דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

העור האנושי פועל כשורה הראשונה של הגנה מפני הסביבה החיצונית. אנו מציגים שיטה לבודד את ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. Keratinocytes מבודדים אלה שימושיים רבים setups ניסיוני, הם מודל המתאים מאוד ללמוד המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית במבחנה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר קרטינוציטים אנושיים ראשוניים שיכולים לשמש כמודל לחקר ביולוגיה עורית במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי האפידרמיס, כגון כיצד מווסתת התמיינות קרטינוציטים אנושיים או כמודל לחקר מחלות עור דלקתיות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן לבודד קרטינוציטים אנושיים ראשוניים באופן קונבנציונלי מעור בוגר של גברים ונשים כאחד ויכולים לכלול עור של אנשים בכל גיל מעל גיל 18.

תדגים את ההליך אנט בלק רסמוסן, טכנאית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הכינו תמיסה של 50 מיליליטר של 0.25% טריפסין ו-0.1% גלוקוז ב-DPBS. לאחר מכן, מערבבים ומסננים מעקרים את התמיסה.

הכן 10 מיליליטר של RPMI 1640 בתוספת 2% FBS, 50 מיליליטר DPBS ומדיום ללא סרום קרטינוציטים, או KSFM. הוסף תוספי KSFM ו-250 מיקרוליטר גנטמיצין ל-500 מיליליטר KSFM. לאחר מכן, יש לחמם מראש את התמיסות ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

אסוף דגימות עור בגודל 10 סנטימטר על 15 סנטימטר ממתנדבים בוגרים בריאים העוברים ניתוחים פלסטיים. שמור על העור קריר על ידי הובלת דגימות העור בקופסת קלקר המכילה אלמנט קירור. במידת הצורך, אחסן את דגימת העור בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

בעזרת מספריים, אזמלים ומלקחיים מעוקרים, הסר שומן מתחת לחלק העור. לאחר מכן, בעזרת מחטים, חגרו את חלק העור על כיסוי סטרילי על גבי צלחת. בעזרת כרית גזה יבשה ומעוקרת, נקו את העור.

לאחר מכן, המשיכו עם 70% אתנול על פד גזה מעוקר. לאחר מכן, בעזרת פלנר לכף הרגל, חתכו את שכבת האפידרמיס העליונה של חלק העור והעבירו אותה לצלחת פטרי של תשעה סנטימטרים. לאחר מכן, הוסף מיד 25 מיליליטר מתמיסת הגלוקוז DPBS טריפסין שהוכנה בעבר לצלחת הפטרי.

דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעזרת פיפטה, הסר את תמיסת הגלוקוז DPBS טריפסין מצלחת הפטרי והוסף 10 מיליליטר RPMI 1640 בתוספת 2% FBS כדי לנטרל את הטריפסין. כעת, בעזרת שני מלקחיים, שחרר את תאי האפידרמיס לתוך המדיום על ידי גירוד עדין וערבוב הן של תא האפידרמיס והן של תא העור של חלקי העור.

מסננים את מתלה תאי האפידרמיס דרך מסנן מתכת ואוספים את המסנן לצינור של 50 מיליליטר. הוסף את חלקי העור הנותרים לשפופרת של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר RPMI 1640 ללא FBS ומערבולת למשך 10 שניות. סנן את המתלה הזה דרך מסנן המתכת לתוך צינור של 50 מיליליטר המכיל את תרחיף תאי האפידרמיס.

לאחר מכן, הוסף DPBS לנפח כולל של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את מתלה התאים ב -450 פעמים G וטמפרטורת החדר, למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט ובהתאם לגודל גלולת התא, השהה מחדש את כדורית תאי האפידרמיס בכ-10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס KSFM.

בשיטת הצביעה הכחולה של טריפאן, ספרו את התאים במיקרוסקופ. לאחר מכן, לכל בקבוק תרבית של 75 סנטימטר מרובע, העבירו שמונה פעמים 10 לתאים השישיים, יחד עם 12 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס KSFM. לנער בעדינות את צלוחיות התרבות כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים.

