הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של הרשת נוירו-סקסיסטית לבלב אנושי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים שיטת ניקוי אופטי אופטית אופטית אופטית ופסיבית המתאימה לשימוש עם רקמת לבלב אנושית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, הנוגעות לסוכרת, על ידי מתן פרטים על העצבוב של איים. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא ששיטת הניקוי מבטיחה שקיפות של רקמת הלבלב האנושית לשימוש בהדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה.

כדי להתחיל, תקן דגימת לבלב על ידי הנחתה ב-4% פרפורמלדהיד טרי, ודגירה על הדגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר מכן, צננו בקבוק על ידי הנחתו בדלי עם קרח. ואז הניחו את הדלי על גבי צלחת ערבוב מגנטית.

ודא שהבקבוק יושב שטוח, והוסף מוט ערבוב מגנטי. שופכים 147.8 מיליליטר מים מזוקקים קרים כקרח ונטולי יונים לבקבוק. לאחר מכן הוסיפו 20 מיליליטר של 0.1 PBS מולארי, 20 מיליליטר של תמיסת אקרילאמיד 40% קרה כקרח, 12.2 מיליליטר של תמיסת 16% פרפורמלדהיד ו-250 מיליגרם של יוזם VA-044.

מערבבים את כל תמיסת ההידרוג'ל למשך 10 דקות לפחות. לאחר מכן, הניחו צינור חרוטי של 15 מיליליטר בקרח ליד הבקבוק המכיל את תמיסת ההידרוג'ל. פיפטה 14 מיליליטר תמיסת מונומר לתוך הצינור.

ולהוסיף חתיכה אחת מדגימת הרקמה הקבועה והחתוכה. ואז מכסה את הצינור. דגרו את הדגימה בתמיסת המונומר למשך 3 ימים בארבע מעלות צלזיוס, תוך הגנה מפני אור.

לאחר הדגירה, הניחו את הדגימה על קרח. לאחר מכן חבר צינורות למיכל חנקן דרך תא עצירה. תוך שמירה על הדגימה על קרח, השתמש בזהירות במחט היפודרמית בגודל 18 כדי לנקב את המכסה של צינור חרוטי המכיל את הדגימה בצד אחד.

הכנס את המחט לתוך הצינור עד שהיא נמצאת מתחת לפני השטח של תמיסת המונומר הנוזלי. לאחר מכן השתמש במחט היפודרמית נוספת בגודל 18 כדי לנקב את הצד הנגדי של המכסה, אך אל תאפשר לה לשקוע בתמיסה, כך שהיא תוכל לשמש כפתח אוורור. חבר את הצינור ממיכל החנקן למחט ההיפודרמית השקועה מתחת להידרוג'ל, והפעל לאט את החנקן, עד שהוא מבעבע בהתמדה דרך הנוזל.

לאחר ביטול החמצן, הסר במהירות את שתי המחטים, וכסה את המכסה בסרט פרפין, כדי למנוע חילופי גזים נוספים בין הצינור לסביבה. לבסוף, הניחו את הדגימה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, למשך שלוש שעות, כדי לפלמר את ההידרוג'ל. לאחר פילמור, שפכו את כל ההידרוג'ל שנותר.

לאחר מכן, שטפו את הדגימה ב-3 עד 5 החלפות של 0.01 PBS מולארי למשך 15 דקות בכל שלב כביסה. לאחר הכביסה, העבירו את הדגימה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 40 מיליליטר או מאגר ניקוי. דגרו את הדגימה במאגר הפינוי ב-37 מעלות צלזיוס והחליפו את הדגימה למאגר פינוי טרי כל יומיים.

כדי לבדוק את הניקוי הנכון, החזק את הדגימה מול אור וודא שהדגימה מאפשרת אור לעבור דרכו אך שומרת על צבע שזוף מסוים באזורים האקסוקריניים. דגימה מנוקה יתר על המידה תיראה מרופטת בקצוות והמרקם יהיה רך מאוד כאשר מרימים אותו בעזרת מלקחיים. זה נפוץ שדגימה מתנקה בצורה לא אחידה.

