Name: הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: למדו כיצד להעריך את השפעת פפטידים אימונומודולטוריים על נדידת תאים אפיתליים ברונכיאליים בתהליך ריפוי פצעים. שיטה זו מספקת נתונים כמותיים מהירים ואמינים באמצעות ניתוח תמונות אוטומטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון ספיאנצה-אוניברסיטת רומא ועל קרן מחקר סיסטיק פיברוזיס איטלקי (פרוייקט טורבין #11/2014 שאומצה על ידי משלחות מועדון כדורגל מסיינה (siena), כולל Sondrio, Cerea Il Sorriso di ג'ני ו פאביה). חלק מעבודה זו נתמכה גם על-ידי FILAS FILAS פרוט גרנט-RU-2014-1020.
אנחנו אסירי תודה ד ר לורטה פררה (Genova מדיקה, Istituto ג'אנינה Gaslini, U.O.C. Genetica, איטליה) על מתן בתאי אפיתל הסמפונות.

1. תא הכנה
<ol><li>זרע 2.5x106 תאים 10 מ"ל של מינימום הכרחי בינוני (מאמ) בתוספת 2 מ מ גלוטמין (MEMg), בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), אנטיביוטיקה (0.1 מ"ג/מ"ל של פניצילין, סטרפטומיצין) ו puromycin (0.5 µg/mL מבחר ותחזוקה של תא קו) בבקבוקון T75. דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך יומיים. לפני תחילת הניסוי, בדוק המפגש של התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה. הערה: התאים המשמשים את הניסוי הם מונצחים הסמפונות אפיתל תאי אדם transduced עם וקטור lentiviral היוועצות התנגדות puromycin. הם מבטאים stably תפקודית CFTR14,15.</li>
	<li>לאחר זרימה התאים הגיעה 90-100%, תשאף האמצעי הבקבוקון ואת למחוק אותו לתוך בקבוק פסולת תחת מחלקה בקבינט בטיחות ביולוגית II. לשטוף את התאים עם 6 מ של פוספט buffered מלוחים ללא סידן ומגנזיום (CMF-PBS). בעדינות סלע את הבקבוקון ידנית ולמחוק CMF-PBS. הערה: יש להיזהר לא לגעת חד שכבתי את התא עם פיפטה.</li>
	<li>להוסיף 10 מ ל- CMF-PBS, דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 10 דקות.</li>
	<li>האחות CMF-PBS וזורקים אותו. לאחר מכן להוסיף 2 מ של טריפסין/EDTA הבקבוקון.</li>
	<li>רוק בעדינות את הבקבוק, המאפשר את הפתרון לחלוטין את התאים ולאחר דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 10 דקות עד התאים מנותקים בעליל תחת מיקרוסקופ. הערה: בסוף זמן הדגירה, התאים אמורה להופיע מעוגל, לא קשור משטח הפלסטיק. אם התאים נמצאים טוב מנותקת, עצבנות ידנית ייתכן שיהיה צורך.</li>
	<li>להוסיף 10 מ של MEMg בתוספת 10% FBS בטל טריפסין ולאסוף את התאים ע י שטיפת החלק התחתון של הבקבוק. להעביר את עוצמת הקול לתוך צינור חרוטי 50 מ.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור עבור 5 דקות ב x 80 גרם.</li>
	<li>וארוקן את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים 6 מ של MEMg בתוספת 10% FBS. פיפטה שוב ושוב כדי לשבור את כל הגושים.</li>
	<li>להוציא 10 µL של התא השעיה עם micropipette ולהזריק את אמצעי האחסון תחת הזכוכית המכסה בעבר לשים מעל תא Burker או Neubauer.</li>
	<li>לספור את מספר התאים.</li>
</ol>2. התא זריעה בתרבות מוסיף
<ol><li>ב כל טוב של צלחת 12-. טוב, העבר את תותב תרבות עם פינצטה סטרילי (איור 1). השתמש פינצטה כדי ללחוץ לאורך שולי מוסיף על מנת לתקן אותם על פני השטח של הצלחת. הערה: מוסיף יש התחתון דביק המאפשר הדבקה.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig1.jpg"> איור 1 : ייצוג סכמטי של התוספות תרבות סיליקון, מכניסים כראוי בארות של צלחת 12-ובכן. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56825/56825fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="2"><li>כראוי לדלל התליה תא MEMg בתוספת 10% FBS. ממלאים כל תא של הקדמי µL 70 תא השעיה (על 3.5x104 תאים/תא). הערה: הצפיפות של תאים המוחלת בכל תא תלוי בסוג של תאים. מומלץ להשתמש צפיפות תא שמוביל להשלים זרימה בתוך 24 שעות.</li>
