Name: דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: למדו שיטה לבידוד וגידול קרטינוציטים אנושיים ראשוניים מעור מבוגרים לחקר ביולוגיה עורית ומחלות דלקתיות. טכניקה זו מאפשרת מחקר מבוקר של תאי עור אנושיים במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר מבקש להודות אנט Blak רסמוסן, קריסטין מולר התמיכה הטכנית שלהם

האוסף של דגימות עור בריא מתנדבים בוגרים שעברו ניתוח פלסטי מחייב אישור מן הוועדה האתית במוסדות המארח. פרוטוקול זה אושרה על ידי אזורי אתית הוועדה של אזור Midtjylland, דנמרק (M-20110027). השיטה המתוארת כאן נגזר ממחקרים דומים על ידי. Maciaq et al. 10 ו ליו, Karasek11.
1. בידוד של Keratinocytes מהעור האנושי
<ol>
	<li>נתחיל בכך את הפתרונות הבאים: 50 מ ל תמיסת גלוקוז טריפסין, 0.1% 0.25% ב- DPBS. מיקס ומסנן לחטא (0.2 µm) הפתרון. הכינו 10 מ"ל של RPMI-1640 + 2% FBS פתרון, 50 מ של DPBS ותקין ללא סרום בינוני (KSFM). להוסיף 500 מ"ל של KSFM KSFM תוספי תזונה ו- 250 µL של gentamycin. לחמם את הפתרונות 37 ° C לפני השימוש.</li>
	<li>לאסוף עור בריא מתנדבים בוגרים שעברו ניתוחים פלסטיים. הדגימות העור בשימוש כ 10 ס"מ x 15 ס מ, אך יכול להשתנות בגודלו. שמור הקריר העור תחת תחבורה על ידי הובלת את העור הדגימות בקופסת קלקר המכילה קירור. במידת הצורך, דוגמית העור ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>להסיר שומן מן תחת המקטע העור באמצעות מספריים מעוקר, כמו מה, אזמל, מלקחיים.</li>
	<li>אבזם את המקטע העור (כ 10 ס"מ על 15 ס"מ) על כיסוי סטרילי על גבי צלחת באמצעות מחטים. ראשית, לנקות את העור עם כרית יבשה גאזה מעוקר. לאחר מכן לנקות את העור באמצעות כרית סטיריליים גזה עם 70% אתנול.</li>
	<li>באמצעות פלנר רגל, חתך של השכבה העליונה (האפידרמיס) של המקטע העור ושם אותו בתוך 9 ס מ פטרי. לאחר מכן, מיד להוסיף 25 מ של הפתרון DPBS/טריפסין/גלוקוז (להכין בשלב 1.1) צלחת פטרי. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>באמצעות פיפטה להסיר את הפתרון DPBS/טריפסין/גלוקוז הפטרי ולהוסיף 10 מ"ל של RPMI-1640 + 2% FBS כדי להשבית את טריפסין.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים שני, עכשיו שחרר את התאים באפידרמיס לתוך האמצעי על ידי גירוד ובעדינות לזעזע את אפידרמיס והן תא עורי של הסעיפים העור.</li>
	<li>לסנן את המתלים תאים באפידרמיס דרך פילטר מתכת (גודל החור של 1 מ מ), ולאסוף בשפופרת 50 מ. להוסיף הסעיפים הנותרים העור שפופרת 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של RPMI-1640 ללא FBS ו מערבולת למסנן ס' 10 ההשעיה דרך המתכת לסנן לתוך צינור 50 מ ל המכיל את המתלים תאים באפידרמיס. להוסיף DPBS הנפח הכולל של 50 מ.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא 10 דקות ב g x 450 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תאים באפידרמיס כ- 10 מ"ל של 37 ° C KSFM בהתאם לגודל בגדר התא. לספור את התאים באמצעות התכלת Trypan מכתים שיטת תחת מיקרוסקופ. מספר התאים המתקבל מקטע העור 10 ס"מ על 15 ס"מ הוא כ 50-100 x 106 תאים. את כל הבקבוק תרבות2 75 ס מ, העברת תאים6 8 x 10 יחד עם 12 מ של 37 ° C KSFM. ללחוץ בעדינות את המבחנות תרבות כדי להבטיח התפלגות אחידה של תאי.</li>
	<li>דגירה של keratinocytes ב חממה 37 ° C עם 100% לחות ו-5% CO2. לשנות את המדיום ואחרי יומיים שלוש פעמים בשבוע. מעבר תאים כאשר 70-80% confluent, אשר לוקח כשבועיים תלוי קצב התפשטות keratinocytes התרבות.</li>
</ol>
2. passaging של Keratinocytes
<ol>
