אנזים פיצול-TET2 הנדסה כימית-inducible DNA Hydroxymethylation, שיפוץ Epigenetic

המטרה הכוללת של סדרת ניסויים זו היא להכניס אנזים מפוצל-TET2 מהונדס הנקרא CiDER לתאי יונקים לשינוי DNA הניתן להשראה כגון הידרוקסימתילציה וכן שיפוץ אפיגנטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה כגון היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהאנזים המפוצל-TET2 המהונדס מאפשר בקרה זמנית על חמצון 5-מתילציטוזין ועיצוב מחדש של מצבים אפיגנטיים בתאי יונקים עם תוספים כימיים. כדי להתחיל בהליך זה, תרבית קו תאים דבק ב-DMEM בתוספת 10% FBS מומת חום וכן 100 יחידות למיליליטר של פניצילין וסטרפטומיצין.

דגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. העבירו את התאים עם הפלסמיד CiDER כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן דגרו על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, החלף את המדיה המכילה ריאגנט טרנספקציה ב-DMEM שלם טרי. כדי לגרום כימית לתאים, הוסף 20 מיקרוליטר של רפמיצין מדולל לתאים המועברים הנשמרים בשני מיליליטר של מדיום כדי להגיע לריכוז סופי של 200 ננו-מולר. כדי לבצע ציטומטריית זרימה, השעו מחדש את התאים המועברים והמושרים על ידי רפמיצין במאגר FACS.

עבור קבוצת הביקורת, השתמש בתאים המבטאים CiDER ללא טיפול ברפמיצין. תקן וחדיר את התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הוסף שתי חומצות הידרוכלוריות, רגילות, לתאים כדי לנטרל את הדנ"א למשך 10 דקות.

לאחר נטרול וחסימת התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוסף את הנוגדן המדולל נגד 5hmC לתאים. דגרו על התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים עם מאגר FACS שלוש פעמים.

הסר את מאגר ה-FACS ביסודיות. הוסף נוגדן משני מצומד פלואורופור מדולל לניתוח FACS ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את התאים עם מאגר FACS שלוש פעמים.

לאחר הכביסה, הדגימות מוכנות לניתוח FACS. לבודד DNA גנומי מתאים שעברו טרנספטציה ומושרים על ידי רפמיצין באמצעות ערכת מיצוי DNA מסחרית. עבור קבוצת הביקורת, השתמש בתאים שעברו טרנספטציה של CiDER ללא טיפול ברפמיצין.

מחממים את תנור הוואקום ל-80 מעלות צלזיוס. משרים מראש את קרום הניטרוצלולוזה במים מזוקקים כפולים ולאחר מכן במאגר SSC 6X למשך 10 דקות. לאחר מכן, טען 60 מיקרוליטר של כמויות שוות של DNA לצלחת PCR של 96 בארות.

הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר TE לשאר הבארות. בצע דילולים טוריים כפולים אנכית על צלחת 96 הבארות על ידי העברת 30 מיקרוליטר של תמיסה בשורה הראשונה לאותו מיקום עמודה בשורה השנייה. מערבבים שוב ומעבירים 30 מיקרוליטר תמיסה לבארות בשורה שלאחר מכן עד להגעה לגבול.

ואז הסר את 30 המיקרוליטרים האחרונים מהבאר. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד מולרי אחד ו-10 מילי-מולרי EDTA לכל באר. אוטמים את הצלחת ומחממים את התערובת למשך 10 דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס כדי לפגוע לחלוטין בדופלקס ה-DNA.

מצננים מיד את הדגימות על הקרח. מוסיפים 50 מיקרוליטר קר קרח שני אמוניום אצטט טוחנת לכל באר ודוגרים על קרח למשך 10 דקות. בינתיים, הרכיבו את מנגנון כתם הנקודות עם הממברנה הספוגה מראש.

הסר את המאגר הנותר באמצעות ואקום מלא. שטפו את הממברנה על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר TE לכל באר של מנגנון כתמי הנקודות. הפעל את הוואקום כדי להסיר את מאגר TE.

לאחר מכן, טען את ה- DNA המפורק לכל באר של מנגנון כתמי הנקודות. הפעל את הוואקום כדי להסיר את התמיסה. שטפו את הממברנה על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 2X SSC והסירו תמיסות שאריות לחלוטין באמצעות ואקום.

פרק את מנגנון כתמי הנקודות. לאחר מכן הוציאו את הממברנה ושטפו את כל הממברנה עם 20 מיליליטר של 2X SSC. יבש את הממברנה באוויר למשך 20 דקות.

לייבוש נוסף של הממברנה, אופים אותה בחום של 80 מעלות בוואקום למשך שעתיים. מוסיפים את תמיסת החסימה לקרום ודוגרים למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת התמיסה החוסמת, הוסיפו את הנוגדנים המדוללים של 5 hmC או 5-mC לממברנה ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

שטפו את הממברנה עם TBST שלוש פעמים למשך 10 דקות כדי להסיר שאריות נוגדנים. לאחר הסרת ה-TBST ביסודיות, הוסף נוגדן משני מצומד HRP לממברנה. דגרו את הממברנה למשך שעה בטמפרטורת החדר.

שוטפים את הממברנה עם TBST שלוש פעמים למשך 10 דקות. לבסוף, הוסף מצע כתמים מערבי ECL לממברנה להדמיה של אותות 5-hmC באמצעות גלאי כימילומינסנציה. תוצאת כימות מייצגת של ייצור 5-hmC בתיווך CiDER על ידי ציטומטריית זרימה מוצגת כאן.

רק תאים המבטאים CiDER בתנאים שטופלו ברפמיצין מראים עלייה משמעותית ברמות 5-hmC. תוצאה מייצגת של השינוי העולמי של רמת 5-hmC בכל אוכלוסיית התאים על ידי בדיקת כתמי נקודות מוצגת כאן. בקרת ההעמסה מודגמת על ידי צביעת אתילן כחול של הכמויות הכוללות של DNA קלט.

התוצאות מראות כי טיפול ברפמיצין גורם לייצור חזק של 5-hmC בתאי HEK293T המבטאים CiDER עם פעילות רקע זניחה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטיקה לחקור את תפקוד התא מבלי לשנות את הקוד הגנטי ולחקור את יחסי האפיגנוטיפ והפנוטיפ במערכות ביולוגיות שונות.