Name: מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: למדו פרוטוקול מערבון סופג מותאם לניתוח 500 תאי גזע המטופויאטיים בלבד. השיטה מאפשרת זיהוי חלבונים ומסלולי סיגנלינג בתאים נדירים תוך הפחתת השימוש בבעלי חיים במחקר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מכוני הבריאות הלאומיים הענק R01 CA149976 (גיל חזן) נתמך עבודה זו.

כל ההליכים חייב להתבצע על פי הנחיות טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים. ההליך פותחה עבור הניתוח של מאתר hematopoietic גזע תאים וקדמון (HSCs ו HPs), אך ניתן להתאים לניתוח של אוכלוסיות תאים אחרים.
1. לזרום Cytometry בידוד HSCs מאתר ו HPs
<ol><li>קציר תאים במח העצם מאתר כמתואר ב-6ספרות. הערה: בנתונים המוצגים באיור 1 ו- 2 איור, מח העצם היה נקצרו מ C57BL/6J עכברים.</li>
	<li>לבצע דלדול שושלת היוחסין של תאים במח העצם באמצעות ערכת דלדול של שושלת היוחסין העכבר ההוראות של היצרן.</li>
	<li>דגירה התאים עם נוגדנים נגד סמני פני השטח של התא עניין כמו שמתואר7. בניסויים שמוצג באיור 1 ו- 2 איור, הנוגדנים Sca-1, קיט, Flt3 של שושלת (לין) סמנים Mac1 Gr1, CD3e, B220, Ter119 משמשים.</li>
	<li>למיין 2,000-20,000 לין– Sca1+ערכת+ Flt3 תאים– (HSCs) או לין–Sca1–ערכת+ תאים (HPs) לתוך צינורות גלאים 1.5 mL המכיל 0.1 מ"ל של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) עם 2% שור עוברית סרום (FBS). הערה: עבור הנתונים שמוצג באיור 1 ו- 2 איור, התאים היו מיון באמצעות Cytometer לזרום עם זרבובית 70 מיקרומטר. אמצעי האחסון המרבי אוסף נמצא 1.4 מ.</li>
</ol>2. הכנת הדוגמא
הערה: השלב זה קריטי. תהליך הדגימה בזהירות רבה. בעת הסרת את תגובת שיקוע, להיזהר מאוד שלא להפריע בגדר התא.
<ol><li>צנטריפוגה 1.5 mL צינורות המכיל תאים ממוינים רוטור דלי מתנדנדים ב 4 ° C, g x 500, עבור 5 דק הסר הכל אלא כ- 100 µL של תגובת שיקוע מהתא הצניפה בעדינות באמצעות פיפטה וטיפ pipet 20 µL. נא לא להפריע בגדר.<ol>
<li>אם המדגם מכיל תאים פחות מ-5,000 הנפח הכולל של המדגם ממוינים הוא פחות מ 0.2 מ"ל, להעביר את התאים קודם מחייב נמוכים 0.2 מ"ל המבחנות לפני צנטריפוגה.</li>
		<li>אם לדוגמה מכיל תאים פחות מ-5,000 אחסון הוא יותר מ- 0.2 מ"ל, לסובב התאים למטה באמצעות צנטריפוגה ב 4 ° C, 500 x g, למשך 5 דקות, ולהסיר הכל חוץ µL 200 של תגובת שיקוע. מחדש להשעות את התאים pelleted µL 200 הנותרים של תגובת שיקוע, ולאחר מכן להעביר את התאים המבחנות 0.2 מ"ל, ספין למטה שוב. להסיר µL כל 20-30 אבל בגדר אחרי שהימרת בסיבוב השני והשהה מחדש את התאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend לתאים משמאל supernatant בצינור. אם יש צורך, להוסיף PBS נוספים ב- 2% FBS/PBS (ניתן להשתמש גם 2% אלבומין שור (BSA) / PBS, או PBS לבד) בריכוז 5 x104 5 x 105 תאים/מ ל.... הערה: שימוש התא נחשב שנאספו על ידי cytometry כדי להעריך את עוצמת הקול משמש להשעות את התאים.</li>
	<li>להשתמש 2-5 µL של התאים מחדש על תנאי לקביעת ריכוז של התא מדויק באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות (בעקבות הוראות היצרן) או hemocytometer9.</li>
	<li>העברת נפח של מתיחה מחדש תאים המכילים מספר תאים צינורות 1.5 mL החדש הרצוי. לניסוי באיור1, הועברו 2,000, 1,000 או 500 HSCs או HPs. מספר התאים הרצוי תלוי עוצמת האות מתקבל על ידי תספיג, והוא נקבע מדעית. ביצוע ההעברה באמצעות µL 20 או 100 µL גלאים פיפטה עצה.</li>
	<li>Centrifuge התאים רוטור דלי מתנדנדים ב 4 ° C, 500 x g, למשך 5 דקות.</li>
