היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans
1 בינואר 2018
פרוטוקול זה מתאר כיצד ללמוד תהליכים תאיים במהלך ההמרה גורל התא ב Caenorhabditis elegans ויוו. באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר ביטוי יזם מונחה חום-שוק של נוירון בתדר גורל שעתוק הגורם צ'ה-1 מציאה RNAi בתיווך דלדול של כרומטין מווסת גורם לין-53 נבט לתא נוירון התכנות יכול להיות שנצפו אין ויוו.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום להמרה של תאי נבט לנוירונים ב-C.elegans. שיטה זו יכולה לסייע בחקירת ההשלכות של תהליכים ביולוגיים, כגון מסלולי איתות או אפיגנטיקה בוויסות תכנות מחדש של גורל תאי. היתרון העיקרי של השיטה המתוארת בסרטון זה הוא שאצל בעלי חיים ניתן לאתגר תאי נבט על ידי ביטוי יתר של גורם שעתוק מעורר גורל.
במקביל, ניתן לבצע סריקה גנטית כגון מסך RNAi על מנת לזהות גורמים חדשים המעורבים בוויסות תכנות מחדש של התאים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול רגנרטיבי. מכיוון שניתן להשתמש בשיטה זו in vivo כדי לחקור תכנות מחדש של תאים בתנאים התפתחותיים וסביבתיים שונים.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד את שלבי התכנות מחדש. מכיוון שפנוטיפ ההמרה של תא נבט לנוירון, עם דלדול לין-53, מתרחש רק בתנאים מבוקרים בקפידה. עבור לוחות RNAi, טען צלחות של שישה סנטימטרים עם אגר NGM המכיל IPTG וקרבניצילין.
תן להם להתייבש במשך 24 עד 48 שעות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן העבירו אותם לארבע מעלות צלזיוס למשך עד 14 יום. לאחר מכן, פס צלחות סלקטיביות המכילות קרבניצילין וטטרציקלין עם שיבוטי חיידקי RNAi עם פלסמיד L4440 הנושא את הגן lin-53.
השתמשו בתבנית פסים תלת-פאזית, והקפידו להוסיף פקד וקטורי ריק. לאחר מכן, גדלו את הצלחות למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, בחרו לפחות שלוש מושבות בודדות, וחסנו כל אחת מהן לתוך צינור תרבית נפרד עם שני מיליליטר LB, בתוספת קרבניצילין, אך לא טטרציקלין.
תכננו שיהיו שלוש תרביות בריאות לכל מצב. לאחר מכן, גדלו את התרביות בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עד שהן מגיעות לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.6 עד 0.8. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר מכל תרבית חיידקים לצלחת RNAi של שישה סנטימטרים.
דגרו את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך. פרוטוקול זה מותאם לתולעים מזן BAT28 שנשמרות ב-15 מעלות צלזיוס, בהן הטרנסגנים יציבים ביותר. פרטים על הגנטיקה של הזן מסופקים בטקסט.
סנכרון הגיל של התולעים הוא קריטי. השתמש בטכניקת ההלבנה. שטפו צלחות אגר NGM בגודל שישה סנטימטרים המכילות בוגרים וביצים באמצעות 800 מיקרוליטר M9. לאחר מכן גלול את התולעים על ידי צנטריפוגה, והסר את הסופרנטנט.
לאחר מכן, הוסף 1/2 עד מיליליטר אחד של תמיסת הלבנה לתולעים. ותוך כדי צפייה בתולעים תחת סטריאוסקופ, נערו את הצינור עד שהתולעים הבוגרות מתחילות להיפתח, ואז אספו את הביצים. כעת, הפרד את הפסולת מהביצים.
ראשית צנטריפוגה את הצינור, והשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן שטפו את כדור הטישו עם 800 מיקרוליטר M9 שלוש פעמים. הקפד להשתמש בצנטריפוגה כדי לאסוף את הרקמות בין השטיפות.
כעת, העבירו את הביצים הנקיות לצלחות NGM טריות עם זרעי חיידקי OP50. בדוק בקצרה אם יש בידוד מוצלח של עוברים והעברתם לצלחות NGM. גדל את בעלי החיים ב-15 מעלות צלזיוס.
כדי להשיג המרה מתאי נבט לנוירון עם דלדול לין-53, הדלדול צריך להתחיל בדור ההורים. כדי לרוקן את לין-53, הכניסו חיות L4 ל-RNAi. העברה ידנית של 50 תולעי L4 בכל שכפול ללוחית NGM RNAi ללא חיידקים.
השתמש בחוט פלטינה. ניתן לזהות תולעי L4 על ידי כתם לבן בערך באמצע הדרך לאורך צידי הגחון שלהן. כעת, דגרו על התולעים בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס בחושך למשך כשבעה ימים.
