המודל פילוקרפין של אפילפסיה של אונה רקתית EEG ניטור באמצעות מערכת Radiotelemetry בעכברים

כתב יד זה מתאר שיטה של גרימת סטטוס אפילפטיקוס בזריקה פילוקרפין מערכתית ואת הפיקוח התקפים חוזרים ונשנים ספונטנית בבעלי חיים באמצעות וידאו אלחוטית טלמטריה העוויתיים המערכת. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל ללמוד את המנגנונים pathophysiologic של אפילפסיה כרונית, epileptogenesis התקפים חריפה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום לסטטוס אפילפטיקוס באמצעות פילוקרפין ולעקוב אחר התקפים חוזרים ספונטניים באמצעות מערכת רדיוטלמטריה בעכברים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לחקר מנגנוני הפתופיזיולוגיה של התקפים חריפים, אפילפטוגנזיס ואפילפסיה כרונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לספק מודל עכברי של אפילפסיה כרונית המראה התקפים חוזרים ספונטניים עם שיעור הישרדות גבוה לאחר התקפים חריפים.

מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר ג'י-און קים, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. התחל בשקילת כל עכבר זכר בן שמונה שבועות. הכינו שני מיליגרם לק"ג סקופולמין וטרבוטלין, כמו גם 280 מיליגרם לק"ג תמיסת פילוקרפין.

לאחר מכן, הזריקו את התמיסה תוך צפקית לכל עכבר, והחזירו את העכברים לכלובים שלהם. 30 דקות לאחר מתן הסקופולמין והטרבוטלין, הזריקו תמיסת פילוקרפין לכל עכבר. מיד לאחר הזרקת פילוקרפין, הניחו את העכברים באינקובטור עם 28 עד 30 מעלות צלזיוס לתצפית.

לאחר מכן, עקוב אחר התנהגות העכברים עד ליצירת סטטוס אפילפטיקוס, או SE. אם מתגלים התקפים מוטוריים לימביים המתאימים לשלב 3 ומעלה לפי סולם רסין, רשמו את השעה ועקבו אחר העכברים. לאחר שהתקפים מוטוריים מתמשכים נמשכים יותר משתי דקות, הכניסו את העכבר לכלוב חדש בטמפרטורת החדר והמשיכו לעקוב במשך שלוש שעות כדי לקבוע אם ההתקפים העוויתיים שלהם ממשיכים ו-SE מושרים.

לאחר מכן, יש להפסיק התקפים חריפים התנהגותיים שלוש שעות לאחר הופעת SE על ידי הזרקת 10 מיליגרם לק"ג תמיסת דיאזפאם. לאחר הזרקת דיאזפאם, יש לתת מיליליטר אחד של 5% דקסטרוז לכל עכבר בודד כדי לסייע בהתאוששות. ביום הראשון לאחר השראת SE, שקלו את העכברים ושמרו אותם בחממה למשך יום אחד נוסף.

ביום השני לאחר האינדוקציה SE, שקלו את העכברים והחזירו אותם לכלוב הביתי שלהם. יש לספק מזון לח כדי להקל על ההתאוששות. לבסוף, מדדו את משקל הגוף היומי של בעלי החיים עד שבעה ימים לאחר הפילוקרפין.

ואם משקל הגוף לא עלה, הזריקו לעכברים 5% דקסטרוז. הכן עכברים בני 12 שבועות, ארבעה שבועות לאחר השראת SE, לבצע השתלת טלמטריה לניטור EEG. הניחו את העכבר במסגרת סטריאוטקסית עם מוטות אוזניים וצלחת נשיכה, ומרחו משחה וטרינרית על שתי העיניים כדי למנוע עיוורון.

לאחר מכן, כדי לשמור על תנאים סטריליים במהלך הניתוח, יש לגלח את אתרי הניתוח באמצעות סכין גילוח, ולהקפיד למנוע זיהום פרווה של שדה הניתוח. לאחר הגילוח יש לחטא את העור בתמיסת אתנול ויוד 70%. לאחר מכן, נגב את העור עם צמר גפן ספוג PBS, ולאחר מכן תמיסת אתנול ויוד 70%.

בצע חתך אורכי באמצע הראש עם מספריים כדי לחשוף את הלמבדה, הברגמה ומיקום המטרה. לאחר מכן, מקם את המקדח בברגמה, ושים לב לקואורדינטות X, Y עבור נקודה זו כדי לחשב את הקואורדינטות עבור הברגים. לאחר מכן, הורד לאט את המקדח כדי ליצור חור קוצים, היזהר להימנע מהכנסת המקדח רחוק מדי בנקודה שבה הגולגולת הופכת דקה יותר.

