מיפוי מטבולית: אנזים כמותית Cytochemistry ו להסטולוגיה כדי לקבוע את הפעילות של Dehydrogenases של תאים ורקמות
26 במאי 2018
כאן, אנו מציגים פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להמחיש ולכמת פעילות של dehydrogenases, תאים, רקמות, קינטיקה, הפונקציה והאטרקציות לוקליזציה subcellular ברמה המיקרוסקופית.
סרטון זה מראה כיצד לבצע מיפוי מטבולי. הליך לכימות פעילותם של אנזימים ספציפיים הנקראים דהידרוגנאזות. התאים נצמדים לשקופית מיקרוסקופיה או לרקמה קפואה.
לפני עשרות שנים פיתחנו סדרה שלמה של טכניקות מיפוי מטבוליות שנקראו אז אנזימיסטוכימיה כדי לזהות פעילות ברקמות ובתאים תחת המיקרוסקופ. עם זאת, חילוף החומרים התיישן במהלך המהפכה הגנטית בסוף המאה הקודמת. אבל עכשיו, חילוף החומרים שוב חם.
הסתכלו, למשל, על התאים הסרטניים. חילוף החומרים נחשב כיום למטרה טיפולית, ולכן קביעות הפעילות בתאים וברקמות שוב חמות. מרכיב מרכזי במאגר התגובה הוא אלכוהול פוליוויניל, או PVA.
זה מומס במאגר פוספט בריכוז של 18% PVA מאובק ורעיל בשאיפה, לכן הקפידו לשקול PVA מתחת למכסה אדים. בגלל ריכוז ה-PVA הגבוה במאגר הפוספט, מחממים את בקבוק חיץ התגובה או ביין-מארי תוך כדי ערבוב. הקפד להבריג את המכסה בצורה רופפת על הבקבוק אחרת הבקבוק עלול להתפוצץ.
ייתכן שיחלפו עד 15 דקות עד שה-PVA יתמוסס לחלוטין במאגר הפוספט. אם כן, התמיסה צריכה להיות שקופה עם בועות אוויר קטנות שנגרמו מהערבוב. ניתן להזרים את תמיסת ה-PVA הצמיגה לצינורות חיץ תגובה באמצעות פיפטה רחבה.
שמור על הצינורות לפחות 40 מעלות צלזיוס ומעלה כדי למנוע את התמצקות ה-PVA. מיליליטר אחד של תמיסת PVA טוב לכארבעה ציטוספינים, או שני תכשירי רקמות. עבור שאר המרכיבים של מאגר התגובה, הניטרובלו הצהוב טטרזוליום כלוריד הנקרא גם nitroBT, מומס בתערובת של אתנול ודימתילפורממיד, תוך חימום בבקבוקון זכוכית במבער בונסן .
הפתרון לא אמור להגיע לרתיחה או שהנפח יקטן יותר מדי. אז אל תשאירו את הבקבוקון זמן רב מדי בלהבה ונערו באופן קבוע. שמור אותו על קרח לאחר המסה והמשך לשלב הבא במהירות כאשר ה-nitroBT המומס גווע במהירות.
NitroBT היא אבקה צהובה שתשכב על תחתית בקבוקון הזכוכית המכילה אתנול ו-DMF כאשר היא לא נשמרת מומסת. אתה יכול לבדוק כל כמה פעמים אם ה-nitroBT מומס. לאחר מכן התמיסה תהיה צהובה, שקופה.
כאשר הוא מומס, ניתן להזרים את ה-nitroBT לבקבוקונים המכילים את תמיסת ה-PVA. ערבבו בעדינות בעזרת כף דקה או מרית דקה כדי לערבב את ה-nitroBT ואת המאגר. עשה זאת עבור כל הרכיבים של מאגר התגובות צעד אחר צעד המפורטים בטבלה הראשונה של הטקסט המלא.
נסו לא ליצור יותר מדי בועות אוויר תוך כדי ערבוב רכיבי התגובה לתמיסת ה-PVA. החוכמה היא לערבב ברציפות מבלי להוציא את הכף או המרית מהתמיסה. נושא האלקטרונים, מתוקסי פנאזיניום מתיל סולפט, אמור להיות מוגן מפני אור ולהמיס אותו במאגר התגובה האחרון.
הצבע האדום של ה-MPMS נוח לבדוק שוב אם כל הרכיבים מומסים כהלכה. תוך כדי הכנת מאגר התגובה וערבוב הרכיבים לתוכו, יש לחמם את השקופיות למשך 50 דקות בחממה המכילה מים חמים. שמור על מפלס מים נמוך בתוך תא הדגירה.
כשהמכסה סגור, זה ישמור על סביבת התגובה לחה. כשהמכסה פתוח, המים ישמרו על המגלשות בטמפרטורה חמה. מרחו את מאגר התגובה על התא או על תכשירי הרקמה באמצעות פיפטה מזכוכית.
