Name: הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: חקור פרופיל ריבוזום לכימות תרגום בגנום השלם בשמרים Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת ניתוח רגיש של קצבי תרגום חלבונים ומנגנוני ויסות תרגומי ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים AG040191 ו- AG054566 כדי VML. מחקר זה נערך בזמן VML היה נמען מענק מחקר עפר מן הפדרציה האמריקאית לחקר הזדקנות.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li>
<li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anota%3A+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboDiff%3A+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li>
<li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194(2016).</li>
<li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li>
<li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboProfiling%3A+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309(2016).</li>
<li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid%3A+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).</li>
<li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li>
<li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li>
<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li>
<li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li>
<li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+poly%28A%29+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li>
<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

הגישה Ribo-Seq התפתחה טכנולוגיה רבת עוצמה לניתוח של mRNA תרגום ויוו הגנום כולו ברמה 3. מחקרים באמצעות גישה זו, אשר מאפשר ניטור תרגום עם רזולוציה יחיד-codon, תרם להבנת translational רגולציה. למרות יתרונותיה, Ribo-Seq יש מספר מגבלות. שברי Ribosomal RNA (rRNA) הם תמיד מטוהרים במשותף במהלך בידוד עקבות המוגנים ריבוזום להקטין את התשואה של קריאות רצף שימושי שניתן להשיג Ribo-Seq ניסויים 9,25. הנתונים שלנו להפגין כי rRNA זיהום יכול לתרום כ...

תרגום ה-mRNA הוא אחד התהליכים הבסיסיים בתא, אשר ממלא תפקיד חשוב בוויסות ביטוי חלבון. לפיכך, תרגום mRNA מפוקחת בתגובה לגירויים פיזיולוגיים שונים פנימיים וחיצוניים 1,2. עם זאת, מנגנוני רגולציה translational נשארים understudied. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור כימות ברמת הגנום של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום. המטרה הכוללת של ריבוזום פרופיל הטכניקה היא ללמוד ולכמת את התרגום של mRNAs ספציפיים בתנאים שונים הסלולר. שיטה זו משתמשת הדור הבא רצפי לנתח באופן כמותי את הריבוזום תפוסה ברחבי הגנום ומאפשרת ניטור הקצב של חלבון סינתזה ויוו codon יחיד ברזולוציה 3,4. כיום, בשיטה זו מספק את האמצעים המתקדמים ביותר למדוד את הרמות של תרגום החלבון, הוכיחה להיות כלי גילוי שימושי להצגת מידע אשר אינם יכולים להתגלות על ידי טכניקות אחרות הזמינות כעת, למשל מיקרו-מערכים או תרגום המדינה מערך ניתוח (TSAA) 5. כמו הריבוזום פרופיל דוחות על שינויים בשילוב רמות התעתיק והפלט translational, הוא גם מספק הרבה רגישות לעומת שיטות אחרות.
גישה זו מבוססת על רצף עמוק של המוגנים ריבוזום mRNA שברי 3. במהלך תרגום החלבון, ריבוזומים להגן על ~ 28 חלקים nt של mRNA (הנקרא עקבות) 6. על-ידי קביעת הרצף של השברים המוגנים ריבוזום, Ribo-Seq ניתן למפות את המיקום של הריבוזומים על mRNA מתורגם, לזהות באילו אזורים של mRNA נוטים להיות מתורגם באופן פעיל חלבון 3,7. בנוסף, אנו יכולים באופן כמותי למדוד את התרגום של mRNA על-ידי ספירת מספר עקבות, ליישר תעתיק mRNA נתון.
על מנת לבודד את השברים המוגנים ריבוזום, lysates תא מטופלים בתחילה עם מעכב תרגום לעכב הריבוזומים ואחריו ribonuclease לעיכול. ואילו mRNA וחופשית חלקים מתורגם mRNAs אינו מוגן על ידי הריבוזומים הם נפגמים בשל ribonuclease, ניתן לשחזר השברים mRNA המוגנים ריבוזום וטיהור מתחמי הריבוזום שלם-טביעת רגל. עקבות אלה mRNA שהוסב ספריית cDNA, ואז נותחו על ידי רצף עמוק (איור 1). במקביל ריבוזום פרופיל, שלם mRNA המופק באותה דגימת זרע, וסודרו. על ידי השוואת רמת התרגום המזוהה על-ידי Ribo-Seq עם מדידות שפע mRNA, אנו יכולים לזהות גנים הנמצאים במפורש למעלה או למטה-מוסדר ברמה של תרגום, לחשב יעילות התרגום של mRNA ברמת הגנום כולו. בעוד הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא ספציפי שמרים, זה צריך להיות גם שימושי עבור חוקרים מי ינסה ליצור פרוטוקול Ribo-Seq במערכות אחרות.