	<li>מחממים את הכמות המתאימה של 0.05% טריפסין-EDTA לפתרון 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור. השתמש 4.5 מ של 0.05% טריפסין-EDTA פתרון עבור בקבוקון תרבות 75 ס מ2 .</li>
	<li>הסר בינוני את התאים, וכן להוסיף 4.5 מ ל/75 ס מ2 תרבות הבקבוק מראש חימם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA לתאים. מקם את הבקבוקון תרבות בחממה (37 מעלות צלזיוס), לאחר כ 5 דקות, לבדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים החלה התרופפות.</li>
	<li>כאשר כ- 50% של התאים יש השתחררו, פגע בעדינות את הבקבוק תרבות נגד היד כדי לשחרר את התאים הנותרים. לאחר מכן, כדי להשבית את טריפסין, להוסיף 6 מ של RPMI-1640 + 2% FBS (37 מעלות צלזיוס)2 . הבקבוק תרבות 75 ס מ, להעביר התליה תא צינורות 50 מ.</li>
	<li>לשטוף את המבחנות תרבות עם 3 מ"ל של RPMI 1640 + 2% FBS ולהוסיף הצינורות 50 מ ל. צנטריפוגה תאים עבור 10 דקות ב g x 450 בטמפרטורת החדר.
	<ol>
		<li>Resuspend תאי pelleted 10 מ"ל של KSFM (37 מעלות צלזיוס). לספור את התאים ולהעביר 3 x 106 תאים בקבוקון תרבות 150 ס"מ2 יחד עם 20 מ של KSFM (37 מעלות צלזיוס). לנער בעדינות את הבקבוק תרבות כדי להבטיח התפלגות אחידה של התאים. להקפיא את התאים כאשר התרבות היא 80-90% confluent, אשר לוקח כ 4-6 ימים בהתאם קצב התפשטות keratinocytes (ראה סעיף 3, הקפאת פרוטוקול להלן). הרחב את keratinocytes ליצירת מניות קפוא המתאים.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. הקפאת Keratinocytes
<ol>
	<li>מחממים את הכמות המתאימה של 0.05% טריפסין-EDTA לפתרון 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור. השתמש 9 מ של 0.05% טריפסין-EDTA פתרון עבור בקבוקון תרבות2 150 ס"מ.</li>
	<li>הסר בינוני את התאים, וכן להוסיף 9 מ ל/150 ס מ2 תרבות הבקבוק מראש חימם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA לתאים. מקם את הבקבוקון תרבות בחממה (37 מעלות צלזיוס), לאחר כ 5 דקות, לבדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים החלה התרופפות.</li>
	<li>כאשר כ- 50% של התאים יש השתחררו, פגע בעדינות את הבקבוקון תרבות נגד היד על מנת לשחרר את התאים הנותרים. לאחר מכן, כדי להשבית את טריפסין, להוסיף 12 מ של RPMI-1640 + 2% FBS (37 מעלות צלזיוס) הבקבוקון תרבות של2 ס מ 150, תשאף התליה תא ל 50 מ ל צינורות.</li>
	<li>לשטוף את המבחנות תרבות עם 6 מ של RPMI 1640 + 2% FBS ולהוסיף הצינורות 50 מ ל. Centrifuge צינורות 10 דקות ב g x 450-4 מעלות צלזיוס. הכן תא קר כקרח קפוא בינוני (KSFM + 10% דימתיל סולפוקסיד).</li>
	<li>Resuspend בגדר תא KSFM + 10% דימתיל סולפוקסיד לספור את התאים, הקפאת תאים על צפיפות של 6 x 106 תאים למ"ל באמצעות שיטות הקפאה קריוגנית קירור איטי תקן12.</li>
	<li>לאחסן את keratinocytes בחנקן נוזלי (אדי שלב) עד מוכן לשימוש.</li>
</ol>
4. מפשיר ו Culturing Keratinocytes קפוא
<ol>
	<li>במהירות להפשיר את הבקבוקונים קפוא המתאים באמבט מים 37 ° C. השתמש 70% אתנול לנקות את החלק החיצוני של cryovial. להעביר מספר מתאים של תאים (כ- 15,000 תאים/cm2) בקבוקון תרבות ולהוסיף מיד מדיום הגידול ומחוממת מראש (KSFM) הבקבוקון תרבות. ניתן להשתמש בכל גודל של תרבות מבחנות בהתאם הכיוונון של הניסוי.</li>
	<li>השתמש בינוני תרבות 5 מ"ל בקבוקון תרבות2 25 ס מ.</li></ol>מספר התאים הוסיף שהבקבוקון תרבות עשויות להשתנות כי הצמיחה של התאים משתנה התורם תורם. דגירה בתאים 37 ° C חממה עם 100% לחות ו-5% CO2.
	<li>שינוי המדיום לאחר יומיים, שלוש פעמים מדי שבוע באמצעות KSFM מראש ומחוממת טריים. הערה: הנתונים שלנו הראו כי בממוצע 95% של תאים מבודדים באמצעות פרוטוקול המתוארים כאן הם חיוביים עבור cytokeratine-14 תקין-מרקר13.</li>

