Name: אנזים פיצול-TET2 הנדסה כימית-inducible DNA Hydroxymethylation, שיפוץ Epigenetic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: למד כיצד להשתמש באנזים CiDER הנדסי לשליטה כימית בהידרוקסימתילציה של DNA ושיפוץ אפיגנטי בתאי יונקים. שיטה זו מאפשרת בקרה זמנית מדויקת על שינויים אפיגנטיים ומסייעת בחקר תפקוד גנים ללא שינוי הקוד הגנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים הפיננסי תומך של מכוני הבריאות הלאומיים הענק (R01GM112003 כדי yz ימאהה), קרן Welch (להיות-1913 על yz ימאהה) האגודה האמריקנית לסרטן (TBE RSG-16-215-01 כדי yz ימאהה), מניעת סרטן, מכון המחקר של טקסס (RR140053 ל יד הנדיב, RP170660 כדי yz ימאהה), איגוד הלב האמריקאי (16IRG27250155 על יד הנדיב), לבין התוכנית פרס קרן דן ג'ון ס מחקר משותף.

1. תא תרבות, פלסמיד תרביות תאים, אינדוקציה כימי
<ol>
	<li>תרבות תא חסיד קו (למשל, האדם מתחלקים הכליה תא HEK293T) הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM), בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>Transfect תאים עם פלסמיד סיידר.
	<ol>
		<li>לפחות 18 h לפני תרביות תאים, זרע 0.3 x 106 תאים 2.5 מ של DMEM המתאים לכל טוב בצלחת 6-ובכן, דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להגיע confluency 60-80%.</li>
		<li>לחמם הכימית תרביות תאים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
		<li>µL 250 במקום ללא סרום בינוני בשפופרת סטרילי. הערה: סכום זה הוא מותאם לצלחת 6-ובכן עם 80% confluency. אם יש צורך, באופן פרופורציונלי להתאים את הכמויות בינוני לפי הגדלים של צלחות או מספרי הטלפון הנייד.</li>
		<li>להוסיף 2.5 µg של פלסמיד קידוד סיידר18 או את תחום קטליטי TET2 (TET2CD כפקד חיובי)12,13 בתוך המדיום ללא סרום, בעדינות לערבב על ידי pipetting.</li>
		<li>מוסיפים את µL 7.5 של תרביות תאים ריאגנט לתערובת DNA מדולל ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting.</li>
		<li>דגירה התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות.</li>
		<li>שנה מדיה מראש ומחוממת, להוסיף את התערובת drop-wise הבארות ולאחר לנער בעדינות את הצלחת תרבות תא לפיזור אחיד של תרביות תאים ריאגנט של ה-DNA תערובת.</li>
		<li>דגירה התאים ואת תערובת בין לילה, ולאחר מכן החלף הכימית תרביות תאים המכילים מדיה עם 2 מ של טרי DMEM מלאה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>אינדוקציה כימי
	<ol>
		<li>שתדללו 2 מ מ של המניה rapamycin (מומס דימתיל סולפוקסיד) ריכוז של 20 מיקרומטר המתאים בינוני מלא.</li>
		<li>להוסיף 20 µL של rapamycin מדולל לתאים transfected בהשתתפות 2 mL בינוני להגיע ריכוז סופי של 200 ננומטר. הערה: לאחר דגירה של 48 שעות, תאים הם מוכנים כימות של דור 5hmC או יישומים אחרים במורד הזרם. במידת הצורך, אינדוקציה יכול להיות במעקב על ידי הוצאת תאי כל 3 שעות על 5hmC כימות עוד יותר, כפי שמתואר להלן ויעילות המוצג באיור1.</li>
		<li>על כימות יותר של יעילות אינדוקציה 5hmC, זרע נפרדים בארות כדי לעקוב אחר תאים כל 3 שעות.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. כימות של ייצור Rapamycin-induced 5hmC על ידי Immunostaining