ה-IPTG רגיש לאור. כאשר צאצאי F1 מגיעים לשלבים L3 ו-L4, הפרד אותם מחיות ההורים הגדולות והעבות יותר. בשלב זה, סנן את ה-F1 עבור פנוטיפ הפות הבולט, מה שמצביע על כך שה-RNAi נגד lin-53 הצליח.
פעילות ה-RNAi יכולה גם לגרום לקטלניות, שעולה מעל 15 מעלות צלזיוס. כדי להפעיל את che-1, ולגרום להמרה של תא נבט לנוירון בצאצאי F1, חשמלו את התולעים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך. השתמש באינקובטור מאוורר, מכיוון שהוא מאפשר הלם חום יעיל יותר.
לאחר מכת החום, דגרו צלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך הלילה בחושך. חשוב להימנע מגרימת ביטוי יתר של che-1 על ידי הלם חום לפני שבעלי החיים מגיעים לאמצע שלב L3. זה יכול להוביל לביטוי של חלבון che-1 ברקמות לא ממוקדות.
למחרת, הקימו מקור אור פלואורסצנטי ומסנן GFP כדי לבחון את בעלי החיים עבור פלואורסצנטיות שמקורה בטרנסגנים באזור אמצע הגוף. כדי להעריך את חדירת הפנוטיפ, מצא את היחס בין בעלי חיים הפולטים אות פלואורסצנטי. בדרך כלל, בסביבות 30% יציגו אות GFP נפרד.
לשם השוואה, בבעלי חיים הנושאים את הווקטור הריק RNAi, אפילו אות מפוזר בקו הנבט אינו נראה ביותר מ-5% מהאוכלוסייה. בעלי חיים F1 המציגים את הפנוטיפ הבולט של הפות ממחישים יישום מוצלח של lin-53 RNAi. בבעלי חיים אלה, המרה של תאי נבט לתאים דמויי נוירונים ASE עם השראת הלם חום של che-1 היא נפוצה.
בחינה מדוקדקת מגלה הקרנות דמויות נוירונים האופייניות לנוירונים מתאי קו הנבט. לעומת זאת, בקרות וקטוריות ריקות הראו ביטוי מינימלי של GFP, שהיה לכל היותר מפוזר. תאי הנבט בבעלי חיים אלה היו חסרים תכונות דמויות נוירונים.
כאשר החיות היו צעירות מדי בזמן השראת ביטוי יתר של che-1, הן הפגינו לעתים קרובות ביטוי טרנסגן חוץ רחמי באזורים אחרים בגוף, כגון הפות המתפתח. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לתכנן בקפידה ולבצע את הניסויים באמצעות תולעים חיות במטרה לתכנת מחדש תאי נבט לתאי עצב. השיטה המתוארת כאן בסרטון זה תאפשר לכם כעת לחקור את ההשלכות של מספר גורמים שונים בוויסות של תכנות מחדש תאי.
לאחר שליטה, ניתן לבצע הליך זה תוך 10 ימים. בזמן הניסוי, חשוב לביים בזהירות את החיות לפני השראת התכנות מחדש, ולשמור על זן BAT28 ב-15 מעלות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו RNAi כפול על מנת לענות על שאלות נוספות כמו, מהם המנגנונים הבסיסיים הממלאים תפקיד במהלך המרות גורל התא?
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לחקר תהליכים תאיים במהלך המרת תאי נבט לנוירונים ב-Caenorhabditis elegans in vivo. באמצעות שימוש בבעלי חיים טרנסגניים, חוקרים יכולים לצפות בהשפעות של ביטוי יתר של גורם השעתוק CHE-1, המשרה גורל נוירוני, ודילול של הגורם LIN-53 המווסת את הכרומטין באמצעות RNA interference.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- ביולוגיה של ההתפתחות
רקע
- הבנת תכנון מחדש של גורל תאי היא חיונית להשגת תובנות בביולוגיה התפתחותית.
- מודלים טרנסגניים מאפשרים תצפית בזמן אמת על תהליכים תאיים.
- LIN-53 ידוע כמי שממלא תפקיד בבקרת כרומטין ובזהות תאית.
- CHE-1 הוא גורם שעתוק שיכול להשרות גורל עצבי.
מטרת המחקר
- לבדיקת המנגנונים העומדים בבסיס המרת תאי נבט לנוירונים.
- לחקר תפקידן של מסלולי איתות וגורמים אפיגנטיים בתכנות מחדש של תאים.
- פיתוח שיטה שניתן ליישם במחקר בתחום הטיפול הרגנרטיבי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- C. elegans טרנסגני המבטא את CHE-1 תחת פרומוטור של הלם חום.