הכנס את גוף משדר ה-EEG האלחוטי החד-ערוצי, מאחורי העורף של הצוואר באופן תת עורי, והנח מוליכים גמישים ליד הגולגולת. לאחר מכן, הנח בורג נירוסטה לכל חור בור בעזרת פינצטה, והדק אותו באמצעות מברג בסיבוב עם כיוון השעון. ודא שהבורג אינו מוכנס עמוק מדי כדי למנוע נזק לדורה או לרקמות המוח.

הפשיטו את מעיל הבידוד שני מילימטרים מקצה המוליכים, ומתחו את החוט מספיק זמן כדי לעגל את פיר הבורג לחיבור טוב בין החוט לבורג. חבר את כבל הייחוס לבורג הקדמי ואת כבל ההקלטה לבורג בקליפת המוח הקודקודית. לאחר מכן, מרחו מלט דנטלי כדי לאבטח את כל המכלול במקומו מבלי לחשוף את חלקי המתכת.

לבסוף, לאחר שהמלט הדנטלי התייבש, יש לתפור את העור ולמרוח משחת מופירוקין מקומית. הנח את העכבר באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס לבד עד שיתאושש מהניתוח. לאחר מכן, החזר את העכבר לכלוב הביתי.

התחל בהנחת עכבר בכלוב בודד והנחת הכלוב על גבי לוחות המקלט האלחוטי שבו מותקן כלוב פאראדיי, כדי למנוע הפרעה של אותות חשמליים מכל מקור כולל מחשב, קווי AC ומקלטים סמוכים. לאחר מכן, הקלט את הפעילות החשמלית באמצעות מערכת הטלמטריה האלחוטית של וידאו-EEG. קבע את תדירות ההתקפים על ידי חלוקת המספר הכולל של מקרי SRS שזוהו במהלך השבועיים במספר הכולל של ימי הרישום עבור כל בעל חיים בודד.

לאחר מכן, כדי לנתח את משך ההתקף, מדוד את הזמן מתחילת ועד לסיום פעילויות הזינוק האפילפטיות. לאחר השלמת הקלטת הווידאו-EEG וקיבוע המוח, שלפו את המשדר מהעכבר לשימוש חוזר לאחר הניקוי. לשם כך, הסר את המלט הדנטלי סביב המוליכים באמצעות מלקחיים.

לאחר מכן, יש להשרות את קצה המוליכים במלט דנטלי ב-100% אצטון עד להמסת המלט הדנטלי. לאחר מכן, הסר מזהמי רקמות סביב המשדר על ידי שטיפתו במים מזוקקים. לבסוף, שטפו את המשדר עם 70% אתנול למשך שלוש שעות וייבשו אותו באוויר לאחסון.

שבעה ימים לאחר SE, התגלו תאים פיקנוטיים באזורים ההילריים של הבליטה המשוננת ובשכבת התאים הפירמידלית של תת-השדה CA3 של ההיפוקמפוס. לאחר שישה שבועות לאחר SE, נצפתה ירידה ניכרת במספר התאים ההילריים. בנוסף, נצפה אובדן עצבי באזורי CA1 ו-CA3.

בנוסף, בהשוואה לקבוצת הדמה שהראתה פעילות חשמלית פיזיולוגית, קבוצת SE הראתה מדי פעם הפרשות אפילפטיות מלוות בהתנהגויות עוויתיות. מיקום עמוק מדי של הברגים האפידורליים במהלך ניתוח ההשתלה עלול לגרום לפציעות בקליפת המוח, שעלולות לגרום להתקפים ספונטניים אפילו בבעלי חיים שעברו מניפולציה מזויפת. לאחר השליטה, ניתן לבצע אינדוקציה של סטטוס אפילפטיקוס והשתלת בורג תוך שעה אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את הביטוי ההתנהגותי לאחר הזרקת פילוקרפין ולא לפגוע ברקמות המוח במהלך ניתוח ההשתלה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מבחן התנהגות לזיכרון ובעיות מוטוריות באפילפסיה כרונית, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו בעיות מעגלים הקשורות לאפילפסיה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום לסטטוס אפילפטיקוס ולעקוב אחר התקפים כרוניים בעכברים.