<ol>
	<li>5hmC immunofluorescence מכתים הערה: להוסיף כמויות מספיקות של הפתרון קיבעון, המורכבת paraformaldehyde 4%, 0.2% חומרים פעילי שטח (כגון טריטון X-100) ב- PBS עם HCl N 3, כדי לכסות את כל התאים בצלחת. לדוגמה, µL 500 של פתרון יהיה מספיק טוב בצלחת 6-. טוב. בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר.<ol>
		<li>כדי לתקן תאים, להוסיף paraformaldehyde 4% ב- PBS לתאים שטופלו rapamycin למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. עבור קבוצת בקרה, להשתמש בתאים המבטאים mCherry-סיידר ללא טיפול rapamycin. לא להתסיס. התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל. לענוד הגנה הולמת.</li>
		<li>למחוק פתרון מקבע. דגירה תאים קבוע עם חומרים פעילי שטח 0.2% ב- PBS למשך 30 דקות כדי permeabilize את קרום התא.</li>
		<li>למחוק פתרון permeabilization. להוסיף 3 N HCl תאים permeabilized, תקופת דגירה של 15 דקות denature את ה-DNA.</li>
		<li>להתעלם HCl. הוסף 100 מ מ טריס-HCl מאגר (pH 8.0) על התאים במשך 10 דקות על נטרול של pH.</li>
		<li>למחוק את כל הפתרון. לשטוף את התאים ביסודיות עם PBS במשך 3 - 5 פעמים. הסר PBS ביסודיות. הערה: להוסיף כמויות מספיקות של PBS על כל צעד לשטוף. לדוגמה, 1 מ"ל של PBS מספיקה צלחת 6-. טוב.</li>
		<li>לחסום תאים על-ידי הוספת המאגר חסימה הכוללת BSA 1% ל- 0.05% של חומרים פעילי שטח (כגון Tween 20) ב- PBS עבור h 1 ברעידות עדין.</li>
		<li>לבטל את הפתרון חסימה. להוסיף הנוגדן 5hmC מדולל (1:200) התאים, תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 º C.</li>
		<li>לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים למשך 15 דקות.</li>
		<li>להוסיף על fluorophore מדולל (FITC)-מצומדת נוגדנים משניים (1:200) על התאים ואת תקופת דגירה של 1 h.</li>
		<li>לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים בהרחבה כדי להסיר שאריות נוגדנים.</li>
		<li>להוסיף 250 ננוגרם למ"ל של 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי להכתים את הגרעין של 5 דק. הסר הפתרון מוכתמים.</li>
		<li>הר המנה תרבות שקופיות או זכוכית-התחתון עם immunostained תאים עבור הדמיה קונפוקלי. תוצאה נציג היה באיור איור 1B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometry זרימה הערה: השתמש צלחת תחתית עגולה 96-ובכן מכתימים שהפרוצדורה הבאה. בדרך כלל, µL 150 של ריאגנטים מספיקה עבור כל טוב.<ol>
		<li>Resuspend תאים transfected ו הנוצרות על-ידי rapamycin במאגר FACS (PBS עם BSA 1%, 2 מ מ EDTA). עבור קבוצת בקרה, השתמש לבטא סיידר תאים ללא טיפול rapamycin.</li>
		<li>לתקן, permeabilize את התאים כפי שמתואר בשלב 2.1.</li>
		<li>להוסיף 2 N HCl לתאים כדי denature את ה-DNA למשך 10 דקות.</li>
		<li>למחוק HCl. נטרול וחסום את התאים כפי שמתואר בשלב 2.1.</li>
		<li>להוסיף של נוגדן anti מדולל-5hmC (1:200) התאים, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לשטוף את התאים באמצעות מאגר FACS שלוש פעמים. הסר את מאגר FACS ביסודיות.</li>