	<li>כדי להפיק 100 x פתרונות מניות, להמיס מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז ב דימתיל סולפוקסיד בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>להכין מאגר מדגם ' x Laemmli 2 ' על-ידי דילול המאגר מדגם x Laemmli 4 המסופקים על ידי היצרן עם כמות שווה של מים מזוקקים. להוסיף את הכמות המתאימה של המניה 100 x של מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז בריכוז הסופי של מעכבי 2 x 2 מאגר מדגם x Laemmli. הערה: המאגר 2 מדגם x Laemmli יכול להתבצע מראש, אך מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז אמור להתווסף מיד לפני הוספת את 2 x Laemmli דוגמת המאגר (בתוספת מעכבי) כדי בגדר תא כדי lyse התאים, כמתואר בשלב הבא.</li>
	<li>בזהירות להסיר חלק תגובת שיקוע בגדר תא, וכדי את תגובת שיקוע שנותרו בצינור עם בגדר תא, להוסיף אמצעי שווה 2 מאגר מדגם x Laemmli בתוספת מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז להשגת ריכוז סופי של 500 תאים/µL במאגר מדגם x Laemmli 1. הערה: לדוגמה, אם אתה מעביר 2,000 תאים הנפח הכולל של 20 µL את µL 2 של תגובת שיקוע שנותר צינור 2.5 שלב, לאחר צריך שתוציאו את התאים (שלב 2.6) אתה צריך להסיר µL 18 של תגובת שיקוע של בגדר, וכדי להוסיף אמצעי שווה (2 µL) של 2x Laemmli מאגר מדגם להשגת ריכוז סופי של 500 תאים µL במאגר מדגם x Laemmli 1.</li>
	<li>Resuspend בגדר כדי ליצור את lysate בהקדם האפשרי. בשלב זה, הדגימות ניתן electrophoresed מיד דרך עמוד מרחביות ג'לים או יכולה להיות snap קפוא נוזלי N2 המאוחסנים ב- 80 ° C לשימוש עתידי.</li>
</ol>3. אלקטרופורזה
<ol><li>מחממים את lysates בתוך גוש חום ב 95 ° C או במים רותחים במשך 5 דקות.</li>
	<li>Electrophorese 1-40 µL של lysates (מכיל בין 500 עד 20,000 ושווי תא) דרך ג'לים מרחביות-דף-100V באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים10. הערה: הנפח של lysate הטעונות בג'ל נקבע לפי מספר התאים הדרושים כדי ליצור את האות רצוי, יהיה תלוי השפע של החלבון של עניין, האיכות של הנוגדן. הנתונים באיור 1 התקבלו עם 2,000, 1,000 500 תאים המקבילים lysate. הרוחב של הבאר צריך להיות בטווח של 3 מ מ עד 1.5 מ מ. 1.5 מ מ שיניים יכול להיות חתוך מ מסרק זמינים מסחרית עם השיניים רחב יותר באמצעות מספריים.</li>
</ol>4. העברת וחסום
הערה: בצע את תספיג בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים11. השלבים מתוארים בקצרה כאן:
<ol><li>Pretreat polyvinylidene difluoride (PVDF) קרום עם מתנול עבור s 10 ולאחר מכן לשטוף הקרום בקצרה עם מים מזוקקים.</li>
	<li>להעביר את החלבון הג'ל מרחביות-דף קרום ועקוב אחר ההוראות במדריך המסופקים על ידי היצרן של מנגנון העברה.</li>
	<li>בעקבות העברה, לחסום את הקרום עם 2 מיליליטר 5% שור אלבומין (BSA) ב PBST (PBS עם 0.1% Tween) לילה ב 4 ° C בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים11.</li>
</ol>5. נוגדן תיוג
<ol><li>דגירה הקרום עם נוגדנים על מטרף בן לילה ב 4 ° C באמצעות נוגדן דילולים המומלץ על ידי הספק. הערה: את הטבלה של החומרים, נוגדנים, הבדיקה והאימות עבור HSCs ו HPs ו של דילולים נוגדנים המתאימים, מוצגות. לבצע תיוג נוגדן באמצעות הליכים סטנדרטיים8.</li>
</ol>6. זיהוי
<ol><li>לשטוף את הקרום 3 פעמים, 5 דקות עבור כל כביסה ב PBST בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה הקרום עם 2 מ של מאגר chemiluminescence משופרת עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. לזהות את הסימנים באמצעות מערכת הדמיה בעקבות הוראות, של היצרן או autoradiography הסרט ומעבד הסרט.</li>
</ol>

