התפתחות במבחנה הנועד Quantitate גזע Hematopoietic, קדמון תאים (HSPCs) בפיתוח עוברי דג זברה
30 בנובמבר 2017
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה כדי quantitate hematopoietic גזע קדמון תאים (HSPCs) בדג זברה עובריים. HSPCs של דג זברה חלופה מועדפת הינם מצופה ב- methylcellulose עם גורמים תומכת, המבדילים לדם בוגרת. פעולה זו מאפשרת הגילוי של דם פגמים ומאפשר סמים הקרנת להתנהל בקלות.
המטרה הכוללת של בדיקה זו היא למנות ולבחון את ההתמיינות של תאי אב המטופויאטיים בעובר דג הזברה המתפתח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על כמה שאלות חשובות באמת בתחום ההמטופויאטי כמו למשל כמה תאי גזע ואב נמצאים למעשה בעובר של דג זברה מתפתח. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא מהירה, זולה יחסית וקלה לביצוע.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מספר האבות הקיימים בדג הזברה המתפתח, היא גם מאפשרת לחוקרים למדוד את ההשפעה התפקודית שיש לתרופה או למוטציה גנטית על היווצרות אבות הדם. היה לנו את הרעיון לשיטה הזו, כשהפלנו גנים ששיערנו שהם חיוניים להתפתחות הדם. חזינו שנוכל למדוד את ההבדל בין עוברים המתפתחים באופן נורמלי לבין אלה שהיו מורפנטים באמצעות בדיקה זו.
כדי להלבין עוברי דג זברה, השתמש במיכלי פלסטיק כדי ליצור שלוש תחנות שטיפה, כאשר אחת מכילה מיליליטר אחד של חמישה אחוז אקונומיקה לליטר אחד של E3 ושתי תחנות המכילות E3 סטרילי. בעזרת פיפטת העברה, הכניסו את העוברים למסננת תה וטבלו אותם בתחנת כביסה מספר אחת למשך חמש דקות. לאחר מכן העבירו את מסננת התה עם העוברים לתחנת שטיפה מספר שתיים למשך חמש דקות. חזור על הפעולה עבור תחנת כביסה מספר שלוש למשך חמש הדקות האחרונות.
לאחר השטיפה האחרונה, הוציאו את העוברים ממסננת התה על ידי הפיכתה על צלחת פטרי נקייה בגודל 10 ס"מ והשתמשו בפיפטה העברה וב-E3 סטרילי כדי לשטוף בעדינות את העוברים מהמסננת. כדי לפרק את העוברים, השתמש בפיפטה העברה כדי להסיר ולהשליך כמה שיותר E3 מצלחת הפטרי. לאחר מכן הוסיפו לעוברים 500 מיקרוליטר של dechorionation prodeas ודגרו אותם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
לאחר מכן, הקש בעדינות על הצד של צלחת הפטרי כדי להסיר לחלוטין את הכוריון. לאחר מכן, בעזרת פיפטה סרולוגית, הוסף 20 מיליליטר E3 סטרילי כדי לדלל את הפרודאות. אפשר לעוברים להתיישב והשתמש בפיפטה כדי להסיר את ה-E3. חזור על שלב כביסה זה שלוש פעמים כדי להסיר את כל עקבות ה-dechorionation prodeas.
כדי להכין דגימות עוברים, השתמש בפיפטה כדי למקם 10 עוברים בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי יחיד של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוציאו בזהירות את ה-E3 והשליכו אותו. העבירו דגימות לקולט אדים למינארי, ושטפו את העוברים על ידי הוספת מיליליטר אחד של E3 סטרילי, מה שמאפשר לעוברים להתיישב בתחתית הצינור.
לאחר מכן, השתמש בפיפטה P1000 כדי להסיר את הסופרנטנט. חזור על הפעולה בסך הכל שלוש כביסות. לאחר הכביסה האחרונה, הסר את ה-E3 והשליך אותו.
לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של 10 מילי-מולרי DTT ב-E3 כדי להסיר את ציפוי הריר וכל נבגים, שמרים או חיידקים שעלולים להילכד בו סביב העוברים. כעת, הניחו את צינור המיקרו-צנטריפוגה בצורה אופקית ודגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. כדי לנתק את העוברים, השתמש במיליליטר אחד של DPBS סטרילי כדי לשטוף את הדגימה שלוש פעמים.
לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 500 מיקרוליטר DPBS עם סידן ומגנזיום וחמישה מיקרוליטר של חמישה מיליגרם למיליליטר דיסוציאציה prodeas. דגרו את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלול אופקי ב-180 סל"ד למשך 60 דקות. לאחר מכן, הניחו את הדגימות ואת מכסה הזרימה הלמינרי והשתמשו ב-P1000 כדי לשלש את העוברים עד שהדגימות מתנתקות לחלוטין.
היזהר ובדוק עוברים מעת לעת כדי לקבוע מתי הם מנותקים. אתה רוצה שתהיה רקמה כלשהי. אפשר לעכל יתר על המידה את העוברים מה שיהרוס את תאי האב.
