CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) מערכת מספקת כלי מבטיח עבור הנדסה גנטית, ופותחת לו את האפשרות של שילוב יישוב של transgenes. אנו מתארים קצה בתיווך הומולוגיה להצטרף (HMEJ)-המבוססת על אסטרטגיה עבור DNA יעיל ממוקד אינטגרציה ויוו , ממוקד ג'ין טיפולים באמצעות CRISPR/Cas9.

המטרה הכוללת של אסטרטגיית HMEJ זו היא לספק כלי גנטי מבטיח למגוון יישומים, כולל יצירת מודלים של בעלי חיים מהונדסים גנטית וטיפולים גנטיים ממוקדים. HMEJ זה העביר את הצעד. יכול להיות גם שאלות מפתח בתחום הגנטי והנוירולוגי.

כגון כיצד לשפר את היעילות של אינטגרציה ממוקדת מדויקת של טרנסגנים in vivo. היתרון העיקרי של אסטרטגיה מבוססת HMEJ זו הוא היכולת לתקן מוטציות גנטיות ביעילות גבוהה in vivo. מה שקרה לאחר מכן הוא תרפויטי בפוטנציאל.

מי שתדגים את ההליך תהיה שינג וואנג, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוטוקול, אסוף 5000 תאי N2a, שהועברו בעבר עם וקטורי ביטוי Cas9 sgRNA EGFP על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי או FACS, תוך שימוש בתאים שאינם עוברים טרנספטציה כבקרה. עכל את התאים שנאספו ב -2 עד 5 מיקרוליטר של מאגר ליזה ב -56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר מכן מחממים ומפעילים את הפרוטאינאז K בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הגבירו את הדגימה על ידי PCR מקונן באמצעות פרוטוקול היצרן. מערבבים מיקרוליטר אחד של תוצר הליזיס עם DNA פולימראז וזוג פריימרים חיצוניים המזהים את הרצף סביב אתר היעד sgRNA ומבצעים את ה-PCR הראשוני בנפח כולל של 20 מיקרוליטר.

לאחר מכן, הפעל DNA פולימראז ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן בצע את ה-PCR הראשוני עם הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בצע את ה-PCR המשני באמצעות מיקרוליטר אחד של מוצר PCR ראשוני וזוג פריימרים פנימיים מקוננים. דנטורציה וחישול מחדש של 300-600 ננוגרם של מוצר PCR מטוהר ב-20 מיקרוליטר של מאגר תגובה 1x TC7EI.

הוסף מיקרוליטר אחד של אנזים T7EI למוצרי ה-PCR המחוסמים ועכל אותם ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן הפעל את מוצר העיכול על ג'ל אגרוז 2% ומאגר TAE 1x ב-120 וולט למשך 40 דקות, עד להפרדת השברים. השתמש ב-ImageJ כדי לקבוע את עוצמות הפס של DNA חתוך ולא חתוך ולחשב את תדר האינדל.

להכנת Cas9 mRNA, הוסף את רצף המקדם T7 לאזור הקידוד Cas9 על ידי הגברת PCR. לאחר מכן, הוסף את הפריימר Cas9 FR בריכוז סופי של 0.1 מיקרומולר ו-20 ננוגרם של וקטור ביטוי Cas9 לתערובת ה-DNA פולימראז בנאמנות גבוהה פי 1. התאם את הנפח הסופי ל -50 מיקרוליטר עם מים ללא נוקלאז.

הפעל DNA פולימראז ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ובצע את ה-PCR. טהר את המוצר T7 Cas9 ו-PCR לשעתוק במבחנה, או IVT. לאחר מכן תמלל 0.5 עד 1 מיקרוגרם של DNA, באמצעות ערכת שעתוק mRNA ב-37 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות בנפח כולל של 20 מיקרוליטר.

הוסף 1 מיקרוליטר של DNase לתערובת כדי להסיר את תבנית ה-DNA ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר הוספת זנב פולי (A) למשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, שחזר את ה-mRNA Cas9 עם ערכת טיהור RNA. צור את תבנית sgRNA המונעת על ידי מקדם T7 עם DNA פולימראז בנאמנות גבוהה כפי שבוצע בסעיף הקודם ובחר פיגום sgRNA המכיל וקטור כתבנית.

לאחר טיהור מוצר T7 sgRNA PCR, השתמש ב-0.5 עד 1 מיקרוגרם של DNA כתבנית לשעתוק במבחנה של sgRNA באמצעות ערכת שעתוק RNA קצרה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות, בנפח כולל של 20 מיקרוליטר. לאחר 6 שעות דגירה, הוסיפו 1 מיקרוליטר של DNase לתערובת והמשיכו את הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להסיר את תבנית ה-DNA. טהר שוב sgRNA באמצעות ערכת טיהור ה-RNA.

יש לדלל את ה-sgRNA ל-500 ננוגרם למיקרוליטר במים נטולי RNase ולאחסן את הדגימות בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים. איכות גבוהה של Cas9 mRNA ו-sgRNA ללא ניוון והקו הנכון של פרמטרים תורמי HMEJ הם השלבים הקריטיים ביותר ביצירת עכברי דפיקה. הנח את העוברים המופרים למדיום KSOM בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני.

מערבבים 100 ננוגרם למיקרוליטר של Cas9 mRNA, 50 ננוגרם למיקרוליטר sgRNA ו-100 ננוגרם למיקרוליטר של וקטור תורם HMEJ ומוסיפים מים כדי להתאים את הנפח הסופי ל-10 מיקרוליטר. פיפטו את התערובת למעלה ולמטה והניחו אותה על קרח. לאחר מכן, משוך מחטים נימיות באמצעות מושך מיקרופיפטה.

הזרקו נפח סביר של התערובת לציטופלזמה של זיגוטות עם פרו-גרעינים מוגדרים היטב בטיפה של מדיום HEPES-CZB המכיל 5 מיקרוגרם למיליליטר ציטוכלזין B באמצעות מיקרו-מזרק עם הגדרות זרימה קבועות. לבסוף, תרבית את הזיגוטות המוזרקות במדיום KSOM ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני עד לשלב הבלסטוציסט לאחר 3 וחצי ימים לתצפית פלואורסצנטית. לאחר 3 ימים של זריקות, 12.9% מהבלסטוציסטים שקיבלו תורמי HMEJ היו חיוביים ל-mCherry, מה שהתבטא אך ורק בטרופקטודרם.

על ידי ריצוף העכברים החיוביים ל-PCR, כל אירועי האינטגרציה שנבדקו היו אינטגרציות מדויקות בתוך המסגרת הן בצומת 5 ראשוני והן ב-3 ראשוניים. לאחר 7 ימים של זריקות, תמונות אימונו-פלואורסצנטיות חשפו שכמעט מחצית מההפטוציטים שעברו טרנספטציה ביטאו mCherry כצבועים בחלקי הכבד. לאחר נסיגת NTBC, צביעת כבד אימונוהיסטוכימיה של Fah תיקנה הפטוציטים של עכברים שליליים Fah שקיבלו מבנים של Fah HMEJ ו-Cas9 הראו התפשטות יעילה יותר משיטה מבוססת MMEJ.

האסטרטגיה המבוססת על HMEJ יכולה להיות פלטפורמה אידיאלית להחלפת רצף מוטנטי כמו חלק ממוטציה ברצף הנכון. מה שאינו ישים לשיטה מבוססת HHEJ. לאחר ניסוי זה, טיפול זה סולל את הדרך לחוקרים לתחום שבו שילוב מטרה מדויק לחקור יישומי טיפול רחבים.