<ol><li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li>
<li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li>
<li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
</ol>

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים להכריז.

סופג המערבי הוא שיטה מקובלת לגילוי חלבונים ספציפיים והפעלה של איתות המסלולים רקמות או תאים. על ידי הצגת שינויים קטנים הליך נפוץ, היינו מסוגלים לזהות באופן שגרתי חלבונים שונים 15 (טבלה של חומרים) ב- 15,000 HSCs, ובחלק מן המקרים תוך 500 HSCs. The most השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם: ספירת התאים במדויק 1), 2) צמצום מספר העברות בין צינורות ו 3) lysing את התאים ישירות עם מאגר מדגם Laemmli. כאשר lysing בגדר תא עם מאגר מדגם Laemmli, מצאנו כי הסרת כל תגובת שיקוע בגדר תא ולא מחדש השעיית זה במאגר מדגם Laemmli, ...

תאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאים עצמי המתחדש יכולים להצמיח כל דם שושלות. הם נדירים יחסית תאים במח העצם, עיבוד ביוכימי ניתוחים קשים. גישות מתאימים לניתוח תאים נדירים, כמו cytometry זרימה, היה מאוד שימושי עבור לכימות כמויות יחסיות של סמני פני שטח התא, חלבונים תאיים. עם זאת, הניתוח של חלבונים תאיים מחייבת את השימוש בטכניקות permeabilization תא כדי לאפשר גישה נוגדן, ולשרוד לא כל epitopes משטח תאים אלה הליכים1,2. בנוסף, נוגדנים מפלים בין מוצרי איזופורמים או ביקוע חלבונים שונים לעיתים קרובות אינם זמינים עבור cytometry זרימה, ולכן החוקרים עדיין מסתמכים על שהכלים המערבי בוודאות סוגים של ניתוחים.
תספיג חלבון ניתוח של תא lysates הוא הליך שגרתי במעבדות רוב. התאים יכולים להיטהר בתנאים מקומיים המשמרים את epitopes של מולקולות על פני התא, תא lysates לאחר מכן ניתן להכין, מנותח. עם זאת, הניתוח של חלבונים בתא יסודי נדיר אוכלוסיות על-ידי המערב כתם תוכל לדרוש המתות חסד מספרים גדולים של בעלי חיים כדי להשיג מספיק תאים. על ידי ביצוע שינויים קטנים במספר שלבים, פרוטוקול blotting המערבית המקובלת היה מסוגל לזהות חלבונים מספר קטן יחסית של HSCs (500-15,000, בהתאם החלבון עניין). ההתאמות כוללים במדויק ספירת תאי, בזהירות הטיפול בגדר תא, הפחתת העברות של תאים בין צינורות כדי למזער את אובדן התא, ו lysing מספר מוגדר של תאים עם טעינה מרוכז מאגר המכיל פרוטאוזום ו מעכבי פוספטאז. דיווחים שפורסמו רבים כוללים שהכלים המערבי שהושג עם 20,000 או יותר HSCs3,4,5,6,7; נוהל פשוט זה יקטין את מספר התאים ואת חיות ניסוי הדרושה להפקת נתונים שווה ערך לפי בין קיפול 4 ו- 40. הפרוטוקול נועד לנרמל את התוצאות על בסיס לכל תא, במקום של בקרה פנימית. פעולה זו מאפשרת זיהוי של הכללית הפחתות רמות חלבון אשר ניתן להתעלם אם הנתונים הם מנורמל לפקד פנימי. החשיבות של נרמול על בסיס לכל תא תוארה לניתוח של ג'ין ביטוי נתונים8, אותו העיקרון חל לכימות חלבונים על ידי תספיג חלבון. פרוטוקול ממוטבת זה צריך להיות שימושי עבור כל מי שזקוק לנתח מספר קטן של תאים.