	<li>תחת המיקרוסקופ, בדוק כי תאים לא דולפים מן התאים הוספה דגירה לצלחת 12-ובכן במשך 24 שעות ביממה-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
</ol>3. מדומים הפצע Assay הריפוי
<ol><li>לאחר דגירה, דמיינו את התאים במיקרוסקופ הפוך כדי לוודא כי נוצר תא confluent monolayers.</li>
	<li>מחדש להשעות את מבחן תרכובות (למשל, מגברים) ב 1 מ"ל של MEMg. הערה: להכין טרי דילולים אמפר החל מהפתרון מניות המאוחסנים ב-20 ° C.</li>
	<li>הסר בעדינות את המכסים על ידי פינצטה סטרילי. יש להיזהר לא לשבור את התא monolayers. להעביר את המכסים על נייר סופג. הערה: כדי להשתמש מחדש את המכסים אותו, לעקר אותם 70% אתנול במשך לפחות 3 שעות. מומלץ לזרוק אותם לאחר מכן.</li>
	<li>כדי להסיר תאים שאינם מחסידי, להוסיף 1 מ"ל של MEMg לכל שימוש טוב של micropipette. סגור את הצלחת, בעדינות לזעזע אותו. הערה: לא להוסיף בינוני ישירות מעל תא monolayers כדי למנוע הפרעה שלהם.</li>
	<li>האחות המדיום ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של MEMg לכל טוב. לסגור את הצלחת והמחש את הפערים נטול תאים (שנוצרו על ידי התוספות) תחת המיקרוסקופ הפוכה בהגדלה X 4, מצוידים עם מצלמת וידיאו. לרכוש תמונות בזמן אפס (T0) ולשמור אותם בתבנית. jpg.</li>
	<li>להסיר את המדיום מן הבארות, לשטוף אותם עם 1 מ"ל ל- PBS, למחוק אותו.</li>
	<li>הוסף את תרכובות מבחן (להכין בשלב 3.2) הבארות. דגימות הבקרה אינו מטופל, הוסיפו 1 מ"ל של MEMg. דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
	<li>לאחר 15, 20, וטיפול 24 שעות, להתבונן על נדידת תאים במיקרוסקופ בהגדלה X 4, לרכוש תמונות. הערה: במהלך שלב זה, לנסות ללכוד תמונות בהאזורים באשר T0. הבחירה של מרווחי זמן שבו נלכדים תמונות תלוי מהירות ההעברה של התא.</li>
	<li>כדי לחקור את ההשפעה של כמה מעכבי סלקטיבית, כלומר AG1478, על נדידת תאים, תשאף המדיום של כל תא הוספה לפני הסרת מוסיף.<ol>
<li>לשטוף כל תא עם MEMg טריים ולמלא אותו 70 µL של MEMg בתוספת AG1478.</li>
		<li>לאחר 30 דקות של דגירה-37 ° C ו- 5% CO2, המשך כמתואר מנקודת 3.3. הערה: במהלך שלב כביסה, רעלני של תאים monolayers עם מעכבי ספציפית, יש להיזהר לא להסיר את התוספות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. תמונות ניתוח
<ol><li>עם סיום הניסוי, בחר תמונות של הדגימות הייצוגי ביותר של הקבוצות השונות ניסיוני, וליצור קובץ zip המכיל תמונות יחיד ב- T0, T15, T20, T24 h. הערה: תמונות יחיד נלקחות במרווחי זמן נבחר עבור כל הדגימות. הפעל את triplicates עבור כל ניסוי, אשר חוזר על עצמו לפחות שלוש פעמים. בסוף, לקבוצות בכל ניסיוני, מינימום של 3 תמונות ("a", "b", "c", וכד', הנובע ניסוי עצמאית) בנקודת זמן כל מנותחות.</li>
	<li>להעלות קובץ ה-zip לתוך התוכנה ניתוח תמונה אשר מספק באופן אוטומטי באמצעות דואר אלקטרוני קובץ סיכום הגיליון האלקטרוני המכילה את הנתונים ניסיוני של אזורים מכוסי תא, גירוד (באחוזים) בנקודות זמן נבחר. הערה: ההכרה בחוד החנית ואת אזור הפער מבוססת במידה רבה על שיטת זיהוי קצה (המכוון לזיהוי נקודות בו בהירות התמונה חדה משתנה).</li>
	<li>לשמור את הנתונים ולאסוף אותם. לנרמל את כל הנתונים ביחס הערך הממוצע בזמן אפס. חישוב הערך הממוצע של הנתונים המנורמל של משכפל כל כל נקודת זמן, השגיאה הסטנדרטית היחסי (SEM). באמצעות ניתוח דו כיוונית השונות (ANOVA), לבצע ניתוח סטטיסטי עם תוכנת הסטטיסטיקה נכונה. הבדלים בין קבוצות שטופלו פפטיד וקבוצות שליטה במרווחי זמן שונים נחשבים מבחינה סטטיסטית signiﬁcant עבור p&lt; 0.05.</li>
	<li>להתוות נתונים המתקבלים גרף כמו היסטוגרמה, אשר מציג אחוז מכוסי תא שטח של כל מדגם קבוצות לעומת ממרווחי הזמן שנבחר.</li>
</ol>