		<li>להוסיף על fluorophore מדולל (FITC)-מצומדת נוגדנים משניים (1:400) עבור תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניתוח ולאחר תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף את התאים באמצעות מאגר FACS שלוש פעמים.</li>
		<li>דוגמאות מוכנים לניתוח FACS. תוצאה נציג היה באיור איור 1C-D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. dot-כתם Assay לכמת 5hmC ו- 5-methylcytosine (5mC) סכומים
<ol>
	<li>לבודד דנ א גנומי מתאי transfected ו הנוצרות על-ידי rapamycin באמצעות ערכת חילוץ DNA מסחרי. עבור קבוצת בקרה, השתמש transfected סיידר תאים ללא טיפול rapamycin.</li>
	<li>מחממים תנור ואקום ל 80 ° C ומשרים קדם ממברנה ניטרוצלולוזה מזוקק פעמיים H2O ואחר ב 6 x מאגר תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס) למשך 10 דקות.</li>
	<li>לטעון µL 60 של כמויות שוות של DNA (סה כ 2 µg במאגר טה) על צלחת PCR 96-ובכן. להוסיף 30 µL טה מאגר (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) הבארות מנוחה.</li>
	<li>להפוך דילולים טורי כפולה אנכית על הצלחת 96-ובכן על-ידי העברת 30 µL של פתרון בשורה 1 לאותו מיקום עמודה בשורה 2. לערבב שוב, להעביר 30 µL של פתרון הבארות בשורה הבאים עד שהגיע לגבול.</li></ol>הסר את µL בשלושים.
	<li>להוסיף 20 µL של EDTA NaOH ו- 10 מ"מ 1 מ' מכל קידוח, לאטום את הצלחת, מחממים את התערובת למשך 10 דקות ב 95 ° C כדי לחלוטין denature דופלקס של ה-DNA.</li>
	<li>מיד לקרר את הדוגמאות על קרח, להוסיף 50 µL של 2 מ' הקר אמוניום אצטט (pH 7.0), דגירה על קרח למשך 10 דקות. הערה: השלבים 3.7-3.10 כרוכה בשימוש של ואקום.</li>
	<li>להרכיב את המנגנון חשופה נקודה עם ממברנה טרום רטוב ולהסיר שיורית המאגר באמצעות ואקום מלא.</li>
	<li>לשטוף את הקרום על-ידי הוספת 200 µL טה מאגר כל טוב של המנגנון חשופה נקודה. הפעל ואקום להסיר את מאגר טה.</li>
	<li>לטעון denatured דנ א (להכין השלבים הקודמים 3.1-3.6) כל טוב של המנגנון חשופה נקודה. הפעל ואקום להסיר את הפתרון.</li>
	<li>לשטוף את הקרום על-ידי הוספת µL 200 של 2 x פתרונות שיורית האס ולהסיר לחלוטין באמצעות ואקום.</li>
	<li>לפרק את המנגנון חשופה נקודה, להוציא את הקרום ולשטוף את הקרום כל 20 מ של 2 x SSC.</li>
	<li>מילה נהדרת קרום כעשרים דקות.</li>
	<li>אופים את הקרום ב 80 ° C תחת ואקום כבר שעתיים.</li>
	<li>הוסף את הפתרון חסימה (5% חלב רזה TBST) למוח, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לבטל את הפתרון חסימה. הוספת 5hmC מדולל (1:5, 000) או 5mC (1:1, 000) נוגדנים למוח דגירה בין לילה ב 4 º C.</li>
	<li>לשטוף את הקרום עם TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות להסיר את שאריות נוגדנים. הסר TBST ביסודיות.</li>
	<li>הוספת נוגדן משני מצומדת HRP (1:10, 000 עבור אנטי-ארנב HRP(5hmC) או 1:3,000 על העכבר אנטי HRP(5mC)) למוח דגירה לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את הקרום עם TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות.</li>
	<li>הוסף ECL המערבי סופג המצע למוח על ויזואליזציה של אותות 5hmC באמצעות גלאי chemiluminescence. תוצאה נציג היה באיור איור 1E.</li>