אל תדאג לגבי בועות אוויר קטנות מכיוון שאלו יזרמו אל פני השטח וזה לא יפריע לתגובה בתאים או ברקמות. שמור את מכסה תא הדגירה סגור בזמן הדגירה. זה יוודא שהתגובה מתרחשת בסביבה לחה כדי למנוע את התייבשות מאגר ה-PVA.
רוב תגובות הדהידרוגנאז בניסויי מיפוי מטבולי מתרחשות ב-37 מעלות צלזיוס. דגרו את השקופיות במאגר התגובה למשך פרק זמן מוגדר מראש, אותו ניתן למצוא בטבלה הראשונה של מאמר הטקסט המלא. ניתן לראות בקלות אם התגובה עבדה או לא כאשר התאים, או הרקמה, יהפכו לכחולים כהים או סגולים, עקב פעילות הדהידרוגנאזות.
מה שהופך בסופו של דבר לניטרוBT בלתי מסיס חסר צבע לפורמזול הכחול הכהה, המשקע באתר פעילות הדהידרוגנאז. התגובה האנזימטית נעצרת בשלושה שלבים. ראשית, יש להקיש על מדיום הדגירה העודף על טישו.
שנית, יש לשטוף את מדיום הדגירה משקופיות המיקרוסקופיה באמצעות שטיפה מכנית במאגר פוספט של PH של 5.3 ב-60 מעלות צלזיוס. שלישית, יש להשאיר את שקופיות המיקרוסקופיה במאגר פוספט טרי של PH 5.3 ב-60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. רביעית, ניתן לשטוף את מאגר הפוספט באמצעות ברז ולאחר מכן מים מזוקקים.
אפשר לראות בקלות את מאגר התגובה יורד. ה-PH הנמוך של מאגר העצירה מסייע בעצירת תגובת הדהידרוגנאז בתוך התאים. הנח את השקופיות במאגר עצירה טרי פעם או פעמיים בהתאם לכמות השקופיות שאתה מעבד בכל פעם.
שוטפים גם את המגלשות במי ברז ומסיימים במים מזוקקים. כעת, ניתן לייבש את המגלשות על מחמם מגלשות ולסגור אותן. יבש בזהירות את הצד האחורי של המגלשה על ידי ניגובו והניח על מחמם שקופיות שחומם מראש ל-50 עד 60 מעלות צלזיוס.
כאשר המגלשות יבשות, ניתן להשתמש בתמיסת גליצרין גליצרול והחלקות כיסוי כדי לסגור ולשמר שקופיות. שמור את השקופיות במקרר עד שתמשיך ברכישת התמונה. זהו מיקרוגרף צילום צבעוני של קטע רקמה מייצג על שקופית זכוכית שעובד בניסוי המוצג בסרטון זה.
זהו קטע גליובלסטומה ולפטו דהידרוגנאז הוא האנזים שנחקר. כל דהידרוגנאז מייצר ישות PH וכל מולקולת PH ממירה מולקולה אחת של nitroBT, מלח הטטרזוליום הצהוב, למולקולה אחת של פורמזול, המשקע הסגול המוצג בתמונה זו. ניתן לראות פעילות גבוהה של לקטט דהידרוגנאז תוך תאית בתאי הגידול המוצגים כסגולים כהים.
לכלי הדם יש פעילות נמוכה יותר, והם לבנים. זוהי תמונה מונוכרומטית של אותו אזור בשקופית. שניתן להשתמש בו כדי לכמת את פעילות האנזים כמתואר בפרוטוקול.
ככל שמפיקים יותר פורמזן, כך הפיקסל כהה יותר והספיגה גבוהה יותר. לאחר מכן ניתן להמיר את הספיגה לפיקומולים של ישות ph שנוצרו. אז מיפוי מטבולי קל לביצוע.
זה מאוד מהיר וזה זול. אז השתמש בו במחקר שלך.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לוויזואליזציה מיקרוסקופית וכמותית של פעילות דהידרוגנאז בתאים וברקמות. הוא מפרט את הקינטיקה, התפקיד והמיקום התת-תאי של אנזימים אלה, תוך דגש על רלוונטיות שלהם במחקרי מטבוליזם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מטבוליזם
רקע
- דהידרוגנזים הם אנזימים מרכזיים במסלולים מטבוליים.
- שיטות למיפוי מטבולי התפתחו לאורך עשורים.
- העניין האחרון בחילוף חומרים כמטרה טיפולית החיה מחדש טכניקות אלו.
- הבנת הפעילות האנזימטית חיונית לחקר המטבוליזם התאי.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול מפורט לכימות פעילות דהידרוגנאז.
- הדגשת החשיבות של מיפוי מטבולי במחקרים עדכניים.