<ol><li>Enyedi, B., Niethammer, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25813429">Mechanisms of epithelial wound detection.</a> Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).</li>
<li>Kujath, P., Kujath, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complicated+skin%2C+skin+structure+and+soft+tissue+infections+-+are+we+threatened+by+multi-resistant+pathogens%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens?</a> Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).</li>
<li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).</li>
<li>Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lung+infections+in+cystic+fibrosis+patients%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update.</a> Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).</li>
<li>Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+wound+healing%3A+biological+and+therapeutic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations.</a> Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).</li>
<li>Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+role+of+stem+cells+in+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing.</a> Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).</li>
<li>Hu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+regenerative+repair+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and regenerative repair in wound healing.</a> Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).</li>
<li>Ramot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+PPARgamma-mediated+signalling+in+skin+biology+and+pathology%3A+new+targets+and+opportunities+for+clinical+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology.</a> Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).</li>
<li>Lai, Y., Gallo, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPed+up+immunity%3A+how+antimicrobial+peptides+have+multiple+roles+in+immune+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense.</a> Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).</li>
<li>Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+of+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides of multicellular organisms.</a> Nature. 415, 389-395 (2002).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).</li>
<li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frog+skin-derived+antimicrobial+peptide+esculentin-1a%281-21%29NH2+promotes+the+migration+of+human+HaCaT+keratinocytes+in+an+EGF+receptor-dependent+manner%3A+a+novel+promoter+of+human+skin+wound+healing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?</a> PLoS One. 10, e0128663(2015).</li>
<li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-Amino+acids+incorporation+in+the+frog+skin-derived+peptide+esculentin-1a%281-21%29NH2+is+beneficial+for+its+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions.</a> Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).</li>
<li>Cappiello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esculentin-1a-derived+peptides+promote+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+internalized+in+bronchial+cells+of+cystic+fibrosis+patients+and+lung+cell+migration%3A+biochemical+properties+and+a+plausible+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).</li>
<li>Bebok, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+cAMP+agonists+to+activate+rescued+deltaF508+CFTR+in+CFBE41o-+airway+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers.</a> J Physiol. 569, 601-615 (2005).</li>
<li>Trinh, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+defective+cystic+fibrosis+airway+epithelial+wound+repair+after+CFTR+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue.</a> Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).</li>
<li>Gan, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+tyrosine+kinase+inhibitor+AG1478+increases+the+formation+of+inactive+untethered+EGFR+dimers.+Implications+for+combination+therapy+with+monoclonal+antibody+806%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806.</a> J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).</li>
<li>Tokumaru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+keratinocyte+migration+via+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+by+the+antimicrobial+peptide+LL-37%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37.</a> J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).</li>
<li>Tjabringa, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+activates+innate+immunity+at+the+airway+epithelial+surface+by+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor.</a> J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).</li>
<li>Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporins+A+and+B+stimulate+migration+of+HaCaT+keratinocytes+and+kill+intracellular+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף

נדידת תאים הוא תהליך חיוני באירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים כולל ריפוי הפצע, התפתחות של סרטן גרורות. ההליך הבסיסי לימודים תא העברה במבחנה כרוך: (i) היצירה של חד שכבתי תא, (ii) הייצור של פצע מדומה בשכבה confluent של תאים, הסגר (iii) לכידת תמונות במרווחי זמן שונים עד הפציעה נגיש , ו- (ד) הניתוח של רצף תמונות בכדי לכמת את מהירות ההעברה של התאים שבחרת.
התוצאות שלנו הראו כי היישום של תרבות מוסיף הוא אובייקטיבי ובלתי אמין ניסיוני טכניקת הערכה כמותית של מאפייני ההעברה תא. Assay זה יכול ל...