<ol><li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectv+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+readers+for+5-%28hydroxy%29methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li>
<li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290(2016).</li>
<li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li>
<li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET+family+proteins%3A+oxidation+activity%2C+interacting+molecules%2C+and+functions+in+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15796538">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li>
<li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנחנו יש מאויר השימוש של אנזים פיצול מהונדסים-TET2 כדי להשיג שליטה הטמפורלי של דנ א hydroxymethylation. בעקבות הגילוי של משפחת ט 5-methycytosine dioxygenase, בוצעו מחקרים רבים לפענח בפונקציות ביולוגיות של חלבונים ט ו שלהם מוצר קטליטי גדולה 5hmC1,2,3, 4,5,6,7,<sup class="xref"...

מתילציה DNA, בעיקר מתייחס התוספת של קבוצת מתיל למיקום פחמן 5 של ציטוזין לטופס 5-methylcytosine (5mC), על ידי ה-DNA מתיל-transferases (DNMTs). 5mC משמש סימן epigenetic הגדולות הגנום יונקים כי לעיתים קרובות אותות עבור דיכוי גנים ברמת השעתוק, שמושרש איון transposon להשתיק1. ההיפוך של מתילציה DNA מתווך על ידי משפחת חלבונים 10-העלפים טרנסלוקציה (ט). אנזימים ט שייכים הברזל (II) ו- 2-oxoglutarate dioxygenases תלויים אשר לעודד חמצון רצופים של 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxycytosine (5caC). 5mC בתיווך ט חמצון כופה על שכבה נוספת של שליטה epigenetic על הגנום יונקים. גילוי ט עוררה עניין אינטנסיבי בתחום epigenetic לחשוף את תפקודים ביולוגיים של חלבונים ט ו 5hmC מוצר קטליטי גדולה שלהם. 5hmC אינה רק ביניים במהלך בתיווך ט הפעיל DNA demethylation2,3,4, אלא גם פועלת כמו אורווה epigenetic לסמן5,6,7,8 . למרות hydroxymethylation ה-DNA הוא מאוד מתואם עם ביטוי גנים וסוטה שינויים ב- DNA hydroxymethylation משויכים כמה הפרעות האדם9,10,11, הקשרים סיבתי בין שינויים epigenetic על ה-DNA על הפנוטיפים לעיתים קרובות להישאר מאתגר שתוקם, אשר יכול להיות חלקית המיוחס חוסר כלי אמין במדויק להוסיף או להסיר שינויים DNA הגנום-שהוגדרו הטמפורלי, מרחבית רזולוציה.
כאן אנחנו מדווחים על השימוש epigenome כימית-inducible שיפוץ כלי (סיידר) להתגבר על המשוכה מול מחקרים של קשרים סיבתי בין שעתוק DNA hydroxymethylation, ג'ין. העיצוב מבוסס על ההנחה כי תחום קטליטי של TET2 (TET2CD) ניתן לפצל לשני מקטעים שאינם פעילים כשאני לידי ביטוי בתרבית של תאים, תפקידה אנזימטי ניתן לשחזר על-ידי נקיטת גישה dimerization כימית inducible ( איור 1A). להקים מערכת פיצול-TET2CD, בחרנו 6 אתרי ב TET2CD, מורכב של אזור עשיר Cys קיפול כפול גדילי β-סליל (DSBH), על בסיס מבנה קריסטל המדווחת של מתחם TET2-DNA חסר מורכבות נמוכה באזור12. גן סינתטי קידוד dimerization rapamycin-inducible מודול FK506 מחייב חלבון 12 (FKBP12) ובתחום FKBP rapamycin מחייב (FRB) של מטרת יונקים rapamycin14,15, יחד עם פפטיד שהפריד עצמית T2A מפוליפפטיד רצף16,17, הוכנס בנפרד האתרים שנבחרו פיצול בתוך TET2CD. הבחירה של TET2 המטרה הנדסה מבוססת על השיקולים הבאים. מוטציות הראשון, סומאטית TET2 עם צמצום והמצוות DNA hydroxymethylation הם נצפו לעתים קרובות בהפרעות האנושי, כולל הפרעות מיאלואידית סרטן10, אשר מספק מידע שימושי באתרי רגיש כדי להימנע במשך ההכנסה. שנית, חלק גדול של התחום קטליטי TET2, במיוחד באזור מורכבות נמוכה, היא לוותר על הפונקציה אנזימטי12, ובכך מאפשר לנו מלאכה של TET2-פיצול הממוזערת עבור שינויים epigenetic inducible. לאחר הקרנת בונה מעל 15, מבנה זה הציג שחזור rapamycin-inducible הגבוהה של פעילותה אנזימטי למערכת יונקים היה נבחר, כמנהל סיידר18. אנחנו מתארים בזאת את השימוש מתויג mCherry סיידר כדי להשיג inducible DNA hydroxymethylation ובניה epigenetic עם rapamycin, להציג שלוש שיטות אימות 5hmC בתיווך סיידר ייצור מערכת סלולרית דגם HEK293T.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>רפמיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>37094</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד, תמיסה 16%</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>אמרסקו</td><td>0694-1L</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>אמרסקו</td><td>0369-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין, בקר</td><td>אמרסקו</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>אמרסקו</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>5-הידרוקסימתילציטוזין (5-hmC) נוגדן (pAb)</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב IgG (H+L) נספג צולב, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI)</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td></td></tr><tr><td>תנור ואקום חסכוני SVAC1E SHEL LAB, 0.6 מ"ק. (17 ליטר)</td><td>SHEL LAB</td><td>SVAC1E</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Device</td>, <td>נוגדן BIO-RAD</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-5-מתילציטוזין (5mC), שיבוט 33D3</td><td>Millipore</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG, נוגדן מקושר HRP</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, </td><td>טכנולוגיית איתות תאי</td> נוגדנים מקושרת HRP <td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>West-Q Pico Dura ECL Solution</td><td>Gendepot</td><td>W3653-100</td><td></td></tr></tbody></table>

