DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להגדיל את כמות ה-DNA הדו-גדילי המבודד וספריות ריצוף בתפוקה גבוהה לאחר מכן מדגימות עשבים, ולמקסם את התועלת שלהן במחקרים פילוגנומיים. שיטה זו פותחת את הפוטנציאל של דגימות עשבייה שאחרת לא היו שימושיות לפרויקטים של ריצוף כרצפים גנומיים בגלל השפלה נרחבת של הדגימה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא חזקה מספיק כדי שניתן יהיה להשתמש בדגימות עשבייה נדירות ומשמעותיות מבחינה היסטורית ללא צורך בדגימה הרסנית נרחבת.

טכניקה זו מרחיבה את עומק דגימת הטקסונים בפרויקטים מרווחים שיטתיים. רכישת מינים היא צעד מגביל, אך עם פרוטוקול זה, ניתן להשתמש בקלות באוספים היסטוריים במחקרים אלה. הוסף חנקן נוזלי ו -30 עד 50 מיליגרם של חול מעוקר כדי לטחון סנטימטר מרובע אחד של רקמת עשבייה שנבחרה מראש לאבקה דקה בטיט ועלי מקוררים מראש.

טחינה נאותה חיונית לבידוד DNA מוצלח. ויש להקפיד שהדגימה תהיה מרוסקת לחלוטין. לאחר מכן, הוסיפו את האבקה הקפואה לשני צינורות של שני מיליליטר, וממלאים לא יותר ממחצית מנפח הצינור.

לאחר מכן הוסף 600 מיקרוליטר של תמיסת CTAB חמה לכל צינור. מערבבים היטב את האבקה על ידי היפוך ומערבולת. לאחר מכן דגרו את הדגימות באמבט מים שנשמר על 65 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעה וחצי.

בינתיים, מערבולת כל 15 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב -10, 000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, העבירו כ-500 מיקרוליטר של הסופרנטנט לסט חדש ורענן של צינורות מסומנים.

לסופרנטנט, הוסף ארבעה מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר של RNase A לכל מנגינה. לאחר מכן מערבבים את תכולת הצינור על ידי היפוך או פיפטינג. דגרו את הדגימות בבלוק חום או באמבט מים שנשמר על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר שהצינורות השיגו את טמפרטורת החדר, הוסיפו לדגימות כ-500 מיקרוליטר של תערובת פנול, כלורופורם, איזואמיל אלכוהול. לאחר מכן מערבבים את תכולת הצינורות על ידי היפוך או פיפטינג חוזר. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות בחום של 12, 000 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

העבירו את השכבה המימית העליונה, שהיא כ -400 מיקרוליטר, לסט טרי של צינורות מסומנים. לשכבה המימית בכל צינור, הוסיפו כ -400 מיקרוליטר של 24: 1 כלורופורם, תערובת אלכוהול איזואמיל. מערבבים היטב את הדגימה על ידי פיפטינג חוזר או היפוך.

לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות ב -12, 000 גרם למשך חמש דקות והעבירו כ -300 מיקרוליטר של שכבה מימית עליונה לצינורות מקוררים מראש ומסומנים. לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטר של איזופרופנול מקורר מראש ו -12 מיקרוליטר של 2.5 נתרן אצטט מולארי. לאחר מכן דגרו את הצינורות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות.

לאחר הדגירה מוציאים את הדגימות מהמקפיא. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב -12, 000 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה יש לשטוף את הגלולה בכ-300 עד 500 מיקרוליטר של אתנול 70%.

שוב, צנטריפוגה את הצינורות ב 12, 000 גרם למשך 10 דקות. ואז מבלי להפריע לגלולה, הסר בזהירות את הסופרנטנט. לאחר מכן, יבשו את הכדורים באוויר והמיסו את ה-DNA ב-50 מיקרוליטר של מאגר 1X Tris-EDTA.

הוסף אחד עד 16 מיקרוליטר של DNA מבודד ושני מיקרוליטר של מאגר תגובת פיצול בצינור תגובת שרשרת פולימראז של 0.2 מיליליטר. התאם את הנפח הסופי ל -18 מיקרוליטר עם מים נטולי נוקלאז. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטרים של אנזים פיצול DNA דו-גדילי ומערבל את התערובת לזמן קצר למשך שניות עץ.

לאחר מכן דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 8.5 דקות במחזור התרמי. לאחר הדגירה, הוסף חמישה מיקרוליטרים של 0.5 EDTA מולארי לצינורות. הוסף 25 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז כדי להתאים את הנפח הכולל של ה-DNA הגזוז ל-50 מיקרוליטר.

לאחר מכן הוסיפו 45 מיקרוליטר של חרוזי SPRI שנשמרו בטמפרטורת החדר ל-50 מיקרוליטר של DNA גזוז וערבבו את השניים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. השאירו את הדגימה המכילה את הצינורות למשך חמש דקות. לאחר מכן העבירו את הצינורות על צלחת מגנטית והמתינו חמש דקות נוספות.

גרש בזהירות את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של אתנול טרי 80% לצינורות במעמד המגנטי והמתן עוד 30 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר 30 שניות, הסר בזהירות את הסופרנטנט.

השאר את מכסה הצינור פתוח לייבוש החרוזים באוויר למשך חמש דקות על המעמד המגנטי. לאחר מכן הסר את הצינורות ממעמד המגנט והוציא את ה-DNA מהחרוזים ב-55 מיקרוליטר של מאגר 0.1X Tris-EDTA. מערבבים היטב את ה-DNA על ידי פיפטינג חוזר ונשנה.