<table><tbody><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP166-500</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30% תמיסת אקרילאמידל</td><td>ביס Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.5M Tris-HCl pH8.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1588</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.0M Tris-HCl pH6.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1068</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>פישר מדעי</td><td>BP179-25</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>מיני-פרוטאן 3 מסרק</td><td>Bio-Rad</td><td>1653360</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Transfer System</td><td>Bio-Rad</td><td>1704155EDU</td><td>העברת</td></tr><tr><td>PowerPac HC ספק כוח</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052EDU</td><td>אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>מערכת הדמיה</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>זיהוי אותות</td></tr><tr><td>4x Laemmli מאגר דגימה</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747הכנת</td><td>דגימת</td>EDU</tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS מאגר אלקטרופורזה</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732EDU</td><td>אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710הכנת</td><td>דגימת</td></tr><tr><td>EDU ערכת העברת RTA Mini PVDF, ל-40 כתמים</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>1704272 Transfer</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>סיגמא</td><td>11697498001</td><td>הכנת דגימה</td></tr><tr><td>מעכב פוספטאז קוקטיילים</td><td>Gold Biotechnology</td><td>GB-450-1</td><td>הכנת דגימה</td></tr><tr><td>EIF4G</td><td>Cell Signaling</td><td>2469</td><td>WB נוגדנים, מאומת ב-1000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור): איור 2</td></tr><tr><td>p-Rps6</td><td>איתות תאים</td><td>4858</td><td>נוגדן WB, מאומת ב-1000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור):</td></tr><tr><td>איור 2 אקטין (מצומד HRP)</td> נוגדן <td>abcam</td><td>ab49900</td><td>WB, מאומת ב-500 תאים ריכוז נוגדנים: 1:5000 התייחסות (איור): איור 1, איור 2</td></tr><tr><td>LC-3</td><td>Abcam</td><td>ab48394</td><td>נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור): ref5 (איור 5)</td></tr><tr><td>S6</td><td>Cell Signaling</td><td>2317</td><td>נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור): ref5 (איור 4)</td></tr><tr><td>4EBP1</td><td>איתות תאים</td><td>9644</td><td>נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור): ref5 (איור 4)</td></tr> <tr><td>p-4EBP1</td><td>איתות תאים</td><td>2855</td><td>נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור): ref5 (איור 4)</td></tr> <tr><td>נוגדן תא TSC2</td><td>Cell Signaling</td><td>4308</td><td>WB, מאומת ב-15000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור): ref5 (איור 4)</td></tr> <tr><td>HSP90</td><td>איתות תאים</td><td>4877</td><td>נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור): ref5 (איור 5)</td></tr> <tr><td>איתות תאי</td> <td>PTEN</td><td>9188</td><td>נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור): ref5 (איור 1)</td></tr> <tr><td>mTOR</td><td>איתות תאים</td><td>2983</td><td>נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור): ref5 (איור 1)</td></tr> <tr><td>p-mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>5536</td><td>נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור): ref5 (איור 1)</td></tr> <tr><td>PP2AB</td><td>איתות תאים</td><td>4953</td><td>נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור): ref5 (איור 1)</td></tr> <tr><td>p-AMPKa</td><td>Cell Signaling</td><td>2535</td><td>WB נוגדן, מאומת ב-15000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:1000 התייחסות (איור): ref5 (איור 1)</td></tr> <tr><td>אקטין</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-47778</td><td>נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים ריכוז נוגדנים: 1:3000 התייחסות (איור): ref5 (איור 4)</td></tr> <tr><td>ערכת דלדול שושלת (עכבר)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>טיהור תאי גזע ואב המטופויאטיים עמודות</td></tr><tr><td>LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-305</td><td>טיהור תאי גזע ואב המטופויאטיים</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>250-03</td><td>גירוי זרחון</td></tr><tr><td>APC-Cy7 c-kit נוגדן</td><td>ThermoFisher</td><td>A15423</td><td>מיון תאים</td></tr><tr><td>אנטי-B220</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0452-82</td><td>מיון תאים</td></tr><tr><td>אנטי-CD3e</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0031-82</td><td>מיון תאים</td></tr><tr><td>אנטי-Mac1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0112-82</td><td>מיון תאים</td></tr><tr><td>אנטי-Gr1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5931-82</td><td>מיון תאים</td></tr><tr><td>אנטי-Ter119</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5921-82</td><td>מיון</td></tr><tr><td>תאים צלחות מרווח עם 1.0 מ"מ משולב Spacers</td><td>Bio-Rad</td><td>1653311</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>BSA</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>A30075</td><td>סרום חוסם ממברנה</td></tr><tr><td></td><td>אטלנטה ביולוגית</td><td>A12450</td><td>תוסף בינוני</td></tr><tr><td>מונה תאים</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td>ספירת תאים</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; S17040</td><td>ספירת תאים</td></tr><tr><td>flim</td><td>Denville Scientific</td><td>E3012</td><td></td></tr><tr><td>זיהוי אותות מעבד סרט רפואי</td><td>Konica</td><td>SRC-101A</td><td>זיהוי אותות</td></tr><tr><td>Supersignal West Femto רגישות מקסימלית מצע</td><td>Therom Scientific</td><td>34096</td><td>זיהוי אותות</td></tr><tr><td>Allegra X-15R צנטריפוגה (רוטור SX4750A)</td> <td>בקמן קולטר</td><td>X-15R</td><td>דגימה הכנת</td></tr><tr><td>סולם חלבון BLUEstain</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P007-500</td><td>סדרן תאים אלקטרופורזה</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>FACSAria II</td><td>הכנת דגימה</td></tr><tr><td>Incublock</td><td>Denville Scientific</td><td>I0510</td><td>אלקטרופורזה</td></tr></tbody></table>

מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע hematopoietic

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

תאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאים נדירה, עם מח העצם העכבר המכיל רק ~ 25,000 פנוטיפי ארוך המונח לאכלס מחדש HSCs. פרוטוקול blotting המערבי היה ממוטבת ומתאים הניתוח של מספר קטן של HSCs (500-15,000 תאים). HSCs פנוטיפי מטוהרים, לספור במדויק, ולא ישירות lysed במאגר מדגם Laemmli. Lysates המכיל מספר שווה של תאים נותחו על ידי נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד), האבן החשופה היה מוכן ומעובד בעקבות מערבי רגיל סופג פרוטוקולים. באמצעות פרוטוקול זה, $2,000-5,000 HSCs ניתן לנתח באופן שגרתי, במקרים מסוימים נתונים ניתן להשיג גם 500 תאים, לעומת התאים 20,000 עד 40,000 דיווחו רוב הפרסומים בהיקף. פרוטוקול זה צריך להיות חלים באופן כללי לתאים אחרים hematopoietic, המאפשרת ניתוח שגרתי של מספר קטן של תאים באמצעות הליכים מעבדה סטנדרטיים.

התוצאות נציג מ 500-2000 מטוהרים HSCs ו HPs מוצגים באיור 1 ו- 2 איור. האות β-אקטין באיור 1 ניתן להבחין בין מעטים כמו 500 HSCs וטיהרו HPs ממח העצם של עכבר אחד. שימו לב כי להעמיס את lysates לתוך בארות 1.5 מ מ המיוצר אות חזק הרבה יותר מ- 500 HPs מאשר טעינה אל בארות 3.0 מ מ. איור 2 היא אבן חשופה המערבי של EIF4G זירחון של Rps6 (p-Rps6), אשר שניהם מעורבים בוויסות של חלבון תרגום...

מערבון רגיל סופג פרוטוקול היה אופטימיזציה עבור ניתוח גם 500 hematopoietic גזע או ובתאים בהיקף. אופטימיזציה כרוך זהיר טיפול המדגם תא, הגבלת העברות בין צינורות ו ישירות lysing התאים במאגר מדגם Laemmli.

מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

מטרת העל של פרוטוקול כתמים מערביים זה היא לבצע כתמים מערביים על מספר קטן של תאים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע ההמטופויאטיים כגון נוכחות או שפע של חלבונים ספציפיים או הפעלת מסלולי איתות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת פחות מ-20,000 תאים ולכן יש צורך בפחות בעלי חיים כדי לנתח אוכלוסיות נדירות של תאים ראשוניים.הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשניסינו למצוא דרכים להפחית את מספר העכברים שהיינו צריכים להשתמש בהם עבור אנליזות תאי גזע המטופויאטיים. מי שתדגים את ההליך תהיה שיונגווי קאי, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. השתמש ברוטור דלי מתנדנד כדי לצנטריפוגה של צינורות 1.5 מיליליטר המכילים תאי גזע ואב המטופויאטיים ממוינים בכוח הכבידה פי 500 למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר סיום הצנטריפוגה, השליכו את כל הסופרנטנט מלבד 100 מיקרוליטרים, מבלי להפריע לכדור התא. אם יש פחות מ-5,000 תאים, ונפח הדגימה הממוינה הוא פחות מ-0.2 מיליליטר, העבירו תחילה את התאים לצינורות PCR בעלי קשירה נמוכה של 0.2 מיליליטר לפני הצנטריפוגה. עם זאת, אם יש פחות מ-5,000 תאים, אך נפח הדגימה הממוינה הוא יותר מ-0.2 מיליליטר, אז צנטריפוגה את התאים בכוח הכבידה פי 500 למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה, השליכו את כל הסופרנטנט מלבד 200 מיקרוליטרים. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ואת 200 המיקרוליטרים הנותרים של סופרנטנט. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התא לצינורות PCR של 0.2 מיליליטר ושוב, צנטריפוגה.לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-20 עד 30 מיקרוליטר של סופרנטנט והשליכו את השאר. במידת הצורך, הוסף תמיסת מלח חוצצת פוספט בסרום בקר עוברי 2%, או אלבומין סרום בקר 2% לתאים המרחפים. לאחר מכן השתמש במונה תאים אוטומטי כדי לקבוע את ריכוז התאים באמצעות שניים עד חמישה מיקרוליטרים של תאים תלויים מחדש.לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה של 20 או 100 מיקרוליטר כדי להעביר נפח של 500, 1, 000 ו-2,000 תאי גזע ואב המטופויאטיים לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר. השתמש ברוטור דלי מתנדנד כדי לצנטריפוגה של התאים בארבע מעלות צלזיוס בכוח הכבידה פי 500 למשך חמש דקות. לאחר מכן עקוב אחר הוראות היצרן להמסת פוספטאז ומעכב פרוטאזום ו-DMSO להכנת תמיסת מלאי פי 100.לאחר מכן, יש לדלל את מאגר הדגימה של Laemmli בעל ארבעה קיפולים עם נפחים שווים של מים מזוקקים כדי ליצור מאגר דגימת Laemmli כפול. לאחר מכן הוסף כמויות מתאימות של תמיסת מלאי פי 100 של פוספטאז ומעכב פרוטאזום כדי להתאים את הריכוז הסופי למעכבי פי שניים, ופי שניים מאגר דגימת Laemmli. התאם את נפח הסופרנטנט השיורי בצינור כך שהוספת נפחים שווים של מאגר Laemmli כפול יחד עם מעכב הפוספטאז והפרוטאזום תשיג ריכוז סופי של 500 תאים למיקרוליטר ומאגר Laemmli כפול אחד.