<ol><li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li>
<li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes%3A+key+immunocytes+of+the+integument%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li>
<li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li>
<li>Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+immune+system+Its+cellular+constituents+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">The skin immune system Its cellular constituents and their interactions.</a> Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).</li>
<li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li>
<li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets+Inflamm+Allergy%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li>
<li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li>
<li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+%28MMP-1%29+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li>
<li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li>
<li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endocrine+approach+to+the+control+of+epidermal+growth%3A+serum-free+cultivation+of+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes.</a> Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).</li>
<li>Liu, S. C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li>
<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li>
<li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li>
<li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li>
<li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).</li>
<li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li>
<li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment%3A+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li>
<li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li>
</ol>

. המחבר יש אין ניגוד אינטרסים.

כאן, אנו נתאר כיצד לבודד בקלות keratinocytes האדם העיקרי מן העור למבוגרים, וכיצד תרבות אותם במבחנה. מודל זה יכול להיות יישום נרחב לחקירה של ביולוגיה של התא עוריות ולאחר יכול להיות שימושי עבור מהחוקרים המעוניינים ללמוד מחלות עורית.
חלק מהיתרונות של הפרוטוקול המתואר כאן הוא בניגוד keratinocytes מבודד מן העורלה neonatal המתקבל זכרים היילוד שעברו ברית מילה, keratinocytes האדם העיקרי של חולים מבוגרים הם מבודדים מן גברים ונשים כאחד ולכלול שנים ≥18 בכל גיל. לכן, המגוון הביולוגי הוא הרבה יותר...

העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף האדם ומשמש מחסום מגן מפני הסביבה החיצונית. העור מורכב שתי שכבות עיקריות: דרמיס לאפידרמיס, איפה האפידרמיס מהווה את השכבה החיצונית ביותר של העור. הסוג הנפוץ ביותר תאי האפידרמיס הוא keratinocytes הכוללת יותר מ 95% של מסה1,תא2. Keratinocytes נשמרים בשלבים שונים של בידול האפידרמיס, מאורגנים לשכבות הבזליים, spinous, פרטנית ו cornified התואמים בשלבים מסוימים של בידול3. התפקיד העיקרי של keratinocytes נועד לספק את השלמות. המבנית של האפידרמיס, ובכך לייצר מחסום שלם לעולם החיצון.
Keratinocytes לייצג גם את השורה הראשונה של הגנה מפני פתוגנים בעור, לכן יש תפקיד חשוב ב4,תגובה חיסונית מולדת5. חשיפת keratinocytes לגירויים חיצוניים מוביל ההפעלה של איתות המסלולים תאיים ובעקבות כך, ייצור של מספר מתווכים דלקתיים שונים, לרבות ציטוקינים, נוגדנים פפטידים מיקרוביאלית. חלבונים אלה נגזר תקין להשתתף בתגובה דלקתית על ידי גיוס והפעלת תאים חיסוניים כגון תאים דנדריטים, נויטרופילים ספציפי T תאים6,7. לכן, בגלל keratinocytes לשחק תפקיד מכריע בתהליכים ביולוגיים רבים, הרציונל מאחורי הטכניקה המובאת כאן היה ליצור מודל במבחנה ללמוד ביולוגיה העור. תרבויות תקין ראשוני המתקבל העורלה neonatal משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד העור-ביולוגיה-8,-9. עם זאת, עם הטכניקה המתוארת כאן, keratinocytes של שני המינים מתקבלים וכתוצאה מכך מגוון ביולוגי גבוה יותר של התאים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על בידוד ועל הדור של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים, כולל תחזוקה, הקפאה של keratinocytes. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לייצר ראשי keratinocytes אנושי שיכול לשמש כמודל ללמוד ביולוגיה עורית חוץ גופית בתוך.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>תוספי KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>תוספי מזון עבור KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS ללא סידן ומגנזיום</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td>דימתיל סולפוקסיד</td></tr><tr><td>גנטמיצין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>תוסף מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>מסנן עיקור</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>מסנן מזרק בגודל נקבוביות של 0.2 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>משמש לטריפסיניזציה של תאים</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7528-RPMI-1640</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>משמש להשבתת מלקחיים של טריפסין</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td> <td>ניתן להשתמש</td></tr> <tr>במלקחיים מכל חברה<td>מספריים</td> <td>-</td><td></td> <td>ניתן להשתמש במספריים מכל חברה</td></tr><tr><td>אזמל</td><td>סוואן מורטון</td><td>0501</td><td>אזמל מכל חברה ניתן להשתמש ב</td></tr><tr><td>70% אתנול</td> <td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>רפידות גזה</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>רפידות גזה מכל ספק ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>בפלנר כף הרגל</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>ניתן להשתמש בפלנר כף הרגל מכל ספק</td></tr><tr><td>ניתן להשתמש בצלחות פטרי</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>צלחות פטרי מכל ספק ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>במסנן מתכת</td> <td>-</td><td></td> <td>בבית מסנן מתכת בגודל חור 1 מ"מ</td></tr><tr><td>75 ס"מ2 צלוחיות תרבות</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>156499-150 ס"מ2 צלוחיות תרבית</td><td>TTP</td><td>90151-0.05</td><td></td></tr><tr><td>% תמיסת טריפסין-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>משמש לטריפסיניזציה של תאים בעת מעבר</td></tr></tbody></table>

דור, culturing של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

הפונקציה העיקרית של keratinocytes נועד לספק את השלמות. המבנית של האפידרמיס, ובכך שומר על מחסום מכני אל העולם החיצון. בנוסף, keratinocytes ממלאות תפקיד חיוני החניכה, תחזוקה, רגולציה של תגובות חיסוניות עוריות באופן אקטיבי של מערכת החיסון המולדת להגיב לגירויים antigenic בצורה מהירה, לא ספציפית. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור בידוד של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים, ומדגימים כי תאים אלה מגיבים סידן-induced התמיינות סופנית, כפי שנמדדה על ידי ביטוי מוגבר של involucrin סמן בידול. בנוסף, אנו מראים כי keratinocytes מבודדים הם מגיבים IL-1β-induced הפעלת איתות המסלולים תאיים כפי שנמדד על-ידי הפעלת מסלול MAPK p38. יחדיו, נתאר שיטת בידוד, culturing של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. מאחר keratinocytes הן סוג התא השולט האפידרמיס, שיטה זו שימושית לחקור את המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית בתוך חוץ גופית.