היא ידועה בעיקר כי ריפוי הפצע בבעלי חיים הוא תהליך מהותי לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה1. למרות אפיתל משטחים חשופים לסביבה החיצונית (למשל, העור, מערכת הנשימה, ו נרחבים במערכת העיכול) ליצור מחסום מגן מפני עלבונות פיזיקליות, כימיות, היווצרות הפצעים יכול בקלות להתרחש, במיוחד אחרי ניתוח או זיהומים חיידקים2. לדוגמה, קולוניזציה של רקמת הריאה על ידי פתוגן חיידקי הזדמנותית Pseudomonas aeruginosa, במיוחד אצל חולי סיסטיק פיברוזיס (CF), מוביל לפגיעה של האפיתל איירווייז עם כשל נשימתי הסוגר3, 4. ריפוי הפצע הוא מנגנון תיקון מארח מורכבים כדי לשחזר את הארכיטקטורה נורמלי של רקמות הפצועים5. היא מאופיינת על ידי דלקת ראשונית, ואחריו נקודה ההתחדשות המקיף epithelialization, אנגיוגנזה, ושחזור רקמות עם ייצור קולגן תא בידול6,7,8 . כדי להבטיח את תקינות אפיתל וכדי לשלוט התפשטות חיידקים, כל היצורים החיים לייצר מולקולות ההגנה, לרבות מיקרוביאלית פפטידים (אמפר)9,10. תהליך ריפוי הפצע קשה מאוד לדמות במבחנה בשל היעדר שאריות תאים ואינטראקציות מורכבים בין סוגי תאים שונים. עם זאת, במבחנה היכולת של פפטיד כדי להאיץ את הסגר על פצע מדומה על ידי גירוי נדידה של תאים אפיתל היא מעידה על היכולת לרפא האפיתל הנגוע. אכן, נדידת תאים הוא אירוע הגבלת קצב בריפוי הפצע, לומד גורמים שיכולים להשפיע על נדידת תאים יעזור היעד טיפולים לריפוי הפצע משופרת.
כאן, assay ניסיוני מאוד לשחזור מסופק המבוססת על סיליקון מיוחד תרבות מוסיף להעריך תא העברה בתוך חוץ גופית. היא מבוססת על יצירת פער μm 500 (הפצע מדומה) על טפט התא confluent. התאים בקצה השדה "הפצוע" מלאכותי יתחיל נודדות לאזור ללא תאים, ויצרו קשרים תאים תאים חדשים. הוסף תרבות מייצג כלי חדש עבור ריפוי ניסויים הפצע מהר. שני מאגרים המופרדות על-ידי קיר μm 500 הינם מסופקים, ושיחות ניתן כהלכה להניח לתוך צלחת צלחת 3-ס"מ או בבאר של צלחת 12-. טוב. מילוי כל תא של הקדמי עם השעיה התא מאפשר לתאים לגדול בכל אזור המיועד עד למפגש, בזמן ההסרה של הקדמי לעורר רווח נקי ללא תא של 500 μm (באותו רוחב כמו חומת ההפרדה). מדיום התרבות התא הנכון עם תרכובת מבחן אז ניתן להוסיף לתוך המנה לצלחת/טוב. לאחר מכן, ניתן לאבחן על סגירת הפער במרווחי זמן שונים תחת מיקרוסקופ הפוכה, רצוי אחד מצויד מצלמת וידיאו עבור ייבוא תמונות. לבסוף, מדידה של שינויים באזור המכוסה תא על-ידי התוכנית ניתוח תמונות אוטומטית מבוססת אינטרנט יאפשר כימות של מהירות ההעברה הסגר ותא הפצע. בסך הכל, שיטה זו היא צעד אחד קדימה ביחס וזמינותו קלאסי, בו שריטה מתבצעת באופן ידני על-ידי אם תא confluent monolayers עם מחט סטרילית או פיפטה עצה11. אכן, ההליך האחרון יכול להרוס בתחתית קערה פלסטיק צלחת/טוב, הציפוי על פני השטח, יצירת קמטים. בנוסף, האזור "הפצוע" לא קיימת רוחב מוגדרים היטב לכל אורכו של הפער, מכיוון שזה מאוד תלוי הלחץ שהופעל על ידי חוקרים המחט/טיפ. יתר על כן, התאים ונדרש שיכולים להיווצר גושים של תאים חי וגם מת בקצוות של השריטה; יתר על כן, הפצת התאים החיים לאזור "הפצוע" יכול להתערב עם המהירות של נדידת תאים, הפקת תוצאות שאינן לשחזור12.
בנוסף, הודות פלטפורמה ניתוח תמונת הטיוטה, משתמשים יכולים במהירות לקבל (בתוך דקות) נתונים כמותיים על ההתנהגות הנדידה של התאים שנבחרו ללא הצורך ברכישת תוכנות נוספות. פלטפורמה זו הוא מסוגל לנתח שלב תמונות מיקרוסקופ בניגודיות נמוכה (~ 5 X), בינוני (~ 10 X), הגדלה גבוהה (~ 20 X). לאחר העלאת קובץ zip של תמונות (ב- *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff תבנית) הניתוח מבוצע באופן אוטומטי כדי ליצור קובץ סיכום המציגה את אחוז מכוסי תא אזורים ואזורי מאפס, כמו גם המהירות של התא הגירה, במרווחי זמן שונים.
בעבודה זו, באמצעות כח-נגזרת צפרדע-עור, קרי Esc(1-21), שלה diastereomer Esc(1-21) - 1c13, קו תא הסמפונות לבטא את תפקודי CF מוליכות transmembrane הרגולטור (CFTR)14,15, דוגמה של נדידת תאים פפטיד-induced לעומת דגימות ללא טיפול (בקרה) מסופק. שימו לב כי אפיתל דרכי הנשימה ואת CFTR לשחק תפקיד מכריע בשמירה על תפקוד הריאות, פצע תיקון16. יתר על כן, על-ידי מעכבי סלקטיבית (למשל, AG1478)17 של קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR), כרוך ראיות כי ההעברה של תאים הסמפונות המושרה על ידי פפטידים הנ ל ההפעלה של EGFR12, 18 הוא דיווח.
לסיכום, המטרה של נוהל זה היא להראות כיצד השימוש כזה מוסיף תרבות סיליקון מייצג של assay מהיר ונגיש בקלות כדי לקבוע במדויק נדידה של תאים חסיד (למשל, ברונכיט תאים אפיתל) ומולקולרית מנגנוני שליטה אירועים כאלה.