החליפו את מאגר הפינוי ב-40 מיליליטר 0.01 PBS מולארי, והניחו את הדגימות על שייקר ב-60 סל"ד למשך יום אחד בטמפרטורת החדר. בצע ארבעה עד חמישה החלפות חיץ ותן לכביסה הסופית להימשך לאורך הלילה. לאחר מכן, הכינו את מאגר הצביעה של PACT בצינור תחתון שטוח של 2 מיליליטר והוסיפו 2% סרום רגיל ל-1 מיליליטר של מאגר ה-PACT הבסיסי.

לאחר מכן, הוסף בערך פי חמישה מהכמות הסטנדרטית של נוגדנים ראשוניים למאגר הצביעה. בעזרת מרית, הסר את הדגימה ממאגר הכביסה וטפח את המאגר העודף על מגבת נייר. הכניסו את הדגימה לתוך הצינור עם תמיסת הנוגדנים הראשונית, ודגרו אותה בתמיסה למשך יומיים עד ארבעה ימים בטמפרטורת החדר, על שייקר, ב-60 סל"ד.

לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הנוגדנים והוסף 0.01 PBS מולארי. שטפו את הדגימות היטב על השייקר ב-60 סל"ד, החליפו למאגר טרי ארבע עד חמש פעמים והשאירו את הכביסה הסופית על השייקר למשך הלילה. לאחר מכן, הוסף את הנוגדן המשני ב-1 עד 200 במאגר הצביעה PACT עם סרום נוסף של 2%.

השתמש במרית כדי להסיר את הדגימה ממאגר הכביסה ולטפוח את המאגר העודף על מגבת נייר. לאחר מכן הנח את הדגימה בצינור עם תמיסת הנוגדנים המשנית. הגן על הדגימה מפני אור תוך דגירה של הדגימה בטמפרטורת החדר על שייקר ב-60 סל"ד למשך יומיים.

לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הנוגדנים והחלף אותה ב-0.01 PBS מולארי. שטפו היטב את הדגימות על השייקר ב-60 סל"ד, החליפו למאגר טרי ארבע עד חמש פעמים והשאירו את הכביסה הסופית על השייקר למשך הלילה. כדי להתחיל, הכן את מאגר התמיסה המותאם למקדם השבירה על ידי שקילה תחילה של 11 גרם של מדיום שיפוע בצפיפות לא יונית והעברתו בזהירות לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן הוסף 5 מיליליטר של מאגר פוספט מולארי 0.02 באמצעות מרית כדי לשחרר אוויר ממדיום שיפוע הצפיפות הלא יונית האבקתי. במידת הצורך, הביאו את הנפח עד 10 מיליליטר, השתמשו ביותר ממאגר הפוספט המולרי 0.02, ערבבו אותו עם מרית ואז גרדו את העודפים מהמרית לתוך הצינור. דגרו את המאגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהוא נמס לחלוטין, הופכים אותו ומערבבים אותו בעדינות מעת לעת.

העבירו דגימות למאגר תמיסת התאמת מקדם השבירה ודגרו אותן על הספסל המוגן מאור במשך יומיים עד ארבעה ימים לפני ההדמיה. רגע לפני ההדמיה, הנח כמות קטנה של תמיסת התאמת מקדם השבירה לתוך שקופית תא תחתונה של שמונה בארות. לאחר מכן הוסף את הדגימה לבאר וכסה את השקופית.

בלבלב האנושי, ניתן לתחום איים על ידי אינסולין, גלוקגון וגרנה מופרשת 3 עבור תאי בטא, תאי אלפא או כל התאים האנדוקריניים בהתאמה. תאי שוואן נראים לבנים, ותאים אנדוקריניים מוצגים מוכתמים על ידי אינסולין או גלוקגון. עצבים, העוברים ליד כלי הדם בפריפריה של האי בולטים כקווים לבנים ונמשכים לתוך האיים.

כאן ניתן לראות בבירור מגע בין תאי שוואן לתאים אנדוקריניים. כאן, דגימה שהוכנה בשיטות המוצגות בסרטון זה הוכתמה עבור פפטיד מעיים ואזואקטיבי וצולמה באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור. סיבי העצב נראים בבירור ברזולוציה גבוהה ומוצגים כשהם עוטפים צינור בחזית וגנגליון ברקע.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש באזורי הלבלב ללא צינורות וכלי דם עיקריים.