תפוקה גבוהה, נחישות מוחלטת של התוכן של חלבון שנבחר ברמות רקמות באמצעות נקודה כמותיים כתם ניתוח (QDB)
21 באוגוסט 2018
כאן נדגים הליך מפורט של ניתוח חשופה נקודה כמותית (QDB) על-ידי קביעת התכנים מוחלטת של חלבון יישוב, מיצוי אקטין חלבון, כמו gelsolin (CAPG), ברקמות עכבר אחר שלושה. נדגים עם תפוקה גבוהה, טכניקת immunoblot נוח, כמותיים סמן אימות ברמת הסלולר ורקמות.
שיטה זו יכולה להיקרא ELISA ברמת הרקמה כדי להרחיק את עצמה מהכימות הכמותי למחצה היחסי המסורתי של תכולת החלבון ברמת התא והרקמה, שהיא הנורמה במעבדת המחקר ובתחום האבחון הקליני כיום. ניתן לתאר את היתרונות העיקריים של טכניקה זו בשלוש מילים, תפוקה גבוהה, כמותית ומוחלטת. אם היינו מוסיפים עוד מילה, זה היה פשוט.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לתחום הפרוטאומיקה ואילו אימות הסמנים הביולוגיים יכול להתבצע בפורמט תפוקה גבוהה. לשיטה זו יש יישומים נרחבים בכל המחקר והשדה הקליני. כימות כמות החלבון ברמת התא והרקמה עדיין פרימיטיבי כיום.
באופן כללי, אנשים חדשים בשיטה זו לא יתמודדו עם בעיה ללמוד טכניקה זו והיא די בסיסית ודורשת מיומנויות מעבדה מינימליות לביצוע. אנו נרגשים להדגים את האמינות, הפשטות והדיוק של הטכניקה באמצעות מודל החיות. ניתן להכין את הדגימות בכל שיטה מסורתית להכנת דגימה באמצעות כל מאגרי ליזה הנפוצים במעבדת המחקר עם או בלי חומר ניקוי כמו MP40 או טריטון X.In במקרה שלנו, אנו משתמשים במאגר ליזה Triton X.
מניחים פרוסת רקמה של חמישה עד 100 מיליגרם בשפופרת של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר ליזה בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז. לאחר מכן, הומוגניזציה של הרקמה עם הומוגנייזר למשך דקה אחת על קרח.
לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה למשך 10 דקות ב 8, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס. אספו את הסופרנטנט לצינורות חדשים והוציאו מיקרוליטר אחד למדידת כמות החלבון הכוללת בליזאט חלבון באמצעות ערכת קביעת חלבון כגון בדיקת BCA. דגירה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן מדוד את הספיגה ב-562 ננומטר על קורא מיקרו-פלטות.
בשלב זה, באמצעות חלבון רקומביננטי עם ריכוז ידוע כסטנדרט, יש לדלל את החלבון לריכוז של 12,000 פיקוגרם למיקרוליטר כתמיסת מלאי. בינתיים, יש לדלל את הדגימה המוכנה לארבעה מיקרוגרם למיקרוליטר. כדי להשיג תוצאות אמינות יותר, אנו ממליצים להשתמש בתערובת של ליזטים לדוגמה כדי למנוע כל הבדל בין דגימות בודדות.
יש לדלל באופן סדרתי הן את החלבון הסטנדרטי והן את הדגימות המוכנות למחקר מינון טיפוסי. BSA הוסף כדי להבטיח כמויות שוות בערך של החלבון שנטען עבור כל דגימה. לאחר מכן, מערבבים 10 מיקרוליטר של החלבון הסטנדרטי המדולל סדרתי או ליזטים דגימה עם 10 מיקרוליטר של מאגר טעינה פי 2.
לאחר מכן מחממים את התערובת בחום של 85 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בהליך זה, הנח קופסת קצה פיפטה ריקה מתחת ללוחית ה-QDB כדי למנוע מהחלק התחתון של הצלחת לגעת במשטח השולחן. טען עד שני מיקרוליטר מהדגימה למרכז הממברנה בתחתית יחידה בודדת של צלחת ה- QDB.