<table><tbody><tr><td>מדיום חיוני מינימלי (MEM)&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB2071L</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180DH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין וסטרפטומיצין</td><td>יורוקלון</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>פורומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין/EDTA 1X ב-PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D</td><td>לחמם בטמפרטורת החדר לפני השימוש</td></tr><tr><td>DPBS ללא סידן ומגנזיום (CMF-PBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DPBS עם סידן ומגנזיום (PBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Culture-Insert 2 באר</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח תמונות Wimasis</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>30002</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת PRISM&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>גרסה 6.0</td><td></td></tr></tbody></table>

הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

מטרת עבודה זו היא להציג שיטה להעריך את היכולת של מולקולות immunomodulatory, כגון מיקרוביאלית פפטידים (אמפר), כדי לעורר את נדידת תאים. חשוב לציין, נדידת תאים הוא אירוע הגבלת קצב במהלך תהליך ריפוי פצע לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה. היתרון של שיטה זו על וזמינותו הקלאסית, אשר מבוסס על שריטה עשה באופן ידני בטפט התא, הוא שהשימוש של תרבות סיליקון מיוחד מוסיף מתן שני תאים כדי ליצור שדה מדומים הפצע נטול תאים עם רוחב מוגדרים היטב (500 μm ). בנוסף, עקב פלטפורמה ניתוח התמונה האוטומטי, אפשרי להשיג במהירות נתונים כמותיים על מהירות ההעברה הסגר ותא הפצע. ליתר דיוק, ההשפעה של שני אמפר עור הצפרדע על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט יוצגו. יתר על כן, רעלני של תאים אלה עם מעכבי ספציפית יספק מידע על המנגנונים המולקולריים שבבסיס אירועים כאלה.

פרוטוקול זה שימש כדי לקבוע את הפצע ריפוי אפקט Esc(1-21) ו- Esc(1-21) - 1 ג מבחינת פעילות ההעברה התאים המושרה בתאי אפיתל הסמפונות, המבטאת את CFTR פונקציונלי. ב הזה assay, תרבות מוסיף הונחו בבארות של צלחת 12-. ובכן, כל תא היה נזרע עם 35,000 בתאים MEMg בתוספת 10% FBS. התאים הגיעו למפגש מלא בתוך 24h. אחר כך, נוצר פער 500 μm, כל טוב היה מלא MEMg המכיל את פפטיד בריכוזים שונים. הניסוי היה בן ארבע פעמים. כמצוין באיור2, הסגר כמעט מוחלטת של השדה מדומים הפצע מיוצר על טפ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעה של פפטידים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. שיטה זו מאפשרת הקניית מהיר ולא מאוד לשחזור נתונים כמותיים על מהירות הסגר ההעברה וגמר התא.