ואז להשעות מחדש כדי ליצור את הליזאט. לפני העמסת הג'ל, מחממים את הדגימה ב-95 מעלות צלזיוס בגוש חום למשך חמש דקות. באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, אלקטרופורזה של 1 עד 40 מיקרוליטר של ליזאט שווה ערך ל-500 עד 20,000 תאים דרך דף SDS ב-100 וולט.לאחר טיפול בקרום פולי וינילידן במתנול למשך שניות, שטפו את הממברנה במים מזוקקים לזמן קצר. לאחר מכן העבירו את החלבון מהג'ל לקרום על פי ההוראות שסופקו על ידי יצרן מכשיר ההעברה. לאחר ההעברה, חסום את הממברנה עם שני מיליליטר של 2% אלבומין בסרום בקר ותמיסת מלח פוספט עם 0.1% טווין לילה בארבע מעלות צלזיוס על פי פרוטוקלים סטנדרטיים.לאחר חסימת הממברנה, דגרו אותה בנוגדנים מדוללים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם מי מלח חוצצים פוספט עם 0.1%Tween 20 למשך חמש דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו את הממברנה עם שני מיליליטר של מאגר כימילומינסנציה משופר למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.זיהוי האותות באמצעות מערכת הדמיה. כדי להשוות את אותות הבטא אקטין הוכנו ליזטים מתאי גזע האב והאב של השתן ועברו ניתוח חלקה מערבית. ברור מכתם האמינו שיש ירידה באות בטא אקטין מהליזטים שהוכנו מ-2,000 עד 500 תאי אב המטופויאטיים ותאי גזע שנטענו בבארות של 1.5 מילימטר על ג'ל דף SDS של 12%.יתר על כן, להשוות את אותות הבטא אקטין המתקבלים מגדלי באר שונים המוטלים על הג'ל. ליזטים הועמסו בבארות של 1.5 ושלושה מילימטר על הג'ל ולאחר מכן עברו ניתוח כתמים מערביים. הכתם מראה כי אות הבטא אקטין המתקבל מהליזאט שהוכן מ -500 אבות המטופויאטיים שנטענו בבאר של 1.5 מילימטר חזק בהרבה מאשר כאשר נטען בבאר של שלושה מילימטרים.לאחר מכן, כדי להשוות את האותות עבור גורם התחלה אוקריוטי 4G, אקטין וזרחון של חלבון ריבוזומלי S6 בתגובה לגירוי גורם תאי גזע ציטוקינים, הליזטים שהתקבלו נותחו על ידי כתם אמינו. הכתם מראה נוכחות של עוצמות אות חזקות יותר עבור כל שלושת החלבונים בגניטורים ההמטופויאטיים עם גירוי גורם תאי גזע ציטוקינים. בהשוואה לבקרה במבחנה, ברור גם שיש עוצמת אות הולכת וגוברת עבור כל שלושת החלבונים מנפחי תאי גזע המטופויאטיים שונים.לאחר שליטה, ניתן לעשות זאת מבחינה טכנית תוך 48 שעות. אם ניגשים אליו כמו שצריך. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור לספור במדויק את התאים ולכוון את תאי הליזאט עם מאגר טעינה.לאחר התפתחות זו, מבחינה טכנית, החוקרים בתחום מחקר תאי הגזע מבקשים לחקור מסלולי אותות במספר קטן של תאים. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לעשות עלילות מערביות עם מספר קטן של קטעי כתובת. היזהר עם האזורים שבהם אתה משתמש עבור דף SDS.תודה שצפית. בהצלחה בניסויים שלך.