אנזים פיצול-tet2 הנדסה כימית-inducible dna hydroxymethylation, שיפוץ epigenetic

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

מתילציה DNA הוא שינוי epigenetic heritable ויציבה הגנום יונקים, והוא מעורב בוויסות ביטוי גנים לשלוט תאיים. ההיפוך של מתילציה DNA, או ה-DNA demethylation, מתווך על ידי משפחת חלבונים 10-11 טרנסלוקציה (ט) dioxygenases. למרות נרחב דווח כי חריגה מתילציה DNA ו demethylation קשורים עם ליקויים התפתחותיים, סרטן, כמה שינויים epigenetic אלה תורמות בצורה ישירה משינוי עוקבות בהתקדמות ביטוי או מחלה ג'ין עדיין לא ברור, בעיקר בשל העדר כלי אמין במדויק להוסיף או להסיר שינויים DNA הגנום ברזולוציה שהוגדרו הטמפורלי, מרחבית. כדי להתגבר על המשוכה הזו, תיכננו אנזים פיצול-TET2 כדי לאפשר שליטה הטמפורלי של חמצון 5-methylcytosine (5mC) ו שיפוץ עוקבות של הברית epigenetic בתרבית של תאים על-ידי פשוט הוספת כימיקלים. כאן, אנו מתארים שיטות היכרות עם כלי שיפוץ epigenome כימית-inducible (סיידר), המבוסס על אנזים פיצול מהונדסים-TET2, לתוך תאים בתרבית של וכימות הייצור inducible כימי של 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) עם immunostaining, cytometry זרימה או וזמינותו של נקודה-כתם. כלי זה epigenome כימית-inducible שיפוץ תוכלו למצוא לשימוש נרחב חוקר מערכות סלולריות מבלי לשנות את הקוד הגנטי, וכן בודק את הקשרים epigenotype−phenotype במערכות ביולוגיות שונות.