דגרו את הקרטינוציטים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 100% לחות ו-5% CO2. החליפו את המדיום לאחר יומיים ולאחר מכן שלוש פעמים בשבוע. כאשר התאים מגיעים למפגש של 70-80%, שמור את הכמות המתאימה של תמיסת EDTA של 0.05% טריפסין ל-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.

הסר את המדיום מהתאים והוסף לתאים 4.5 מיליליטר לכל בקבוק תרבית של 75 סנטימטר מרובע של תמיסת EDTA של 0.05% טריפסין מחוממת מראש. לאחר הנחת בקבוק התרבית בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך כחמש דקות, בדוק במיקרוסקופ אם התאים החלו להשתחרר. כאשר כ-50% מהתאים השתחררו, הכה בעדינות בבקבוק התרבית ביד כדי לשחרר את התאים הנותרים.

לאחר מכן, כדי לנטרל את הטריפסין, הוסף שישה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס RPMI 1640 בתוספת 2% FBS לבקבוק התרבית של 75 סנטימטר רבוע והעביר את תרחיף התא לצינורות של 50 מיליליטר. שוטפים את צלוחיות התרבות עם שלושה מיליליטר RPMI 1640 בתוספת 2% FBS ומוסיפים את המדיום לצינורות 50 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 450 פעמים G וטמפרטורת החדר.

השתמש ב-10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס KSFM כדי להשעות מחדש את התאים הגלולים. לאחר מכן, ספרו והעבירו שלוש פעמים 10 לתאים השישיים לבקבוק תרבית של 150 סנטימטר מרובע, יחד עם 20 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס KSFM. יש לנער בעדינות את בקבוק התרבית כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים, לפני החזרת התאים לחממה.

כאשר התרבית היא 80-90% מתכנסת, לאחר ניסיון והעברת התאים לצינורות של 50 מיליליטר, כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, שטפו את צלוחיות התרבית עם שישה מיליליטר RPMI 1640 בתוספת 2% FBS והוסיפו אותה לצינורות 50 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות למשך 10 דקות בטמפרטורה של 450 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו מדיום הקפאת תאים קרים כקרח.

השעו מחדש את גלולת התא ב-KSFM בתוספת 10% DMSO. לאחר מכן, לאחר ספירת התאים, הקפיאו אותם בצפיפות של שישה כפול 10 עד שישי תאים למיליליטר, בשיטות שימור סטנדרטיות בהקפאה איטית. אחסן את הקרטינוציטים בחנקן נוזלי עד שהם מוכנים לשימוש.

כפי שניתן לראות כאן, קרטינוציטים אנושיים בודדו ותורבתו, כפי שמודגם בסרטון זה ולאחר מכן עוררו עם סידן. תמונות אלה מציגות את השינויים המורפולוגיים עקב הוספת סידן ביום הראשון והשני, בהשוואה לתאים שטופלו בבקרה. בנוסף לשינויים מורפולוגיים, תוספת הסידן הביאה גם לעלייה בשעתוק של mRNA עבור סמן ההתמיינות Involucrin, פי 5.5 לאחר 24 שעות ופי 3.5 לאחר 48 שעות.

בניסוי זה, קרטינוציטים מתורבתים עוררו עם IL-1 בטא לפרקי זמן שונים. כפי שניתן לראות על ידי Western Blotting, תוך חמש דקות, גירוי בטא IL-1 הוביל לזרחון הפעלה מהירה של p38 MAP קינאז מכיוון שלגירוי בטא של IL-1 לא הייתה השפעה על רמות החלבון הכוללות של p38 MAP קינאז. לאחר שעה, זרחון p38 MAP קינאז המושרה על ידי IL-1 beta חזר לרמות הבסיסיות.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי האפידרמיס האנושיים לחקור את תפקידם של קרטינוציטים בתגובות חיסוניות מולדות, כמו גם בהתפתחות העור. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולתרבית קרטינוציטים ראשוניים מעור אנושי בוגר, שיכול לשמש כמודל לחקר ביולוגיה עורית במבחנה.