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

מטרת הליך זה היא להראות כיצד להעריך את יכולתן של כמה מולקולות אימונומודולטוריות, כגון אנטי-מיקרו-פפטידים, לעורר נדידת תאים, שהיא אירוע מגביל קצב במהלך תהליך ריפוי הפצעים. באופן כללי, ההליך הבסיסי לחקר נדידת תאים במבחנה כרוך ביצירת חד-שכבת תאים, ייצור פסאודו-פצע, לכידת תמונות במרווחי זמן שונים עד להגעה לסגירת הפצע, וניתוח רצף התמונות כדי לכמת את נדידת התאים. כעת, היתרון של שיטה זו על פני הבדיקה הקלאסית, המבוססת על שריטה שנעשתה ידנית, נובע מהשימוש בתוספות תרבית סיליקון מיוחדות ליצירת שדה הפסאודו-פצע, שהוא נקי לחלוטין מתאים וברוחב מוגדר היטב, 500 מיקרומטר.בנוסף, הודות לתוכנית ניתוח תמונות אוטומטית מבוססת אינטרנט, ניתן לקבל במהירות תוך דקות נתונים כמותיים על מהירות סגירת הפצע ונדידת התאים. אז בסך הכל, זוהי טכניקה ניסויית אמינה שניתן ליישם על כל סוג של תאים דבקים עם יכולת שחזור גבוהה מאוד של נתונים. כאן, ניתן, כדוגמה, ההשפעה של אנטי-מיקרו-פפטיד מעור צפרדע על נדידת תאי אפיתל הסימפונות וכיצד טיפול מקדים בתאים אלה עם מעכבים ספציפיים יכול לתת מידע על המנגנון המולקולרי העומד בבסיס אירועים כאלה.ליתר דיוק, נראה כיצד נדידת התאים הנגרמת על ידי פפטיד כרוכה בהפעלה של קולטן גורם גדילה אפידרמיס. כדי להתחיל בניסוי, הסר את הבקבוק המכיל תאים מאינקובטור תרבית התאים, ובדוק את ההיקף במיקרוסקופ הפוך המצויד במערכת רכישת תמונה אוטומטית. אם מגיעים ל-90% מהמפגש המלא, עברו למכסה המנוע של בטיחות ביולוגית, ושאבו בזהירות את מדיום התרבות באמצעות פיפטה מפלסטיק של 10 מיליליטר בתנאים סטריליים והשליכו בעדינות את המדיום לבקבוק הפסולת.שוטפים את התאים עם שישה מיליליטר PBS ללא סידן ומגנזיום, כלומר CMF. נדנד בעדינות את הבקבוק באופן ידני והשליך CMF. לאחר מכן, הוסף עוד 10 מיליליטר CMF כדי להסיר עוד יותר פסולת תאים ותאים לא מחוברים.בשלב זה, סגרו את הבקבוק והחזירו אותו לאינקובטור תרבית התאים למשך 10 דקות. הוציאו את הבקבוקון, השליכו CMF והוסיפו בעדינות שני מיליליטר טריפסין-EDTA כדי לנתק תאים ממשטח הפלסטיק. נדנד בעדינות את הבקבוק באופן ידני, ואפשר לתמיסה לכסות לחלוטין את התאים, ולדגור את הבקבוק למשך 10 דקות נוספות.לאחר מכן, הוציאו את הבקבוק מהחממה, ובדקו אם תהליך הוספת הטריפסין הושלם. אם זה המקרה, התאים יהיו בתרחיף וייראו מעוגלים מתחת למיקרוסקופ. כדי לנטרל את הטריפסין, יש להוסיף 10 מצע תרבית מיליליטר בתוספת סרום בקר מושבת חום של 10%, ולשטוף בזהירות את הבקבוק.אסוף את תרחיף התאים, העביר את הנפח הזה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וצנטריפוגה את הדגימה. לאחר צנטריפוגה, בדוק את היווצרות הגלולה, שאב את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא במדיום תרבית של שישה מיליליטר בתוספת סרום. פיפטה את מתלה התא למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפרק כל היווצרות גושים.תהליך זה עשוי להימשך מספר דקות. לאחר מכן, הוציאו 10 מיקרוליטר עם קצה מיקרופיפטה, והזריקו את הנפח מתחת לזכוכית הכיסוי של תא בורקר או נויבאואר וספרו את מספר התא. בכל באר של צלחת 12 בארות, הכניסו את הכנסת התרבות בעזרת פינצטה סטרילית.כל תוספת מסופקת משני תאים המופרדים על ידי קיר של 500 מיקרומטר, ויש צד תחתון דביק המאפשר הידבקות. עם זאת, באמצעות פינצטה, הפעל לחץ מסוים לאורך קצוות ההכנסה כדי לקבע אותם על פני הצלחת. מלאו כל תא של התוספת ב-70 מיקרוליטר של תרחיף תאים המכיל כ-3.5 על 10 עד רביעית תאים לתא.