a-western-blotting-protocol-for-small-numbers-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת עכברי מערכת החיסון האנושית (HIS). CD34+ תאי גזע hematopoietic (HSC) מבודדים מתאי מעיל דם טבורי אנושי באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים. CD34+ HSCs מורחבים במדיום גידול מועשר בציטוקינים ונשמר בהקפאה. לבסוף, HSCs מופשרים מוזרקים לתוך גור עכבר מדוכא חיסון כדי לבסס את מודל העכבר שלו.

בידוד תאי גזע המטופויטיים מדם טבורי ליצירת עכברי מערכת החיסון האנושית

ניתוחי RNA-רצף וביואינפורמטיקה שמשו לזהות גורמי שעתוק הביעו באופן משמעותי ואופן דיפרנציאלי בתת אוכלוסיות לין-CD34 + ולין-CD34- של EMLcells עכבר. גורמי שעתוק אלו עשויים לשחק תפקיד חשוב בקביעה לעבור בין תאי לין-CD34- לין-CD34 + ומובחן באופן חלקי עצמי חידוש.

זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

כאן אנו מציגים מתודולוגיה לניתוח המשובטים של תא גזע hematopoietic מבשרי במהלך התפתחות עובריים מאתר. אנו משלבים אינדקס מיון של תאים בודדים מאזור העורקים-בלוטת המין-mesonephros עובריים עם תרבות משותפת תא אנדותל והשתלות לאפיין את המאפיינים פנוטיפי ואת הפוטנציאל engraftment של מבשרי hematopoietic יחיד.

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

דפוסי המוטציה הסומטיים בתאים משקפים חשיפה מוטרית קודמת ויכולים לחשוף קשרים התפתחותיים של השושלת. המוצג כאן הוא מתודולוגיה לקטלג ולנתח מוטציות סומטיות בתאי גזע ומחולל המטפאות בודדים.

אפיון מטען והרכב שבטים של דם אנושי

מעבר ממצב השקט למצב בידול בשל הפלסטיות המטבולית שלהם במהלך היווצרות הדם. כאן, אנו מציגים שיטה ממוטבת למדידת נשימה מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס של HSPCs.

ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

כאן אנו מתארים שיטה אמינה למדוד מסה מיטוכונדריאלי פוטנציאל קרום בתאי גזע vivo המטפאות לשעבר תאים T.

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

פרוטוקול זה מאפשר שמירה על תאי גזע המטטופיאטיים אנושיים רגיעה במבחנה על ידי חיקוי microenvironment מח העצם באמצעות חומצות שומן בשפע, כולסטרול, ריכוזים נמוכים יותר של ציטוקינים, והיפוקסיה.

שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים

אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד תאי גזע המטופויטיים ארוכי טווח (LT-HSCs) ותאי HSC לטווח קצר (ST-HSCs) באמצעות מערכת הדיווח Hoxb5.

שיטת בידוד לתאי גזע המטופויטיים לטווח ארוך וקצר

כאן, הקמנו in vivo אוסטאו-אורגנואידים המופעלים על ידי פיגומי ג'לטין טעונים בחלבון מורפוגנטי-2 עצם כדי לקצור תאי גזע / אב המטופויטיים טיפוליים לשחזור של מערכת המטופויטית וחיסונית פגומה. בסך הכל, גישה זו יכולה לספק מקור תאי מבטיח לטיפולים תאיים.

In Vivo גישת אוסטאו-אורגנואיד לקצירת תאי גזע/אב המטופויטיים טיפוליים

למדו פרוטוקול מערבון סופג מותאם לניתוח 500 תאי גזע המטופויאטיים בלבד. השיטה מאפשרת זיהוי חלבונים ומסלולי סיגנלינג בתאים נדירים תוך הפחתת השימוש בבעלי חיים במחקר.

מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic

גלה סרטונים נוספים