סידן-induced התמיינות סופנית Keratinocytes האדם עוברים התמיינות סופנית בעת טיפול עם סידן14,15,16. ראשי keratinocytes האנושי היו מבודדים ותרבותית כמפורט בפרוטוקול לעיל. כאשר כ 50-60% confluent, התאים היו מגורה עם סידן (1.2 מ מ) או הרכב ותמונות של התאים צולמו ביום 0, 1 ו- 2. איור 1 מציג את השינויים מורפולוגי של keratinocytes שנצפו על גירוי סידן.
...

העור האנושי פועל כשורה הראשונה של הגנה מפני הסביבה החיצונית. אנו מציגים שיטה לבודד את ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. Keratinocytes מבודדים אלה שימושיים רבים setups ניסיוני, הם מודל המתאים מאוד ללמוד המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית במבחנה.

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר קרטינוציטים אנושיים ראשוניים שיכולים לשמש כמודל לחקר ביולוגיה עורית במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי האפידרמיס, כגון כיצד מווסתת התמיינות קרטינוציטים אנושיים או כמודל לחקר מחלות עור דלקתיות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן לבודד קרטינוציטים אנושיים ראשוניים באופן קונבנציונלי מעור בוגר של גברים ונשים כאחד ויכולים לכלול עור של אנשים בכל גיל מעל גיל 18.תדגים את ההליך אנט בלק רסמוסן, טכנאית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הכינו תמיסה של 50 מיליליטר של 0.25% טריפסין ו-0.1% גלוקוז ב-DPBS. לאחר מכן, מערבבים ומסננים מעקרים את התמיסה.הכן 10 מיליליטר של RPMI 1640 בתוספת 2% FBS, 50 מיליליטר DPBS ומדיום ללא סרום קרטינוציטים, או KSFM. הוסף תוספי KSFM ו-250 מיקרוליטר גנטמיצין ל-500 מיליליטר KSFM. לאחר מכן, יש לחמם מראש את התמיסות ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.אסוף דגימות עור בגודל 10 סנטימטר על 15 סנטימטר ממתנדבים בוגרים בריאים העוברים ניתוחים פלסטיים. שמור על העור קריר על ידי הובלת דגימות העור בקופסת קלקר המכילה אלמנט קירור. במידת הצורך, אחסן את דגימת העור בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.בעזרת מספריים, אזמלים ומלקחיים מעוקרים, הסר שומן מתחת לחלק העור. לאחר מכן, בעזרת מחטים, חגרו את חלק העור על כיסוי סטרילי על גבי צלחת. בעזרת כרית גזה יבשה ומעוקרת, נקו את העור.לאחר מכן, המשיכו עם 70% אתנול על פד גזה מעוקר. לאחר מכן, בעזרת פלנר לכף הרגל, חתכו את שכבת האפידרמיס העליונה של חלק העור והעבירו אותה לצלחת פטרי של תשעה סנטימטרים. לאחר מכן, הוסף מיד 25 מיליליטר מתמיסת הגלוקוז DPBS טריפסין שהוכנה בעבר לצלחת הפטרי.דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעזרת פיפטה, הסר את תמיסת הגלוקוז DPBS טריפסין מצלחת הפטרי והוסף 10 מיליליטר RPMI 1640 בתוספת 2% FBS כדי לנטרל את הטריפסין. כעת, בעזרת שני מלקחיים, שחרר את תאי האפידרמיס לתוך המדיום על ידי גירוד עדין וערבוב הן של תא האפידרמיס והן של תא העור של חלקי העור.מסננים את מתלה תאי האפידרמיס דרך מסנן מתכת ואוספים את המסנן לצינור של 50 מיליליטר. הוסף את חלקי העור הנותרים לשפופרת של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר RPMI 1640 ללא FBS ומערבולת למשך 10 שניות. סנן את המתלה הזה דרך מסנן המתכת לתוך צינור של 50 מיליליטר המכיל את תרחיף תאי האפידרמיס.לאחר מכן, הוסף DPBS לנפח כולל של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את מתלה התאים ב -450 פעמים G וטמפרטורת החדר, למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט ובהתאם לגודל גלולת התא, השהה מחדש את כדורית תאי האפידרמיס בכ-10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס KSFM.