<table><tbody><tr><td>0.45 &mu; מסנני ממברנה</td><td>M Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ל מסננים צנטריפוגליים (100 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 ב-4&deg; C)</td> <td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10% TBE-urea gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15% TBE-urea ג'ל</td><td>Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X TBE-urea מאגר דגימה</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc, pH 5.5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenylase (10 U/&mu; L)</td> <td>Epicentre</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X חומצת גרעין מאגר טעינת דגימה</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8% TBE ג'ל</td><td>Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>חומצה-פנול: כלורופורם, pH 4.5 (עם IAA, 125: 24: 1)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>משדר אור כחול</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי פלדת כרום, 3.2 מ"מ</td><td>מוצרי BioSpec</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>CryoGrinder</td><td>מוצר Biospec</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>מערכת רכישת נתונים</td><td>DATAQ Instruments</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>תערובת תמיסות דאוקסינוקלאוטיד (dNTP) (10 מ"מ)</td> <td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>מערכת פיצול שיפוע</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>DNA פולימראז בנאמנות גבוהה (2,000 U/mL)</td> <td>NEB</td><td>M0530S</td><td>מסופק עם 5X Phusion HF</td></tr><tr><td>Buffer ערכת כימות ספריית ריצוף מהדור הבא</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>כתם ג'ל חומצת גרעין</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד mRNA פולי (A)</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J exonuclease (10 U/&mu; L)</td> <td>Epicentre</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>Reverse transcriptase (200 U/&mu; L)</td> <td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>מסופק עם מאגר גדיל ראשון פי 5 ומאגר פיצול RNA של 0.1 M DTT</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNase I (100 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase (20 U/&mu; L)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>מכסי גומי סיליקון</td><td>BioSpec Products</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA ligase (100 U/&mu; L)</td> <td>Epicentre</td><td>CL9021K</td><td>מסופק עם מאגר 10X CircLigase II ו-50 מ"מ MnCl2</td></tr> <tr><td>נירוסטה, 1.8 מ"ל</td><td>מוצרי BioSpec</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 רוטור</td><td>Ti בקמן קולטר</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td> מערכות <td>משאבות עידן חדש</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>T4 פולינוקלאוטיד קינאז (10,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>מסופק עם 10X T4 מאגר פולינוקלאוטיד קינאז</td></tr><tr><td>T4 RNA ליגאז 2 KQ קטום (200,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0373S</td><td>מסופק עם 10X T4 RNA ligase buffer ו-50% PEG8000</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליאלומר דקים, 13.2 מ"ל</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td>צג UV <td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae זן BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

תרגום של mRNA לחלבונים הוא תהליך מורכב מעורבים בכמה שכבות של רגולציה. לעיתים קרובות ההנחה כי השינויים בתעתיק mRNA לשקף שינויים בסינתזה של חלבון, אך נצפו חריגות רבות. לאחרונה, טכניקה שנקראת פרופיל הריבוזום (או Ribo-Seq) התפתחה שיטה רב עוצמה המאפשר זיהוי, עם רמת דיוק גבוהה, באילו אזורים של mRNA מתורגמים חלבונים, כימות של תרגום ברמת הגנום כולו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מוכללת על הגנום כולו כימות של תרגום באמצעות Ribo-Seq ניצני שמרים. בנוסף, שילוב של Ribo-Seq נתונים עם מדידות שפע mRNA מאפשר לנו בו זמנית לכמת יעילות התרגום של אלפי mRNA תעתיקים במדגם זהה ולהשוות בין שינויים בפרמטרים האלה בתגובה ניסיוני מניפולציות או במצבים פיזיולוגיים שונים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור הדור של ריבוזום עקבות שימוש נוקלאז עיכול, בידוד של הריבוזום שלם-טביעת מתחמי ויה fractionation הדרגתיות סוכרוז, והכנה של ספריות DNA רצף עמוק יחד עם המתאים פקדים איכות הדרושים כדי להבטיח ניתוח מדויק של תרגום ויוו .