פיפטה את 10 העוברים המנותקים על המאגר העליון של צינור תחתון עגול פולי סטירן בנפח 5 מיליליטר עם מכסה מסננת תאים של 35 מיקרומטר. בעזרת פיפטה ו-PBS סטרילי, שטפו את צינור העובר והעבירו את התמיסה לצינור פולי סטירן בנפח חמישה מיליליטר המכיל תאים מסוננים. חזור על השטיפה עד שארבעה מיליליטר נוזלים נמצאים בצינור.
צנטריפוגה של הצינורות בכוח הכבידה פי 300 וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לפלוט את דגימת התא ההומוגנית. בעזרת פיפטה, הסר והשליך את הסופרנטנט מהצינור התחתון העגול, תוך הקפדה לא לשבש את התאים הגלולים בתחתית. לאחר מכן השתמש ב-100 מיקרוליטר של PBS כדי להשעות מחדש את התאים.
הכן תמיסת מלאי מתיל צלולוז אחת X מלאה והשתמש בשלושה מזרקים של מיליליטר ו-16 מחטי מד כדי להוסיף 2.5 מיליליטר של צינורות תחתונים עגולים סטריליים של 14 מיליליטר. השתמש בשפופרת אחת לכל מצב שנבדק. להתמיינות מיאלואידית, הוסף אחוז אחד של סרום קרפיון ו-0.3 מיליגרם למיליליטר של גורם מגרה מושבת גרנולוציטים רקומביננטי של דג זברה או GCSF למדיום מתיל צלולוזה.
להתמיינות אריתרואידית, הוסף אחוז אחד של סרום קרפיון ו-0.1 מיליגרם למיליליטר של דג זברה רקומביננטי אריתרופויטין או EPO למדיום מתיל צלולוזה. כדי לבחון אבות מרובי שושלות, הוסף EPO ו-GCSF. בעזרת פיפטה, הוסף 100 מיקרוליטר מתוך 10 העוברים המנותקים לפני השטח של המתיל צלולוז המוכן עם הציטוקינים הרקומביננטיים בסרום קרפיון.
מכסים את המכסה ומערבולת בעדינות כדי להומוגניזציה מלאה של הדגימה. כל צינור אמור להכיל כעת את הרקמה המנותקת של 10 עוברים. בעזרת שלושה מזרקים של מיליליטר ו-16 מחטי מדידה, יש לצרף מיליליטר אחד של דגימה לשתי צלחות פטרי נפרדות של 35 מילימטר.
וודאו שהדגימה מפוזרת במלואה בכל צלחת הפטרי. חזור על הפעולה עבור כל דגימה. מניחים את צלחות הפטרי בגודל 35 מילימטר עם תאים ומתיל צלולוז לצלחת פטרי בגודל 15 סנטימטר.
לכל צלחת גדולה מוסיפים צלחת אחת של 35 מילימטר עם חמישה מיליליטר מים סטריליים כדי להרטיב את הדגימות. דגרו את המנות בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני למשך שבעה עד 10 ימים. לבסוף, דמיינו את יחידות המושבה היוצרות על פי פרוטוקול הטקסט.
לאחר שבעה ימים בתרבית עם גורמים תומכים המטופויאטיים, אבות מ-48 דגי זברה עובריים HPF נספרו וצולמו. חשוב לציין, כמות ה-CF המשמשת נמצאת בקורלציה ישירה עם מספר העוברים המצופים. ציפוי של ארבעה או שמונה עוברים למיליליטר, המקביל להתחלה עם 10 או 20 עוברים, בתחילת הניסוי, מניב כ-1200 או 2400 CFUs בהתאמה.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים וחצי אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לעכל יתר על המידה את העוברים מכיוון שהדבר יהרוס את תאי האב. בעזרת הליך זה תוכלו להשוות את מספר האבות הקיימים בנקודות זמן שונות.
אתה יכול להשוות בעלי חיים מוטנטיים עם חיות בר מסוג בר, כמו גם לבדוק את השפעת התרופות על התפתחות הדם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקת מתיל תאית כדי לספור אבות המטופויאטיים של דג הזברה. אתה יכול לשנות הליך זה כך שיתאים לצרכי הניסוי הספציפיים שלך, כגון בדיקת ציטוקינים ספציפיים.
אל תשכח, שעבודה עם דם ומחטים של בעלי חוליות עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט בזהירות בעת ביצוע בדיקה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לכימות תאי גזע ופרוגניטורים המטופואטיים (HSPCs) בעוברים של דגי זברה. הטכניקה מאפשרת זיהוי של פגמים בדם ומסייעת בסריקת תרופות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה המטופואטית
- התפתחות עוברית
- סריקת תרופות
רקע
- הבנת הדינמיקה של תאי גזע ותאי פרוגניטור המטופואטיים היא קריטית לביולוגיה התפתחותית.
- דגי זברה משמשים כארגון מודל לחקר התפתחות הדם.
- ייתכן ששיטות קיימות חסרות יעילות ונגישות.
- שיטה זו שואפת לספק גישה מהירה וחסכונית.
מטרת המחקר
- לספירה של תאי אב המטופויטיים בעוברי דגי זברה (zebrafish) מתפתחים.