המרה כימית 5mC-אל-5hmC inducible הניתנים לאימות על ידי immunostaining ברמה תא בודד, ניתוח cytometry זרימה על אוכלוסיות transfected תא (mCherry-חיוביים), או assay דוט-חשופה יותר כמותיים כמופיע באיור1. תחום קטליטי של TET2, או TET2CD, שימשו לאורך כל תקופת המחקר כפקד חיובי. ראה הפניות 18-20 פרטים נוספים לגבי מיפוי הגנום כולו rapamycin-induced שינויים בנגישות 5hmC וכרומטין.
<img alt="Figure 1" class="xfi...

פרוטוקולים מפורט ידביקו אנזים פיצול מהונדסים-TET2 (סיידר) בתרבית של תאים עבור hydroxymethylation כימיים של הדנ א inducible ובניה epigenetic מוצגים.

אנזים פיצול-TET2 הנדסה כימית-inducible DNA Hydroxymethylation, שיפוץ Epigenetic

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

המטרה הכוללת של סדרת ניסויים זו היא להכניס אנזים מפוצל-TET2 מהונדס הנקרא CiDER לתאי יונקים לשינוי DNA הניתן להשראה כגון הידרוקסימתילציה וכן שיפוץ אפיגנטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה כגון היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהאנזים המפוצל-TET2 המהונדס מאפשר בקרה זמנית על חמצון 5-מתילציטוזין ועיצוב מחדש של מצבים אפיגנטיים בתאי יונקים עם תוספים כימיים. כדי להתחיל בהליך זה, תרבית קו תאים דבק ב-DMEM בתוספת 10% FBS מומת חום וכן 100 יחידות למיליליטר של פניצילין וסטרפטומיצין.דגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. העבירו את התאים עם הפלסמיד CiDER כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן דגרו על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.למחרת, החלף את המדיה המכילה ריאגנט טרנספקציה ב-DMEM שלם טרי. כדי לגרום כימית לתאים, הוסף 20 מיקרוליטר של רפמיצין מדולל לתאים המועברים הנשמרים בשני מיליליטר של מדיום כדי להגיע לריכוז סופי של 200 ננו-מולר. כדי לבצע ציטומטריית זרימה, השעו מחדש את התאים המועברים והמושרים על ידי רפמיצין במאגר FACS.עבור קבוצת הביקורת, השתמש בתאים המבטאים CiDER ללא טיפול ברפמיצין. תקן וחדיר את התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הוסף שתי חומצות הידרוכלוריות, רגילות, לתאים כדי לנטרל את הדנ"א למשך 10 דקות.לאחר נטרול וחסימת התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוסף את הנוגדן המדולל נגד 5hmC לתאים. דגרו על התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים עם מאגר FACS שלוש פעמים.הסר את מאגר ה-FACS ביסודיות. הוסף נוגדן משני מצומד פלואורופור מדולל לניתוח FACS ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את התאים עם מאגר FACS שלוש פעמים.לאחר הכביסה, הדגימות מוכנות לניתוח FACS. לבודד DNA גנומי מתאים שעברו טרנספטציה ומושרים על ידי רפמיצין באמצעות ערכת מיצוי DNA מסחרית. עבור קבוצת הביקורת, השתמש בתאים שעברו טרנספטציה של CiDER ללא טיפול ברפמיצין.