חשוב לציין, ריכוז התאים המופעלים בכל תא תלוי בסוג התאים. מומלץ להשתמש בצפיפות תאים המובילה למפגש מלא תוך 24 שעות. תחת המיקרוסקופ בהגדלה פי ארבעה, בדוק שהתאים אינם דולפים מתאי ההכנסה, ולאחר מכן דגר על הצלחת למשך 24 שעות.לאחר הדגירה, הסר בעדינות את התוספות בעזרת פינצטה סטרילית מבלי לשבור את שכבות התאים החד-שכבתיות, והעביר את התוספת על נייר סופג. שטפו את התאים על ידי הוספת מדיום מיליליטר אחד לבאר. היזהר לא להוסיף את המדיום ישירות על גבי חד-שכבות התאים, כדי למנוע הפרעה להם.סגור את הצלחת ונדנד אותה בעדינות ידנית. שאפו את המדיום, והחליפו אותו במיליליטר אחד של מדיום טרי לכל באר. דמיין את הפערים נטולי התאים מתחת למיקרוסקופ, ורכוש תמונות בזמן אפס.הוציאו את המדיה מהבארות, והוסיפו PBS בתוספת סידן ומגנזיום. לנער את הצלחת, להסיר PBS ולבסוף להוסיף את תרכובות הבדיקה לבארות. עבור דגימות בקרה לא מטופלות, נעשה שימוש במדיום מילימטר אחד.דגרו את הצלחת. עבור כל דגימה, התבונן בנדידת התאים תחת המיקרוסקופ בהגדלה פי ארבעה, ורכוש תמונות לאחר 15, 20 ו-24 שעות דגירה. במהלך שלב זה, נסה לצלם תמונות באותם אזורים כמו בזמן אפס.הבחירה במרווחי הזמן שבהם התמונות נלכדות תלויה במהירות הנדידה של התאים שנבחרו. בסיום הניסוי, בחר תמונות עבור כל דגימה במרווחי הזמן השונים, וצור קובץ zip. חשוב שיהיו לפחות שלושה שכפולים לכל דגימה בכל מרווח זמן.פתח את תוכנית ניתוח התמונות האוטומטית Wimasis, והעלה את קובץ ה-zip באמצעות ההגדלה הנמוכה ביותר. התוכנית תספק באופן אוטומטי בדוא"ל קובץ סיכום המכיל את נתוני הניסוי של שטח מכוסה תאים ואזורי שריטות כאחוזים מכל דגימה בודדת, למשל, דגימות 1a ו-2a, בנקודות הזמן שנבחרו. חשב ערך ממוצע של כל הדגימות בזמן אפס.נרמל את כל הנתונים ביחס לערך הממוצע בזמן אפס. חשב ערך ממוצע של כל הדגימות בכל נקודת זמן ואת שגיאת התקן היחסית. על ידי שימוש במבחן ANOVA דו-כיווני, בצע ניתוח סטטיסטי.ניתן לשרטט את הנתונים המתקבלים לגרף כהיסטוגרמה המציגה את אחוז השטח המכוסה בתאים בנקודות זמן שונות עבור קבוצות מדגם שונות. היסטוגרמות אלו מראות את סגירת הפצע המתקבלת לאחר טיפול של 15, 20 ו-24 שעות בתאי סימפונות עם ריכוזים שונים של האנטי-מיקרו-פפטיד אסקולנטין 1-21-1c או אסקולנטין 1-21 בהשוואה לביקורת. כפי שצוין על ידי ההיסטוגרמות וכמה מיקרוגרפיות מייצגות, אסקולנטין 1-21-1c יעיל יותר בקידום אפיתל מחדש של פסאודו-פצע בתאי הסימפונות המושרה בסגירה כמעט מוחלטת של שדה הפצע תוך כ-20 שעות במיקרו-טוחנת אחת, בעוד שנדרש ריכוז גבוה יותר עבור אסקולנטין 1-21, כלומר 10 מיקרומולר.כדי לחקור את תפקידם של קולטנים מסוימים, כגון קולטן גורם גדילה אפידרמלי, על נדידת התאים, יש לטפל מראש בחד-שכבות התאים עם מעכב ספציפי, למשל, התרכובת AG1478. לשם כך, לפני הסרת התוספת, יש לשאוב את המדיום בכל תא, לשטוף אותו פעם אחת ולהוסיף 70 מיקרוליטר מדיה בתוספת חמישה מיקרו-טוחנת AG1478. דגרו את הצלחת למשך 30 דקות.לאחר מכן, הסר את התוספת בעזרת פינצטה, והמשך כמתואר קודם לכן. אלה הנתונים הסופיים המראים כי נדידת התאים הנגרמת על ידי פפטיד כרוכה בהפעלה של קולטן גורם גדילה אפידרמלי. ואכן, לאחר טיפול מקדים במעכב AG1478, אחוז השטח המכוסה בתא מצטמצם משמעותית בכל מרווחי הזמן בהשוואה לתוצאות שנמצאו כאשר התאים אינם מודגרים מראש עם AG1478 לפני הוספת הפפטיד.לסיכום, לשיטה המתוארת יש פוטנציאל גבוה לשפר משמעותית את ההבנה על תכונת הנדידה של סוגים שונים של תאים, כמו גם על בחירת מקדמי ו/או מעכבי ריפוי הפצעים המבטיחים ביותר, תוך זמן קצר וברמת דיוק גבוהה.