לאחר מכן דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. שוב, הנח את הצינור על המעמד המגנטי והמתן עד שהתמיסה תתבהר תוך כשתי דקות. הסר 52 מיקרוליטר של הסופרנטנט ולאחר מכן בצע ניתוח כימות DNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

ל-50 מיקרוליטר של DNA נקי וגזוז, הוסף שלושה מיקרוליטרים של אנדונוקלאז, אנזימי זנב פוספט ושבעה מיקרוליטרים של מאגר תגובה. מערבבים היטב את ה-DNA ושאר המרכיבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. ואז סובב את הצינורות כדי להסיר את הבועות.

לאחר הסיבוב, העבירו את הדגימות לתרמו-סייקלר והגדירו את התוכנית. יש לדלל את המתאם פי 25 עד 50 כדי להשיג ריכוז עבודה של 0.6 עד 0.3 מיקרומולר. לריצוף קריאה קצרה בתפוקה גבוהה, הוסף 30 מיקרוליטר של תערובת מאסטר קשירה, מיקרוליטר אחד של משפר קשירה ו-2.5 מיקרוליטר של מתאם לצינורות.

מערבבים היטב את תכולת הצינורות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. שוב, סובב את הצינורות כדי להסיר בועות. לאחר מכן דגרו את הצינור בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

הוסף שלושה מיקרוליטרים של תערובת מסחרית של אורציל-DNA גליקוזילאז ו-DNA גליקוזילאז אנדונוקלאז VIII לצינורות. התאם את הנפח הכולל ל-96.5 מיקרוליטר. מערבבים היטב את הרכיבים ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות במחזור התרמי.

בצינור, הכינו את תערובת תגובת שרשרת הפולימראז על ידי הוספת כל הריאגנטים ל-DNA נקי וקשור במתאם. ואז מערבבים היטב את התגובה על ידי מערבולת. לאחר סיום המערבולת, הכניסו את הדגימות לתרמו-סייקלר והתחילו את הגדרת ההגברה התרמו-ציקלרית.

הוסף לדגימה כ -25 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים הנשמרים בטמפרטורת החדר וערבב על ידי פיפטינג חוזר. דגרו את הדגימה למשך חמש דקות. לאחר מכן העבירו את הצינורות על מעמד מגנטי והמתינו חמש דקות נוספות.

לאחר חמש דקות, הוציאו את הסופרנטנט לסט חדש של שפופרות עם תווית. לאחר מכן, לסופרנטנט, הוסיפו שישה מיקרוליטרים של חרוזי SPRI שנשמרו בטמפרטורת החדר וערבבו היטב. לאחר דגירה של הדגימות במשך חמש דקות, העבירו את הצינורות על הצלחת המגנטית והמתינו חמש דקות נוספות.

הסר והשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של אתנול טרי של 80% לצינורות שעל המעמד המגנטי. לאחר מכן, דגרו את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות.

לאחר 30 שניות, הסר בזהירות את הסופרנטנט וייבש את החרוזים באוויר למשך חמש דקות כשמכסה הצינור פתוח בעודו על המעמד המגנטי. כעת הסר את הצינורות מהמגנט. הוציא את ה-DNA המטרה מהחרוזים ל-33 מיקרוליטר של מאגר 0.1X Tris-EDTA ובכפוף לערבוב יסודי.

לאחר ערבוב נכון, יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן העבירו את הצינורות למעמד המגנטי והמתינו כשתי דקות עד שהתמיסה תתבהר. פיפטה 30 מיקרוליטר של צינורות הסופרנטנט לשני מיליליטר לאחסון.

כדי להראות את הבידוד של DNA עשבוני, הופעל ג'ל אגרוז עם DNA דו-גדילי שבודד מדגימות עשבייה שונות. באמצעות 10 מיליגרם של רקמת עלים, כמעט 3.56 עד 2, 610 ננוגרם של DNA דו-גדילי בודד הועמסו על ג'ל האגרוז. הג'ל מראה DNA עשבוני פגום בצורת מריחה בכל הנתיבים.

לאחר מכן, על מנת להראות התאוששות של ספריית ריצוף איכותית מ-DNA שבודד מ-10 דגימות עשבים, הופעל ג'ל אגרוז. לפני הטעינה על ג'ל האגרוז, כ-1.26 עד 464 ננוגרם של ה-DNA של העשבייה המבודדת עברו גזירה אנזימטית וניקוי בנפח חרוז של 90%. ג'ל האגרוז מראה התאוששות של ספריית ריצוף איכותית מה-DNA של 10 דגימות עשבים.

ספריות ריצוף סופיות מציגות פס ראשי בין 300 ל-500 זוגות בסיסים. לאחר מכן כדי להראות את רצף רובה הציד של DNA שמקורו בעשבים, התקבלה תרשים מעגלי של גנום כלורופלסט TK 686. הרצף מציג את האורך הכולל של ה-DNA, אזור חזרה הפוך ונוכחות של אזורים גדולים וקטנים של עותק בודד.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו על 24 דגימות בפחות מ-13 שעות עם כשמונה שעות בלבד של זמן מעשי פעיל. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון לכידת רצף, על הספריות המתקבלות כדי ליצור נתונים גרעיניים למחקרים פילוגנטיים.