לעולם אל תאפשר לתחתית לוחית ה-QDB לגעת במשטח כלשהו בזמן הטעינה ואל תעמיס יותר מדי לבאר אישית. מניסיוננו, לא יותר מארבעה מיקרוליטר לבאר. לאחר מכן, השאירו את צלחת ה- QDB העמוסה למשך שעה בטמפרטורת החדר או השאירו את המטען בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחלל מאוורר היטב.
כדי לחסום את הצלחת, טבלו את צלחת ה-QDB במאגר ההעברה ונערו אותה בעדינות למשך 10 שניות. לאחר מכן, שטפו את צלחת ה-QDB בעדינות עם TBST שלוש פעמים ולאחר מכן שטפו את הצלחת במשך חמש דקות ב-TBST תחת ניעור מתמיד. לאחר מכן, חסום את לוחית ה- QDB עם מאגר חוסם למשך שעה תחת טלטול מתמיד.
כעת, יש לדלל את הנוגדן העיקרי במאגר החוסם בריכוז נבחר ולהוסיף 100 מיקרוליטר ממנו לכל באר בודדת של צלחת רגילה של 96 בארות. הכנס את צלחת ה- QDB לצלחת 96 הבארות ודגר את הצלחות המשולבות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס תחת טלטול מתמיד. לאחר מכן, יש לשטוף את הצלחת בעדינות עם TBST שלוש פעמים לפני שהיא נשטפת עם TBST שלוש פעמים בכל פעם למשך חמש דקות תחת טלטול מתמיד.
לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדן המשני במאגר החוסם בריכוז הנבחר ולהכניס 100 מיקרוליטר לכל באר של צלחת של 96 בארות. לאחר מכן דגרו את צלחת ה-QDB בתוך הצלחת העמוסה של 96 בארות למשך שעה בטמפרטורת החדר תחת טלטול מתמיד. שטפו את צלחת ה-QDB בעדינות שלוש פעמים עם TBST ולאחר מכן שטפו את הצלחת שלוש פעמים חמש דקות כל אחת עם TBST תחת ניעור מתמיד.
לצורך כימות יש להכין מצע ECL ולחלק אותו לצלחת של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר לבאר. לאחר מכן הכנס את לוחית ה-QDB לתוך צלחת 96 הבארות למשך שתי דקות תחת ניעור מתמיד. לאחר מכן, הסר את צלחת ה-QDB מצלחת 96 הבארות ונער קצרות כדי להסיר את עודפי הנוזלים.
לאחר מכן, הניחו את הצלחת על צלחת מיקרוטיטר לבנה. לאחר מכן, הפעל את קורא המיקרו-פלטות ובחר צלחת עם מכסה בממשק המשתמש לפני הנחת הלוחות המשולבים בתוך קורא המיקרו-פלטות לצורך כימות. הקפד לבחור את הצלחת עם כיסוי כדי למנוע טעויות.
איור זה מראה את הספציפיות של נוגדן נגד CAPG של ארנב באמצעות ליזטים של רקמת עכבר שהוכנו מטחול, לב, שרירים, כליות, כבד וערמונית עם ניתוח כתמים מערביים. הוגדר הטווח הליניארי של ניתוח QDB של נוגדנים נגד CAPG של ארנב באמצעות ליזטים שהוכנו מערמונית, כליות, טחול ושימוש בתקן חלבון CAPG רקומביננטי מטוהר. התוצאות היו ממוצע של שלוש פעמים.
ומוצגת כאן הקביעה המוחלטת של רמות CAPG בליזטים שהוכנו מכליות עכבר, טחול וערמונית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע עד 24 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בנוגדנים ספציפיים שנקבעו מראש לכל ההליך.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח ביוסטטיסטיקה על מנת לענות על שאלות נוספות הניתנות להשגה רק באמצעות מדידה מוחלטת של תכולת חלבון בודדת ברמת התא או הרקמה. מאז פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחקר הפרוטאומיקה לחקור את הקשר המשוער של סמנים ביולוגיים של חלבונים עם מחלות שונות ברמת האוכלוסייה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניתוח QDB בפורמט תפוקה גבוהה.
אל תשכח שעבודה עם רקמות אנושיות או בעלי חיים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בכפפות בעת ביצוע הליך זה.