מחממים את תנור הוואקום ל-80 מעלות צלזיוס. משרים מראש את קרום הניטרוצלולוזה במים מזוקקים כפולים ולאחר מכן במאגר SSC 6X למשך 10 דקות. לאחר מכן, טען 60 מיקרוליטר של כמויות שוות של DNA לצלחת PCR של 96 בארות.הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר TE לשאר הבארות. בצע דילולים טוריים כפולים אנכית על צלחת 96 הבארות על ידי העברת 30 מיקרוליטר של תמיסה בשורה הראשונה לאותו מיקום עמודה בשורה השנייה. מערבבים שוב ומעבירים 30 מיקרוליטר תמיסה לבארות בשורה שלאחר מכן עד להגעה לגבול.ואז הסר את 30 המיקרוליטרים האחרונים מהבאר. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד מולרי אחד ו-10 מילי-מולרי EDTA לכל באר. אוטמים את הצלחת ומחממים את התערובת למשך 10 דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס כדי לפגוע לחלוטין בדופלקס ה-DNA.מצננים מיד את הדגימות על הקרח. מוסיפים 50 מיקרוליטר קר קרח שני אמוניום אצטט טוחנת לכל באר ודוגרים על קרח למשך 10 דקות. בינתיים, הרכיבו את מנגנון כתם הנקודות עם הממברנה הספוגה מראש.הסר את המאגר הנותר באמצעות ואקום מלא. שטפו את הממברנה על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר TE לכל באר של מנגנון כתמי הנקודות. הפעל את הוואקום כדי להסיר את מאגר TE.לאחר מכן, טען את ה- DNA המפורק לכל באר של מנגנון כתמי הנקודות. הפעל את הוואקום כדי להסיר את התמיסה. שטפו את הממברנה על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 2X SSC והסירו תמיסות שאריות לחלוטין באמצעות ואקום.פרק את מנגנון כתמי הנקודות. לאחר מכן הוציאו את הממברנה ושטפו את כל הממברנה עם 20 מיליליטר של 2X SSC. יבש את הממברנה באוויר למשך 20 דקות.לייבוש נוסף של הממברנה, אופים אותה בחום של 80 מעלות בוואקום למשך שעתיים. מוסיפים את תמיסת החסימה לקרום ודוגרים למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת התמיסה החוסמת, הוסיפו את הנוגדנים המדוללים של 5 hmC או 5-mC לממברנה ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.שטפו את הממברנה עם TBST שלוש פעמים למשך 10 דקות כדי להסיר שאריות נוגדנים. לאחר הסרת ה-TBST ביסודיות, הוסף נוגדן משני מצומד HRP לממברנה. דגרו את הממברנה למשך שעה בטמפרטורת החדר.שוטפים את הממברנה עם TBST שלוש פעמים למשך 10 דקות. לבסוף, הוסף מצע כתמים מערבי ECL לממברנה להדמיה של אותות 5-hmC באמצעות גלאי כימילומינסנציה. תוצאת כימות מייצגת של ייצור 5-hmC בתיווך CiDER על ידי ציטומטריית זרימה מוצגת כאן.רק תאים המבטאים CiDER בתנאים שטופלו ברפמיצין מראים עלייה משמעותית ברמות 5-hmC. תוצאה מייצגת של השינוי העולמי של רמת 5-hmC בכל אוכלוסיית התאים על ידי בדיקת כתמי נקודות מוצגת כאן. בקרת ההעמסה מודגמת על ידי צביעת אתילן כחול של הכמויות הכוללות של DNA קלט.התוצאות מראות כי טיפול ברפמיצין גורם לייצור חזק של 5-hmC בתאי HEK293T המבטאים CiDER עם פעילות רקע זניחה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטיקה לחקור את תפקוד התא מבלי לשנות את הקוד הגנטי ולחקור את יחסי האפיגנוטיפ והפנוטיפ במערכות ביולוגיות שונות.