צינורות מפורט לניתוח bioinformatic של ריבוזום פרופיל נתונים היו כפי שתוארה לעיל 8,9. בנוסף, מספר קבוצות מחקר פיתחו ושפור דיפרנציאלית של הביטוי מפענוח ועיבוד של רצף נתונים, שהם ספציפיים ריבוזום פרופיל שיטת 10,11,12 ,13,14,15,</sup...

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אילו אזורים של mRNA מתורגמים לחלבונים למדוד כמותית את תרגום החלבון בשמרים ניצנים saccharomyces cerevisiae ברמת הגנום כולו. ניתן להשתמש בפרופיל ריבוזום כדי לנטר את קצב החלבונים והמחלות ולחקור את מנגנוני הבקרה התרגומיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מוסיפה רגישות הרבה יותר גדולה בהשוואה לשיטות אחרות, ומתוכן, מדידת חלבונים ומחלות in vivo ברזולוציית מגע בודד.למרות שפרוטוקול זה ספציפי לשמרים מתפתחים, הוא שימושי גם לחוקרים המנסים לבסס פרופיל ריבוזום במערכות מודל אחרות, כגון תאי יונקים ורקמות. תמציות יוכנו מתאי שמרים שגדלו עד אמצע שלב העץ. השתמש במכלול מסנן מחזיק זכוכית כדי לסנן את התרבית דרך מסנני מיקרוממברנה של 0.45.מגרדים את הגלולה בעזרת המרית, מקפיאים בחנקן נוזלי ושומרים במינוס 80 מעלות צלזיוס. הכניסו שלושה חרוזי פלדת כרום 3.2 מילימטר לצינור נירוסטה של 1.8 מיליליטר וצננו מראש את הצינור בחנקן נוזלי. מוסיפים את הכדורים הקפואים ומכסים את צינור הפלדה במכסה גומי סיליקון.הומוגניזציה של הדגימה על ידי טחינה קריו למשך 10 שניות ב-4200 סל"ד. כדי לשמור על הדגימות קפואות במהלך כל הליך הטחינה, קריטי לצנן את הצינור בחנקן נוזלי למשך 10 שניות לפחות בין כל טחינה. בסיום ההומוגניזציה, הוסף לדגימה מיליליטר אחד של מאגר ליזה המכיל ציקלוהקסימיד.מערבבים היטב על ידי פיפטינג ומעבירים את הדגימה לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר.העבירו 100 מיקרוליטר ליזאט לצינור חדש אחר של 1.5 מיליליטר לבידוד poly(A)mRNA. הבזק הקפיא את הצינורות עם דגימות ה-mRNA על שאר הליזאט, שישמש למיצוי טביעת רגל בחנקן נוזלי, ויאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. בלילה שלפני מיצוי טביעת הרגל, הפשירו בעבר שיפועי סוכרוז שהוכנו בארבע מעלות צלזיוס.למחרת, הפשירו את התא ליזאט על קרח. העבירו כמות גדולה של ליזאט תאים המכיל 50 יחידות OD260 לצינור חדש של 1.5 מיליליטר, הוסיפו מאגר ליזה טרי עד מיליליטר אחד ו-10 מיקרוליטר של RNase אחד. דגירה בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין על מסובב ראש מעל עקבים למשך שעה.לאחר מכן, שכבו בעדינות את דגימת הליזאט על גבי שיפוע סוכרוז של 10% עד 50% בצינורות פולימרים. באמצעות רוטור טי SW41, אולטרה צנטריפוגה ב-35,000 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. במהלך האולטרה צטריפוגה, הגדר את מערכת פיצול השיפוע.הפעל את הרכיבים ואפשר לצג ה-UV להתחמם למשך 30 דקות לפחות. מלאו את המזרק בתמיסת מרדף והסירו את כל בועות האוויר בתוך המזרק והצינורית. לאחר השלמת האולטרה-צנטריפוגה, התקן ונקב את צינור האולטרה-צנטריפוגה המכיל את שיפוע הסוכרוז.הפעל את משאבת המזרק במיליליטר אחד לדקה ואסוף שברים של מיליליטר תוך ניטור ערכי A254. שברים המייצגים את שיא המונוזום של ADS נאספים ומאוגדים. מסננים את השברים דרך מסננים צנטריפוגליים של 0.5 מיליליטר ב-12, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, זורקים את הזרימה וחוזרים על הפעולה עד שהנפח קטן מ-100 מיקרוליטר.ב-400 מיקרוליטר של מאגר שחרור מעורבב על ידי פיפטינג ודגירה על קרח למשך 10 דקות, העבירו את היחידה לצינור איסוף וצנטריפוגה חדשים ב-12,000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אסוף את הזרימה. לאחר מכן, טהר את שברי טביעת הרגל וזרז את הדגימות באמצעות משקעי אתנול כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כדי להתחיל בהליך זה, צנטריפוגה את טביעת הרגל המשקעת ודגימות mRNA מקוטעות ב-20, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הסרת אתנול וייבוש הכדורים באוויר, אנו משעים כל כדור ב-7.75 מיקרוליטר מים. לכל גלולה, הוסף מיקרוליטר אחד של מאגר פולינוקלאוטיד קינאז 10XT4, מיקרוליטר אחד של T4 פולינוקלאוטיד קינאז ו-0.25 מיקרוליטר של מעכב RNase.דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר דגימת אוריאה 2X TBE ל-10 מיקרוליטר מכל טביעת רגל ודגימת mRNA. דגרו את הדגימות והבקרות המתאימות ב-75 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, סובבו והניחו קרח למשך דקה.