בשיטת הצביעה הכחולה של טריפאן, ספרו את התאים במיקרוסקופ. לאחר מכן, לכל בקבוק תרבית של 75 סנטימטר מרובע, העבירו שמונה פעמים 10 לתאים השישיים, יחד עם 12 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס KSFM. לנער בעדינות את צלוחיות התרבות כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים.דגרו את הקרטינוציטים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 100% לחות ו-5% CO2. החליפו את המדיום לאחר יומיים ולאחר מכן שלוש פעמים בשבוע. כאשר התאים מגיעים למפגש של 70-80%, שמור את הכמות המתאימה של תמיסת EDTA של 0.05% טריפסין ל-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.הסר את המדיום מהתאים והוסף לתאים 4.5 מיליליטר לכל בקבוק תרבית של 75 סנטימטר מרובע של תמיסת EDTA של 0.05% טריפסין מחוממת מראש. לאחר הנחת בקבוק התרבית בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך כחמש דקות, בדוק במיקרוסקופ אם התאים החלו להשתחרר. כאשר כ-50% מהתאים השתחררו, הכה בעדינות בבקבוק התרבית ביד כדי לשחרר את התאים הנותרים.לאחר מכן, כדי לנטרל את הטריפסין, הוסף שישה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס RPMI 1640 בתוספת 2% FBS לבקבוק התרבית של 75 סנטימטר רבוע והעביר את תרחיף התא לצינורות של 50 מיליליטר. שוטפים את צלוחיות התרבות עם שלושה מיליליטר RPMI 1640 בתוספת 2% FBS ומוסיפים את המדיום לצינורות 50 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 450 פעמים G וטמפרטורת החדר.השתמש ב-10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס KSFM כדי להשעות מחדש את התאים הגלולים. לאחר מכן, ספרו והעבירו שלוש פעמים 10 לתאים השישיים לבקבוק תרבית של 150 סנטימטר מרובע, יחד עם 20 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס KSFM. יש לנער בעדינות את בקבוק התרבית כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים, לפני החזרת התאים לחממה.כאשר התרבית היא 80-90% מתכנסת, לאחר ניסיון והעברת התאים לצינורות של 50 מיליליטר, כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, שטפו את צלוחיות התרבית עם שישה מיליליטר RPMI 1640 בתוספת 2% FBS והוסיפו אותה לצינורות 50 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות למשך 10 דקות בטמפרטורה של 450 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו מדיום הקפאת תאים קרים כקרח.השעו מחדש את גלולת התא ב-KSFM בתוספת 10% DMSO. לאחר מכן, לאחר ספירת התאים, הקפיאו אותם בצפיפות של שישה כפול 10 עד שישי תאים למיליליטר, בשיטות שימור סטנדרטיות בהקפאה איטית. אחסן את הקרטינוציטים בחנקן נוזלי עד שהם מוכנים לשימוש.כפי שניתן לראות כאן, קרטינוציטים אנושיים בודדו ותורבתו, כפי שמודגם בסרטון זה ולאחר מכן עוררו עם סידן. תמונות אלה מציגות את השינויים המורפולוגיים עקב הוספת סידן ביום הראשון והשני, בהשוואה לתאים שטופלו בבקרה. בנוסף לשינויים מורפולוגיים, תוספת הסידן הביאה גם לעלייה בשעתוק של mRNA עבור סמן ההתמיינות Involucrin, פי 5.5 לאחר 24 שעות ופי 3.5 לאחר 48 שעות.בניסוי זה, קרטינוציטים מתורבתים עוררו עם IL-1 בטא לפרקי זמן שונים. כפי שניתן לראות על ידי Western Blotting, תוך חמש דקות, גירוי בטא IL-1 הוביל לזרחון הפעלה מהירה של p38 MAP קינאז מכיוון שלגירוי בטא של IL-1 לא הייתה השפעה על רמות החלבון הכוללות של p38 MAP קינאז. לאחר שעה, זרחון p38 MAP קינאז המושרה על ידי IL-1 beta חזר לרמות הבסיסיות.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי האפידרמיס האנושיים לחקור את תפקידם של קרטינוציטים בתגובות חיסוניות מולדות, כמו גם בהתפתחות העור. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולתרבית קרטינוציטים ראשוניים מעור אנושי בוגר, שיכול לשמש כמודל לחקר ביולוגיה עורית במבחנה.