a-novel-in-vitro-wound-healing-assay-to-evaluate-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מתאר בדיקת ריפוי פצעים ללא מגע בתרבית משותפת כדי להעריך את יכולת הנדידה של מיובלסטים מורינים. זה עוזר להבין רכיבים של שליחת אותות וקבלת אותות של אינטראקציות איתות Wnt פרקריניות לא קנוניות במבחנה.

בדיקת פצעים כדי להעריך את יכולת הנדידה של מיובלסטים מורינים בתרבות משותפת

בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

נדידת תאים היא תופעה ביולוגית כי הוא מעורב בשפע של פיסיולוגי, כגון ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, ותהליכי pathophysiological, כמו סרטן. Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן הוא כלי תכליתי כדי לנתח את מאפייני נדידת תאים מסוגים שונים של מסגרת בסביבה דמוית פיזיולוגית 3D.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבצע assay נדידת תאי תפוקה למחצה גבוהה על צלחת תרבית תאי 96-היטב. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה, פשוטה וחסכונית ליצור פצעי שריטה עקביים על monolayer תא.

מכשיר לביצוע נדידת תאים / ריפוי פצעים צלחת 96-ובכן

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את ההשפעה של גורמים פרו - ו אנטי - migratory על נדידת תאים בתוך מטריצה תלת מימדי פיברין.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

כתב יד זה מתאר איך חתך דמוי נגעים על monolayers בתרבית תאים אפיתל בנוחות דגם פצע ריפוי במבחנה, ומאפשר הדמיה על ידי קונאפוקלית או סריקה מיקרוסקופ לייזר, אשר יכול לספק באיכות גבוהה נתונים כמותיים ואיכותיים ללמוד בהתנהגות התא והן את המנגנונים המעורבים בהעברה.

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.

אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

מחקר זה מתמקד מודל במבחנה של הפצע הריפוי (גירוד assay) בתור מנגנון לקביעת מזהמים סביבתיים איך כגון ארסן השפעה הסלולר ההעברה. התוצאות מדגימים כי assay חוץ גופית בתוך זה מספק אינדיקציות מהיר ולא מוקדם של שינויים ההעברה הסלולר לפני ניסויים ויוו .

במבחנה לגרד Assay כדי להדגים את השפעת הרעל על נדידת תאים בעור

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור התיקון שריטות מבחנה באמצעות הפיברוכדורים העיקריים עבור vivo העור הפצע הריפוי הטיפול בעכברים. שניהם מספר שיטות ברורות כדי להעריך בתוך מבחנה וריפוי פצעים vivo.

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

פרוטוקול זה מתאר ניסוי נדידה חוץ גופית המתאים לניתוח פונקציונלי של המולקולות המעורבות בנדידת in vivo של תאי פסגה עצבית לתוך מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן.

במבחנה חקר ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן על נדידת תאי קרסט עצביים

למדו כיצד להעריך את השפעת פפטידים אימונומודולטוריים על נדידת תאים אפיתליים ברונכיאליים בתהליך ריפוי פצעים. שיטה זו מספקת נתונים כמותיים מהירים ואמינים באמצעות ניתוח תמונות אוטומטי.

הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

גלה סרטונים נוספים