טען כל דגימה לשתי בארות של ג'ל אוריאה 15% TBE והפרד את שברי ה-RNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל ב-180 וולט למשך שעה. מכתים את הג'ל בכתם ג'ל חומצת גרעין, מוגן מפני אור למשך חמש דקות. תוך כדי הדמיית הג'ל תחת טרנסמאייטור אור כחול, הסר את הרצועה המתאימה בין 28 ל-32 נוקלאוטידים עבור דגימות טביעת רגל וכ-50 עד 70 נוקלאוטידים עבור דגימות mRNA.הקפיאו את חתיכות הג'ל הפוליאקרילאמיד שנכרתו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות לפני חילוץ RNA מג'ל הפוליאקרילאמיד. לפני שעתוק הפוך, בצע שלוש קשירת מתאם ראשוני וזרז את הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השעו מחדש כל כדור ב-11.5 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז.לאחר מכן הוסף 0.5 מיקרוליטר של שמונה פריימר שעתוק הפוך מיקרומולרי ומיקרוליטר אחד של תערובת dNTP. דגרו בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ולאחר מכן הניחו על קרח. לכל דגימה, הוסף ארבעה מיקרוליטר של מאגר גדיל ראשון פי 5, שני מיקרוליטרים של 0.1 DTT מולרי, 0.5 מיקרוליטר של מעכב RNase ו-0.5 מיקרוליטר של טרנסקריפטאז הפוך.דגירה בחום של 48 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 65 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ו-80 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. המשך מיד להידרוליזה של RNA על ידי הוספת 0.8 מיקרוליטר של שני נתרן הידרוקסיד מולארי לכל דגימה ודגירה בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף 0.8 מיקרוליטר של שני מימן כלורי מולארי כדי לנטרל את התגובה.לאחר זירוז הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, השעו מחדש כל גלולה בחמישה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של מאגר דגימת אוריאה 2x TBE. דוגרים בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, מסתובבים וקרח למשך דקה. טען את הדגימה בבאר אחת של ג'ל אוריאה 10% TBE.הפרד את תוצרי תגובת השעתוק ההפוך על ידי אלקטרופורזה של ג'ל 180 וולט למשך 50 דקות. מכתים את הג'ל בכתם ג'ל חומצת גרעין המוגן מפני אור למשך חמש דקות. בעזרת טרנסמאייטור אור כחול, כרתו את הרצועה סביב 128 נוקלאוטידים ומעלה.הקפיאו את חתיכות הג'ל הפוליאקרילאמיד במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות לפני חילוץ ה-DNA מג'ל הפוליאקרילאמיד. כדי להקיף את ה-DNA, השעו מחדש כל כדור DNA ב-16.75 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. הוסף שני מיקרוליטר של מאגר ליגאז DNA חד-גדילי פי 10, מיקרוליטר אחד של 50 מילי-מולרי מנגן כלוריד, ו-0.25 מיקרוליטר של DNA ליגאז חד-גדילי.דגירה בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ללא משקעים, אחסן את תוצר תגובת קשירת ה-DNA החד-גדילי במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בצע הגברה של ספריית PCR ואחריה כימות ספרייה ורצף תפוקה גבוה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.מוצגים פרופילי מנתח ביולוגי מייצגים של ספריית טביעת הרגל המוגברת של PCR וספריית הריצוף המתקבלת עבור דגימות mRNA. הגודל הממוצע הצפוי של ספריית טביעת הרגל הוא 148 עד 152 נוקלאוטידים, והגודל הצפוי של ספריית ה-mRNA הוא 170 עד 190 נוקלאוטידים. גרף זה מציג את המספר המשולב של קריאות mRNA, טביעת רגל ו-rRNA שהתקבלו עבור שני שכפולים ביולוגיים בלתי תלויים של דגימה מסוג בר ומוטנט מחיקת hbs1.50% עד 60% מכל הקריאות הרצופות בספריות טביעת הרגל תואמות לשברי טביעת רגל מוגנים בריבוזום. לעומת זאת, רק 3% מקטעי rRNA נצפו בספריות mRNA, מה שמדגים כי בידוד poly(A)mRNA מאפשר חיסול יעיל של קריאות rRNA. גם ספריות טביעת הרגל וגם ספריות דגימות mRNA מציגות יכולת שחזור טובה כפי שמצוין על ידי מקדם מתאם פירסון של כ-0.99 בין דגימות תואמות.בשילוב עם מדידות שפע mRNA, פרופיל ריבוזום מאפשר למדוד שינויים ביעילות התרגום בין תנאי הניסוי. גנים מווסתים באופן משמעותי במוטציה של מחיקת hbs1 מקובצים בהתאם לשאלה אם הם מושפעים משינוי בשעתוק mRNA, יעילות התרגום או מהשפעה משותפת. לאחר השליטה, ניתן לבצע את הפרוטוקול כולו תוך כ-11 ימים.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ללבוש כפפות ולבצע את כל השלבים באמצעות ריאגנטים וחומרים מתכלים ללא RNase כדי למנוע זיהום RNase ולהפחית את הסיכון לפירוק RNA בדגימות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור טביעות רגל ריבוזומיות באמצעות עיכול נוקלאז, לבודד קומפלקסים שלמים של טביעת רגל ריבוזומית על ידי פיצול שיפוע סוכרוז, ולהכין ספריות DNA לריצוף עמוק. אל תשכח שעבודה עם חנקן נוזלי עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הרכבת משקפי בטיחות וכפפות קריו בעת טיפול בחומרים קרים במיוחד.