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הדרך המהירה, החזקה של בידוד קיימא גזע בוגרים לתאי האפיתל של העור האנושי הוא תיאר. השיטה משתמשת עיכול אנזימטי של מטריקס הקולגן בעור, ואחריו מריטת זקיקי השיער ובידוד של המתלים תא בודד או שברי רקמה תרבית תאים.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

סרטון זה מתאר את בידודם של קרטינוציטים – התאים הבולטים ביותר בשכבת האפידרמיס של העור האנושי, על ידי שימוש בשילוב של עיכול אנזימטי ושיטות שיבוש מכני. שיטה זו מסייעת בצמיחה מועדפת של קרטינוציטים על פני סוגי תאי עור אחרים באמצעות מדיום גידול סלקטיבי.

בידוד קרטינוציטים בעור האדם: שיטה לתרבית קרטינוציטים ראשוניים מדגימות עור

סרטון זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור רטרו-וירוס רקומביננטי רקומביננטי של קרטינוציטים אנושיים מהונדסים גנטית. שיטה זו יכולה לשמש כדי לתפעל ביטוי גנים בקרטינוציטים.

שינוי גנטי של קרטינוציטים אנושיים ראשוניים: שיטה למניפולציה גנטית של קרטינוציטים באמצעות רטרו-וירוסים רקומביננטיים

כתב יד זה מספק נוהל שלב אחר שלב לגזירה ותחזוקה של קרטינוציטים אנושיים משיער מרוט ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ללא אינטגרציה (hiPSCs) על ידי וקטורים אפיזומליים.

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מקיף ומפורט כיצד ליצור עור אורגנוטיפי אנושי מהונדס גנטית מקרטינוציטים אפידרמליים ודרמיס אנושי נטול חיוניות.

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

אפידרמיס keratinocytes טופס מחסום עור פונקציונלי ממוקמים בקו הקדמי של ההגנה המארחת נגד עלבונות סביבתיים חיצוניים. כאן אנו מתארים שיטות לבידוד ואת התרבות העיקרית של keratinocytes אפידרמיס עור ניאונטלי ומבוגר העכבר, אינדוקציה של בידול מסוף ותגובה דלקתית מופעלת UVB מ keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבודד ביעילות keratinocytes האדם העיקרי של רקמות העור למבוגרים. שיטה זו מפשטת את הפרוצדורה המקובלת על-ידי שימוש Y-27632 מעכב את רוק המדיום חיסון להפריד באופן ספונטני תאים אפידרמיס מתאי עורי.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לטיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי מחדש באופן ניתן לשחזור וחזק. בנוסף, הוא מאפיין את הקשר המבני-פונקציה של מודל מחסום האפידרמיס. התגובות הביולוגיות של האפידרמיס האנושי המחודש על גירויים proinflammatory מוצגים גם.

טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיפוח שיטתי של כדורי אפידרמיס בתרבות השעיה תלת-ממדית. פרוטוקול זה כולל יישומים נרחבים לשימוש במגוון סוגי רקמות אפיתל ולדוגמנות של מספר מחלות ותנאים אנושיים.

הקמת מערכת תרבית אפידרמיס כדורית בעלת תפוקה גבוהה למודל פלסטיות תאי גזע קרטינוציטים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבות של קרטינוציטים אוראליים הנגזרים מחך העכבר הבוגר. כמו כן, דווח על שיטת הערכה באמצעות חיסונים.

בידוד ותרבות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מחך העכבר למבוגרים

פרוטוקול זה מתאר את התרבית של קרטינוציטים טריים שהושגו (מעבר 0) לשימוש בהדמיית תאים חיים.

יצירת תרביות ראשוניות להדמיית תאים חיים של קרטינוציטים

למדו שיטה לבידוד וגידול קרטינוציטים אנושיים ראשוניים מעור מבוגרים לחקר ביולוגיה עורית ומחלות דלקתיות. טכניקה זו מאפשרת מחקר מבוקר של תאי עור אנושיים במעבדה.

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

גלה סרטונים נוספים