סקירה
מאמר זה מציג שיטת ניתוח dot blot כמותי (QDB) לקביעת התוכן המוחלט של חלבון הקאפינג אקטין, ג'לסולין-לייק (CAPG), ברקמות עכבר שונות. הטכניקה מתאפיינת בתפוקה גבוהה, פשטות ודיוק כמותי, מה שהופך אותה למתאימה לאימות סמני חיוניות.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביוכימיה
- פרוטאומיקה
רקע
- שיטות מסורתיות לכימות חלבונים הן לעתים קרובות חצי-כמותיות.
- יש צורך בטכניקות בעלות תפוקה גבוהה לאימות יעיל של סמני חיוניות.
- QDB מציע חלופה אמינה למדידת חלבונים מוחלטת.
- פרוטוקולים פשוטים הופכים את זה לנגיש לחוקרים עם כישורי מעבדה מינימליים.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה בעלת תפוקה גבוהה לכימות מוחלט של חלבונים.
- לאמת את הטכניקה באמצעות CAPG כסמן חיוניות ברקמות עכבר.
- לספק פרוטוקול פשוט לחוקרים בתחום.
שיטות ששימשו
- הכנת דגימה באמצעות מאגרי פירוק מסורתיים.
- הומוגניזציה וצנטריפוגה של דגימות רקמות.
- שימוש בחלבון רקומביננטי סטנדרטי לכימות.
- דלילה סדרתית וטעינת דגימות על צלחות QDB.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של רמות CAPG ברקמות עכבר.
- טווח ליניארי מוכח של ניתוח QDB עם ליזטים רקמות שונים.
- התוצאות הראו אמינות ודיוק ברחבי דגימות מרובות.
- ניתן להשלים את הטכניקה תוך מספר שעות כאשר היא מבוצעת נכון.
מסקנות
- QDB הוא כלי חשוב לכימות מוחלט של חלבונים.
- השיטה היא פשוטה וניתנת לשליטה מהירה על ידי משתמשים חדשים.
- יש לה יישומים רחבים הן במחקר והן בסביבות קליניות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative dot blot analysis (QDB) addresses a critical gap in proteomics by enabling absolute, high-throughput protein quantification at the tissue level, which is essential for biomarker validation and pathway verification. The method provides reliable, reproducible data that supports cross-study comparison and large-scale analysis, reducing mechanistic ambiguity in target validation. Its simplicity and minimal skill requirements facilitate enterprise-wide adoption across discovery and translational workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables absolute quantification of target proteins like CAPG, supporting therapeutic hypothesis interrogation and biological de-risking.
- Operational Value: Uses simple lysis buffers and standard lab equipment, requiring minimal training for consistent execution.
- Predictive Value: Generates linear range data from recombinant standards, improving confidence in target engagement and pathway modulation assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, absolute protein measurements that enable reliable compound screening and dose-response analysis.
- Operational Value: Compatible with 96-well plate formats and microplate readers, supporting high-throughput screening scalability.
- Reuse Potential: Establishes a standardized, transferable assay platform for longitudinal protein monitoring across sample sets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical stages by providing tissue-level protein data relevant to disease models.
- Risk Mitigation: Supports biomarker validation with absolute values, enhancing confidence in target-disease relationships.
- Continuity: Enables consistent protein tracking from early discovery through preclinical validation using the same quantitative method.
Pipeline & Workflow Integration
QDB fits within the discovery continuum by providing absolute protein quantification that informs target validation, enables assay-ready screening, and supports translational continuity through reproducible, quantitative outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through absolute measurement of target protein levels in disease-relevant tissues.
- Screening: Produces standardized, quantitative readouts compatible with high-throughput compound evaluation and hit confirmation.
- Analytics: Generates absolute concentration data (e.g., pg/µL) that allows direct comparison across samples, conditions, and studies.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by providing tissue-level protein data that correlates with phenotypic or clinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable, platform-agnostic capability for protein quantification across projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating semi-quantitative variability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized protocols, blocking, washing, and detection steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing absolute protein data for target prioritization and portfolio triage.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on verified target expression levels in relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoblotting, antibody validation, and protein standard handling.
- Depends on access to microplate readers, incubators, and standard lysis buffers (e.g., Triton X).
- Necessitates cross-team standardization of antibody dilution, loading volumes, and incubation times.
- Adaptation across model systems depends on tissue-specific lysis efficiency and antigen accessibility.
- Practical limitations include the need for validated antibodies and optimization of blocking and washing steps to minimize background.