- הקלה על ויזואליזציה של קינטיקה ומיקום של אנזימים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת באפרי תגובה בעלי רכיבים ספציפיים.
- החלת הבאפרים על תכשירים של תאים או רקמות.
- אינקובציה בתנאים מבוקרים כדי לאפשר התרחשות של תגובות.
- ויזואליזציה מיקרוסקופית של פעילות אנזימטית באמצעות שינויים קולורימטריים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של פעילות דהידרוגנאז בדגימות שונות.
- נצפו שינויים בצבע המעידים על פעילות אנזימטית.
- הפרוטוקול מאפשר כימות של קינטיקה אנזימטית.
- הדגמת יישום בחתכים של רקמת גליובלסטומה.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר דהידרוגנאזות.
- מיפוי מטבולי הוא חיוני להבנת המטבוליזם התאי.
- מחקרים עתידיים יכולים להבסס את עצמם על טכניקות אלו כדי לבחון מטרות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי מטבולי מספק כימות ישיר, in situ, של פעילות דהידרוגנאז, ומציע מדדים תפקודיים המשלבים נתונים גנומיים ופרוטאומיים בתהליך תיקוף מטרות. הדבר מאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית על ידי קישור תפקוד האנזים לפנוטיפים של מחלה, ובכך תומך בביטחון חיזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי. התאימות של הטכניקה למערכות מיקרוסקופיה וניתוח תמונות סטנדרטיות מאפשרת שילוב בר-הרחבה בתהליכי סריקה ובמסלולי עבודה תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מודד פעילות אנזימטית פונקציונלית בהקשר תאי טבעי, ובכך מבהיר היפותזה טיפולית ומעורבות של מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה מהירה של מודולציה של דהידרוגנאז על ידי הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר נתוני פעילות כמותיים עם רזולוציה מרחבית, המתאימים לאישור פגיעות (hit confirmation) ולאפיון תגובה למינון.
- ערך תפעולי: משתמש בקריאה כרומוגנית התואמת למיקרוסקופיה מונוכרומטית ולניתוח תמונות אוטומטי לסריקה בקיבולת בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: משמר לוקליזציה תת-תאית של פעילות, ובכך מספק מידע על הרלוונטיות של סמנים ביולוגיים ברקמות רלוונטיות למחלה, כגון חתכים של גידולים.
- ערך תפעולי: תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות אספקת קריאות מטבוליות פונקציונליות במערכות מודל שונות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מיפוי מטבולי משתלב ברצף הגילוי מהערכת מעורבות המטרה (target engagement) ועד לאופטימיזציה של מוביל (lead optimization), ומספק תיקוף תפקודי המגשר בין בדיקות ביוכימיות לתוצאות פנוטיפיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי כימות שינויים בפעילות דהידרוגנאז בתגובה למודולטורים של מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספק תוצאים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת השפעת תרכובות בתאים או ברקמות מקובעים.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של בליעת פורמזן כמדד למספר התחלופות של האנזים, דבר המקל על ניתוח קשרי מבנה-פעילות.
- מחקר תרגומי: שומר על ארכיטקטורת הרקמה ומיקום האנזים, ובכך מסייע בהשלכה למודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ברמה ארגונית: דורש רק ציוד מעבדה סטנדרטי (אינקובטור, מיקרוסקופ, פיפטות), מה שמאפשר אימוץ רחב בין מחלקות ללא צורך בתשתיות ייעודיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור פעילות אנזימטית לפנוטיפ תאי בתנאים קרובים לפיזיולוגיים.
- ערך תפעולי: באפר תגובה סטנדרטי ופרוטוקול עצירה מבטיחים שחזוריות בין משתמשים ואתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go באמצעות אספקת נתונים מטבוליים פונקציונליים המנבאים את השפעת תרכובים על שטף המסלול (pathway flux).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון בהתבסס על פעילות דהידרוגנאז מאוששת במודלים של מחלות.
שיקולי יישום
- מיומנות טכנית בטיפול בתמיסות PVA צמיגיות ובנשאי אלקטרונים רגישים לאור.
- גישה למיקרוסקופיית אור מונוכרומטית ותוכנה לניתוח תמונות לצורך כימות.
- סטנדרטיזציה של זמן האינקובציה, הטמפרטורה וה-pH בין הניסויים השונים.
- שיקולי התאמה לשיטות קיבוע רקמה שונות ולדרישות חדירות (permeability).
- מגבלה: פורמט של בדיקת נקודת סיום (endpoint assay) מונע ניטור קינטי בזמן אמת.
![חקירת חילוף החומרים הלבבי בלב עכבר מבודד עם היפרפולריזציה [1-13C] פירובט וספקטרוסקופיית NMR 13C/31P](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-09-01T19%253A57%253A02.000Z&w=384&q=75)
