מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic

מטרת העל של פרוטוקול כתמים מערביים זה היא לבצע כתמים מערביים על מספר קטן של תאים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע ההמטופויאטיים כגון נוכחות או שפע של חלבונים ספציפיים או הפעלת מסלולי איתות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת פחות מ-20,000 תאים ולכן יש צורך בפחות בעלי חיים כדי לנתח אוכלוסיות נדירות של תאים ראשוניים.

הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשניסינו למצוא דרכים להפחית את מספר העכברים שהיינו צריכים להשתמש בהם עבור אנליזות תאי גזע המטופויאטיים. מי שתדגים את ההליך תהיה שיונגווי קאי, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. השתמש ברוטור דלי מתנדנד כדי לצנטריפוגה של צינורות 1.5 מיליליטר המכילים תאי גזע ואב המטופויאטיים ממוינים בכוח הכבידה פי 500 למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר סיום הצנטריפוגה, השליכו את כל הסופרנטנט מלבד 100 מיקרוליטרים, מבלי להפריע לכדור התא. אם יש פחות מ-5,000 תאים, ונפח הדגימה הממוינה הוא פחות מ-0.2 מיליליטר, העבירו תחילה את התאים לצינורות PCR בעלי קשירה נמוכה של 0.2 מיליליטר לפני הצנטריפוגה. עם זאת, אם יש פחות מ-5,000 תאים, אך נפח הדגימה הממוינה הוא יותר מ-0.2 מיליליטר, אז צנטריפוגה את התאים בכוח הכבידה פי 500 למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר צנטריפוגה, השליכו את כל הסופרנטנט מלבד 200 מיקרוליטרים. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ואת 200 המיקרוליטרים הנותרים של סופרנטנט. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התא לצינורות PCR של 0.2 מיליליטר ושוב, צנטריפוגה.

לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-20 עד 30 מיקרוליטר של סופרנטנט והשליכו את השאר. במידת הצורך, הוסף תמיסת מלח חוצצת פוספט בסרום בקר עוברי 2%, או אלבומין סרום בקר 2% לתאים המרחפים. לאחר מכן השתמש במונה תאים אוטומטי כדי לקבוע את ריכוז התאים באמצעות שניים עד חמישה מיקרוליטרים של תאים תלויים מחדש.

לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה של 20 או 100 מיקרוליטר כדי להעביר נפח של 500, 1, 000 ו-2,000 תאי גזע ואב המטופויאטיים לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר. השתמש ברוטור דלי מתנדנד כדי לצנטריפוגה של התאים בארבע מעלות צלזיוס בכוח הכבידה פי 500 למשך חמש דקות. לאחר מכן עקוב אחר הוראות היצרן להמסת פוספטאז ומעכב פרוטאזום ו-DMSO להכנת תמיסת מלאי פי 100.

לאחר מכן, יש לדלל את מאגר הדגימה של Laemmli בעל ארבעה קיפולים עם נפחים שווים של מים מזוקקים כדי ליצור מאגר דגימת Laemmli כפול. לאחר מכן הוסף כמויות מתאימות של תמיסת מלאי פי 100 של פוספטאז ומעכב פרוטאזום כדי להתאים את הריכוז הסופי למעכבי פי שניים, ופי שניים מאגר דגימת Laemmli. התאם את נפח הסופרנטנט השיורי בצינור כך שהוספת נפחים שווים של מאגר Laemmli כפול יחד עם מעכב הפוספטאז והפרוטאזום תשיג ריכוז סופי של 500 תאים למיקרוליטר ומאגר Laemmli כפול אחד.

ואז להשעות מחדש כדי ליצור את הליזאט. לפני העמסת הג'ל, מחממים את הדגימה ב-95 מעלות צלזיוס בגוש חום למשך חמש דקות. באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, אלקטרופורזה של 1 עד 40 מיקרוליטר של ליזאט שווה ערך ל-500 עד 20,000 תאים דרך דף SDS ב-100 וולט.

לאחר טיפול בקרום פולי וינילידן במתנול למשך שניות, שטפו את הממברנה במים מזוקקים לזמן קצר. לאחר מכן העבירו את החלבון מהג'ל לקרום על פי ההוראות שסופקו על ידי יצרן מכשיר ההעברה. לאחר ההעברה, חסום את הממברנה עם שני מיליליטר של 2% אלבומין בסרום בקר ותמיסת מלח פוספט עם 0.1% טווין לילה בארבע מעלות צלזיוס על פי פרוטוקלים סטנדרטיים.

לאחר חסימת הממברנה, דגרו אותה בנוגדנים מדוללים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם מי מלח חוצצים פוספט עם 0.1%Tween 20 למשך חמש דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו את הממברנה עם שני מיליליטר של מאגר כימילומינסנציה משופר למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.

זיהוי האותות באמצעות מערכת הדמיה. כדי להשוות את אותות הבטא אקטין הוכנו ליזטים מתאי גזע האב והאב של השתן ועברו ניתוח חלקה מערבית. ברור מכתם האמינו שיש ירידה באות בטא אקטין מהליזטים שהוכנו מ-2,000 עד 500 תאי אב המטופויאטיים ותאי גזע שנטענו בבארות של 1.5 מילימטר על ג'ל דף SDS של 12%.

יתר על כן, להשוות את אותות הבטא אקטין המתקבלים מגדלי באר שונים המוטלים על הג'ל. ליזטים הועמסו בבארות של 1.5 ושלושה מילימטר על הג'ל ולאחר מכן עברו ניתוח כתמים מערביים. הכתם מראה כי אות הבטא אקטין המתקבל מהליזאט שהוכן מ -500 אבות המטופויאטיים שנטענו בבאר של 1.5 מילימטר חזק בהרבה מאשר כאשר נטען בבאר של שלושה מילימטרים.

לאחר מכן, כדי להשוות את האותות עבור גורם התחלה אוקריוטי 4G, אקטין וזרחון של חלבון ריבוזומלי S6 בתגובה לגירוי גורם תאי גזע ציטוקינים, הליזטים שהתקבלו נותחו על ידי כתם אמינו. הכתם מראה נוכחות של עוצמות אות חזקות יותר עבור כל שלושת החלבונים בגניטורים ההמטופויאטיים עם גירוי גורם תאי גזע ציטוקינים. בהשוואה לבקרה במבחנה, ברור גם שיש עוצמת אות הולכת וגוברת עבור כל שלושת החלבונים מנפחי תאי גזע המטופויאטיים שונים.

לאחר שליטה, ניתן לעשות זאת מבחינה טכנית תוך 48 שעות. אם ניגשים אליו כמו שצריך. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור לספור במדויק את התאים ולכוון את תאי הליזאט עם מאגר טעינה.

לאחר התפתחות זו, מבחינה טכנית, החוקרים בתחום מחקר תאי הגזע מבקשים לחקור מסלולי אותות במספר קטן של תאים. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לעשות עלילות מערביות עם מספר קטן של קטעי כתובת. היזהר עם האזורים שבהם אתה משתמש עבור דף SDS.

תודה שצפית. בהצלחה בניסויים שלך.