- השתקת RNA (RNA interference) כדי להוביל לדלדול של LIN-53 בתאי נבט.
- סנכרון גיל של תולעים באמצעות טכניקת הלבנה.
- טיפול בהלם חום להשראת ביטוי של CHE-1 בשלבים התפתחותיים ספציפיים.
תוצאות עיקריות
- נצפתה המרה מוצלחת של תאי נבט לתאים דמויי-נוירונים בעקבות דלל של LIN-53.
- בקירוב 30% מצאצאי ה-F1 הראו אות פלואורסצנטי המעיד על ביטוי מוצלח של הגן התעתיק.
- קבוצות ביקורת עם RNAi של וקטור ריק הראו פלואורסצנציה מינימלית, מה שמאשש את ספציפיות השיטה.
- ניתוח פנוטיפי חשף שלוחות דמויות-נוירונים בתאים שהומרו.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה מהימנה לחקר תכנות מחדש של תאים in vivo.
- הממצאים תורמים להבנת הוויסות של זהות תאית וליישומים טיפוליים פוטנציאליים.
- שליטה בטכניקה זו עשויה להקל על מחקרים נוספים של גורמי תכנות מחדש תאיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תכנות מחדש של תאי נבט לנוירונים ב-C. elegans מאפשר חקירה ישירה של מנגנוי זהות תאית ובקרה אפיגנטית במערכת חיה. גישה זו תומכת בתיקוף יעדים ברמת ביטחון גבוהה ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור מסלולים המעורבים בהחלטות על גורל התא. השיטה ממוקמת באופן אסטרטגי עבור צוותי גילוי בשלבים מוקדמים השואפים לנתח רשתות רגולטוריות השומרות על זהות התא ומספקות מידע לאסטרטגיות רגנרטיביות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף תפקודי של ווסתי כרומטין וגורמי שעתוק בתהליך של תכנות מחדש של גורל התא.
- תומך בסריקה גנטית לזיהוי מודולטורים חדשים של שמירת זהות תאית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד ההשפעה של הפרעות גניות ספציפיות על תוצאות התכנות מחדש.
- מספק הקשר של בעל חיים חי להבהרה של מסלולים ובדיקת השערות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקיים מערכת in vivo חסונה לסריקות גנטיות מבוססות RNAi המכוונות לגורמי תכנות מחדש (reprogramming factors).
- מספק מדדים כמותיים מבוססי פלואורסצנציה לצורך סטנדרטיזציה והדירות של הבדיקה.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה (scalable) של תפקוד גנים תחת תנאים שונים ובשלבים התפתחותיים מגוונים.
- מכין מערכות ביולוגיות מתוקתקות לסריקה של תרכובות או משנים גנטיים (genetic modifiers) בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתכתב עם שאלות רלוונטיות למחלה בנושא פלסטיות תאית ופוטנציאל רגנרטיבי.
- מספק רצף מממצאים גנטיים בשלב הגילוי ועד לפיתוח מודל פרה-קליני.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של מטרות המעורבות בבקרת גורל תא.
- מציע תובנות ניבויות לגבי ההיתכנות של אסטרטגיות טיפוליות מבוססות תכנות מחדש.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משולבת בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מובילים (lead identification), ומאפשרת סריקות גנטיות מונחות-השערה ותיקוף תפקודי של גורמי תכנות מחדש.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערת האפס עבור תפקוד גנים בהמרה של גורל תאי.
- סריקה: מספק פלטי פלואורסצנציה כמותיים וניתנים לשחזור להשוואה בין תנאים שונים.
- אנליטיקה: מספקת נתונים סטטיסטיים על חדירות (penetrance) לצורך קבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go).
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים מכניסטיים לפיתוח מודלים פרה-קליניים כאשר הם תואמים למסלולים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה לשימוש חוזר עבור חקירה גנטית ואפיגנטית איטרטיבית במגוון מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באימות מטרות ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי גורל תאים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה לתכנות מחדש in vivo לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות מוקדמות של המשכה או הפסקה (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי הפחתת סיכונים בהשערות ביולוגיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות של מטרות ומסלולים לקידום, מותאם לסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגנטיקה של C. elegans, RNAi וטיפול בזנים טרנסגניים.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ולמכשור מבוקר להשראת הלם חום (heat-shock).
- נחוץ סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לגבי שלבי התפתחות החיות ופרוטוקולי אינדוקציה.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה ותיקוף של הפרוטוקול.
- חדירות הפנוטיפ (phenotype penetrance) והסגוליות שלו רגישות לעיתוי התפתחותי ולתנאים סביבתיים.