genome-wide-quantification-translation-budding-yeast-ribosome

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

היכולת של תאים להסתגל ללחץ היא קריטית להישרדותם. ויסות תרגום mRNA הוא אסטרטגיית הסתגלות כזו, המספקת ויסות מהיר של הפרוטאום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פרופיל פוליזום סטנדרטי לזיהוי mRNAs ספציפיים המתורגמים באופן סלקטיבי בתנאי לחץ.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על כימות ברמת הגנום של mRNA החדש מסונתז מטוהרים מתאי שמרים עם 4-thiouracil תוויות. שיטה זו מאפשרת למדוד את סינתזת mRNA חשיפות מהשחתה mRNA ומספק, לפיכך, מדידה מדויקת של RNA פולימראז II שעתוק.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

כאן אנו מתארים את שלבי איסוף המדגם והכנת RIBO-seq בחיידקים. רצף הספריות שהוכנו על פי הנחיות אלה מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא פשוט, משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי ולוקח שבעה ימים מן התזה להשגת ספריות.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

תרגום ריבוזומים מפענח שלושה נוקלאוטידים לכל קודון לפפטידים. תנועתם לאורך mRNA, שנתפסה על ידי פרופיל ריבוזום, מייצרת את העקבות המציגות תקופת שלישייה אופיינית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש RiboCode כדי לפענח תכונה בולטת זו מנתוני פרופיל ריבוזום כדי לזהות מסגרות קריאה פתוחות בתרגום פעיל ברמת התמלול המלא.

De novo זיהוי של מסגרות קריאה פתוחות בתרגום פעיל עם נתוני יצירת פרופילים של ריבוזום

חקור פרופיל ריבוזום לכימות תרגום בגנום השלם בשמרים Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת ניתוח רגיש של קצבי תרגום חלבונים ומנגנוני ויסות תרגומי ביולוגי.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

גלה סרטונים נוספים