- להערכת ההשפעה של מוטציות גנטיות ותרופות על היווצרות תאי אב של דם.
- לשיפור ההבנה של מנגנוני התפתחות הדם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסוציאציה של עוברי דג זברה לבידוד HSPCs.
- זריעת תאים במתילצלולוז עם גורמי תמיכה.
- תצפית על התמיינות לתאי דם בוגרים.
- השוואה בין עוברים נורמליים לעוברים שעברו שינוי גנטי.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת כימות של HSPCs בעובר מתפתח.
- חוקרים יכולים לזהות הבדלים ביצירת תאי דם פרוגניטורים כתוצאה משינויים גנטיים.
- ניתן לבצע סריקת תרופות ביעילות באמצעות טכניקה זו.
- השיטה מספקת תובנות לגבי תפקידם של גנים ספציפיים בהתפתחות הדם.
מסקנות
- בדיקה זו היא כלי בעל ערך לחקר ההתפתחות ההמטופואטית.
- היא מספקת שיטה מהירה וחסכונית עבור חוקרים.
- הטכניקה משפרת את ההבנה של הדינמיקה של תאי אב של דם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ספירה כמותית של תאי גזע ופרוגניטורים המטופואטיים (HSPCs) בעוברים של דגי זבברה נותנת מענה לצוואר בקבוק קריטי בשלבי הגילוי המוקדמים של תרופות המטופואטיות ותיקוף של מטרות גנטיות. בדיקה זו in vitro מאפשרת הערכה תפקודית מהירה ומשתלמת של התערבויות מועמדות, ובכך תומכת בביטחון חיזוי ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלב הפרה-קליני. גישה זו מייעלת את מיון תיק הפיתוח על ידי אספקת נתונים ניתנים לשכפול ובקנה מידה רחב על ביולוגיית HSPC הרלוונטית להתפתחות הדם ולמידול מחלות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר כימות ישיר של HSPCs לבחינת היפותזות טיפוליות בהמטופואזה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות גנטיות והתערבויות במסלולים במודל של חולייתנים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי הבחנה בין השפעות של מוטציות או תרכובות על היווצרות תאי מקור.
- מספק נתונים ברי-יישום לתיעדוף מטרות בעלות פוטנציאל טרנסלציוני בהפרעות דם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור להערכת השפעות של תרופות או גורמים גנטיים על השגחה (proliferation) ובידול של HSPC.
- מייצרת תוצרי יחידות יוצרות מושבה (CFU) כמותיים להשוואה אמינה בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מפחיתה מחסומים טכניים ועלויות, ובכך מאפשרת אימוץ נרחב יותר עבור יוזמות של סריקה בסריקה גבוהה (high-throughput screening).
- מכינה מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של סריקה מכניסטית או פנוטיפית בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם ביולוגיה המטופואטית הרלוונטית למחלה לצורך חקירת ביומרקרים טרנסלציונליים.
- תומך ברצף מהשלבים המוקדמים של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לקבלת תוצאות פונקציונליות במערכת של בעלי חוליות.
- מספק פלטפורמה לקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון במסלולי פיתוח של תרופות המטופואטיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
בדיקת HSPC ב-in vitro בדגי zebrafish זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין תיקוף מוקדם של מטרות, סריקה ומחקר תרגומי של תוכניות המטופואטיות.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי כימות תגובות של תאי אב לשיבושים גנטיים או כימיים.
- סריקה: מציע מדידות CFU כמותיות וניתנות לשחזור לצורך בדיקת מוכנות של המערך והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של תוצרי HSPC במצבים של סוג בר (wild-type), מוטנטים ותנאים מטופלים בתרופות.
- מחקר תרגומי: מספק נתונים פונקציונליים הרלוונטיים להמטופואזה של חולייתנים ולמידול מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת בדיקה ניתנת להרחבה ולהתאמה לצרכי סריקה ומחקר המטופואטיים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מנגנונית בתיקוף של מטרות המטופו-פואטיות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) לצורך אימוץ על ידי צוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון באמצעות אספקת נתונים מהירים וניתנים ליישום.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של תוכניות המטופו-פואטיות בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בדגי zebrafish, בדיסוציאציה של עוברים ובטכניקה סטרילית.
- נדרשת גישה לתשתיות תרביות תאים ולדימוי לצורך כימות CFU.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים של צפיפויות זריעה ותנאי ציטוקינים לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאימה לרקעים גנטיים שונים או לפאנלים של ציטוקינים עבור שאלות מחקר ספציפיות.
- נדרשת אופטימיזציה קפדנית כדי למנוע עיכול יתר ואובדן של תאי אב (progenitor cells).
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Bleach and Dechorionate 48 hpf Zebrafish Embryos
3:19
Embryos for Dissociation
5:15
Preparation of Dissociated Embryos
6:21
Preparation of Methylcellulose
7:30
Addition of Dissociated Embryos to Methylcellulose
8:53
Results: Quantitation of Zebrafish Embryonic Hematopoietic Stem and Progenitor Cells
9:32
Conclusion
