנטריפוגליים של 0.5 מיליליטר ב-12, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, זורקים את הזרימה וחוזרים על הפעולה עד שהנפח קטן מ-100 מיקרוליטר.

ב-400 מיקרוליטר של מאגר שחרור מעורבב על ידי פיפטינג ודגירה על קרח למשך 10 דקות, העבירו את היחידה לצינור איסוף וצנטריפוגה חדשים ב-12,000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אסוף את הזרימה. לאחר מכן, טהר את שברי טביעת הרגל וזרז את הדגימות באמצעות משקעי אתנול כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כדי להתחיל בהליך זה, צנטריפוגה את טביעת הרגל המשקעת ודגימות mRNA מקוטעות ב-20, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הסרת אתנול וייבוש הכדורים באוויר, אנו משעים כל כדור ב-7.75 מיקרוליטר מים. לכל גלולה, הוסף מיקרוליטר אחד של מאגר פולינוקלאוטיד קינאז 10XT4, מיקרוליטר אחד של T4 פולינוקלאוטיד קינאז ו-0.25 מיקרוליטר של מעכב RNase.

דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר דגימת אוריאה 2X TBE ל-10 מיקרוליטר מכל טביעת רגל ודגימת mRNA. דגרו את הדגימות והבקרות המתאימות ב-75 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, סובבו והניחו קרח למשך דקה.

טען כל דגימה לשתי בארות של ג'ל אוריאה 15% TBE והפרד את שברי ה-RNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל ב-180 וולט למשך שעה. מכתים את הג'ל בכתם ג'ל חומצת גרעין, מוגן מפני אור למשך חמש דקות. תוך כדי הדמיית הג'ל תחת טרנסמאייטור אור כחול, הסר את הרצועה המתאימה בין 28 ל-32 נוקלאוטידים עבור דגימות טביעת רגל וכ-50 עד 70 נוקלאוטידים עבור דגימות mRNA.

הקפיאו את חתיכות הג'ל הפוליאקרילאמיד שנכרתו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות לפני חילוץ RNA מג'ל הפוליאקרילאמיד. לפני שעתוק הפוך, בצע שלוש קשירת מתאם ראשוני וזרז את הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השעו מחדש כל כדור ב-11.5 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז.

לאחר מכן הוסף 0.5 מיקרוליטר של שמונה פריימר שעתוק הפוך מיקרומולרי ומיקרוליטר אחד של תערובת dNTP. דגרו בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ולאחר מכן הניחו על קרח. לכל דגימה, הוסף ארבעה מיקרוליטר של מאגר גדיל ראשון פי 5, שני מיקרוליטרים של 0.1 DTT מולרי, 0.5 מיקרוליטר של מעכב RNase ו-0.5 מיקרוליטר של טרנסקריפטאז הפוך.

דגירה בחום של 48 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 65 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ו-80 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. המשך מיד להידרוליזה של RNA על ידי הוספת 0.8 מיקרוליטר של שני נתרן הידרוקסיד מולארי לכל דגימה ודגירה בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף 0.8 מיקרוליטר של שני מימן כלורי מולארי כדי לנטרל את התגובה.

לאחר זירוז הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, השעו מחדש כל גלולה בחמישה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של מאגר דגימת אוריאה 2x TBE. דוגרים בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, מסתובבים וקרח למשך דקה. טען את הדגימה בבאר אחת של ג'ל אוריאה 10% TBE.

הפרד את תוצרי תגובת השעתוק ההפוך על ידי אלקטרופורזה של ג'ל 180 וולט למשך 50 דקות. מכתים את הג'ל בכתם ג'ל חומצת גרעין המוגן מפני אור למשך חמש דקות. בעזרת טרנסמאייטור אור כחול, כרתו את הרצועה סביב 128 נוקלאוטידים ומעלה.

הקפיאו את חתיכות הג'ל הפוליאקרילאמיד במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות לפני חילוץ ה-DNA מג'ל הפוליאקרילאמיד. כדי להקיף את ה-DNA, השעו מחדש כל כדור DNA ב-16.75 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. הוסף שני מיקרוליטר של מאגר ליגאז DNA חד-גדילי פי 10, מיקרוליטר אחד של 50 מילי-מולרי מנגן כלוריד, ו-0.25 מיקרוליטר של DNA ליגאז חד-גדילי.

דגירה בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ללא משקעים, אחסן את תוצר תגובת קשירת ה-DNA החד-גדילי במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בצע הגברה של ספריית PCR ואחריה כימות ספרייה ורצף תפוקה גבוה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

מוצגים פרופילי מנתח ביולוגי מייצגים של ספריית טביעת הרגל המוגברת של PCR וספריית הריצוף המתקבלת עבור דגימות mRNA. הגודל הממוצע הצפוי של ספריית טביעת הרגל הוא 148 עד 152 נוקלאוטידים, והגודל הצפוי של ספריית ה-mRNA הוא 170 עד 190 נוקלאוטידים. גרף זה מציג את המספר המשולב של קריאות mRNA, טביעת רגל ו-rRNA שהתקבלו עבור שני שכפולים ביולוגיים בלתי תלויים של דגימה מסוג בר ומוטנט מחיקת hbs1.

50% עד 60% מכל הקריאות הרצופות בספריות טביעת הרגל תואמות לשברי טביעת רגל מוגנים בריבוזום. לעומת זאת, רק 3% מקטעי rRNA נצפו בספריות mRNA, מה שמדגים כי בידוד poly(A)mRNA מאפשר חיסול יעיל של קריאות rRNA. גם ספריות טביעת הרגל וגם ספריות דגימות mRNA מציגות יכולת שחזור טובה כפי שמצוין על ידי מקדם מתאם פירסון של כ-0.99 בין דגימות תואמות.

בשילוב עם מדידות שפע mRNA, פרופיל ריבוזום מאפשר למדוד שינויים ביעילות התרגום בין תנאי הניסוי. גנים מווסתים באופן משמעותי במוטציה של מחיקת hbs1 מקובצים בהתאם לשאלה אם הם מושפעים משינוי בשעתוק mRNA, יעילות התרגום או מהשפעה משותפת. לאחר השליטה, ניתן לבצע את הפרוטוקול כולו תוך כ-11 ימים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ללבוש כפפות ולבצע את כל השלבים באמצעות ריאגנטים וחומרים מתכלים ללא RNase כדי למנוע זיהום RNase ולהפחית את הסיכון לפירוק RNA בדגימות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור טביעות רגל ריבוזומיות באמצעות עיכול נוקלאז, לבודד קומפלקסים שלמים של טביעת רגל ריבוזומית על ידי פיצול שיפוע סוכרוז, ולהכין ספריות DNA לריצוף עמוק. אל תשכח שעבודה עם חנקן נוזלי עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הרכבת משקפי בטיחות וכפפות קריו בעת טיפול בחומרים קרים במיוחד.