an-engineered-split-tet2-enzyme-for-chemical-inducible-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

EpiMark 5-5-HMC ו MC ערכת ניתוח יכול לשמש כדי לנתח לכמת 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine בתוך מוקד spe cific. הערכה מבדיל 5-MC מתוך 5-HMC על ידי תוספת של גלוקוז אל קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC דרך התגובה האנזימטית ניצול β-glucosyltransferase (T4-BGT). כאשר 5-HMC מתרחשת בהקשר של CCGG, שינוי זה ממיר אתר cleavable MspI לאתר הלא cleavable.

רגישות גבוהה 5-hydroxymethylcytosine איתור ברקמה Balb / C המוח

תאר הוא תהליך תיוג שני שלבי שימוש (β-GT) β-glucosyltransferase להעביר תזיד-גלוקוז ל5-HMC, ואחרי לחץ כימיה להעביר מקשר ביוטין להעשרה קלה וצפיפות בלתי תלויה. שיטת תיוג יעילה וספציפית זו מאפשרת העשרה של 5-HMC עם רקע נמוך ביותר ומיפוי epigenomic תפוקה גבוהה באמצעות רצף של הדור הבא.

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

DNA וחלבונים-במיוחד רצף שכותרתו עם זיקה או קבוצות כתב ניאון באמצעות methyltransferases DNA או חלבון ואנלוגים cofactor סינטטיים. בהתאם לסגולי כקו-הפקטורים של האנזימים, aziridine או אנלוגים cofactor מופעלים כפולים מועסקים תיוג אחת או שני שלבים.

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

כאן, אנו מציגים עבור טיהור יעיל צעד בודד של האדם לא מתויגות הפעיל פרוטוקול 10-11 טרנסלוקציה-2 (TET2) dioxygenase 5-methylcytosine באמצעות יונים כרומטוגרפיה ואת וזמינותו שלה באמצעות מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית מסות (LC-MS/MS)-המבוסס על הגישה.

טיהור יעיל ופיתוח Assay LC-MS/MS-מבוסס על 10-11 טרנסלוקציה-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

רגולציה של הסביבה כרומטין הוא תהליך חיוני הדרוש עבור ביטוי נאות גנים. כאן, אנו מתארים שיטה לפיקוח על ביטוי גנים דרך הגיוס של שינוי כרומטין מכונות באופן ספציפי ג'ין הפיך.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

ניתן לפתח את הגבלת הגבלות עם ספציפיות רצף חדש מאנזימים המספרים על רצף מנוון באופן חלקי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כי השתמשנו בהצלחה כדי לשנות את הספציפיות הרצף של האנזים NlaIV. מרכיבי המפתח של הפרוטוקול הם ממדר החוץ של התגובה שעתוק/תרגום ומבחר של משתנים עם משתני רצף חדש.

האבולוציה בבימויו של הגבלת מגבלות על הגבלה עם ספציפיות יותר מחמירות

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחירה חוץ גופית של מדכאי שעתוק מהונדסים (ETR) עם יעילות השתקה גבוהה, ארוכת טווח, יציבה, על המטרה ופעילות נמוכה מחוץ למטרה. תהליך עבודה זה מאפשר לצמצם רפרטואר ראשוני ומורכב של תעודות סל מועמדות לרשימה קצרה, המתאימה להערכה נוספת במסגרות רלוונטיות מבחינה טיפולית.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפחתת שינויים ב-DNA בבקטריופאג'ים באמצעות האנזים NgTET, המאפשר מוטגנזה יעילה וללא צלקות של CRISPR-Cas. שיטה זו מאפשרת הנדסה גנטית של פאג'ים ליישומים בביוטכנולוגיה וטיפול בפאג'ים.

מוטגנזה מדויקת של פאג'ים עם מערכות CRISPR-Cas בסיוע NgTET

פרוטוקול זה מתאר מערכת מבוססת CRISPR/dCas9 אפיזומלית לא אינטגרטיבית לעריכה אפיגנטית ממוקדת בתאי K562, המשלבת אפקטורים dCas9-DNMT3A ו-dCas9-HDAC1 עם sgRNAs ספציפיים כדי לגרום למתילציה של DNA ספציפי ללוקוס עם דיוק והשפעות מופחתות מחוץ למטרה.

הנדסה אפיגנטית של תאי K562: אסטרטגיה אפיזומלית דו-וקטורית למתילציה ממוקדת יציבה של DNA באמצעות חלבוני היתוך dCas9-DNMT3A ו-HDAC1

למד כיצד להשתמש באנזים CiDER הנדסי לשליטה כימית בהידרוקסימתילציה של DNA ושיפוץ אפיגנטי בתאי יונקים. שיטה זו מאפשרת בקרה זמנית מדויקת על שינויים אפיגנטיים ומסייעת בחקר תפקוד גנים ללא שינוי הקוד הגנטי.

אנזים פיצול-TET2 הנדסה כימית-inducible DNA Hydroxymethylation, שיפוץ Epigenetic

גלה סרטונים נוספים