זיהוי מולקולרי באתר של קרקע בתפו Phytopathogens באמצעות מערכת ה-PCR נייד בזמן אמת
23 בפברואר 2018
זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים באתר, במיוחד קרקע בתפו פתוגנים צמח, הוא חיוני כדי למנוע התפשטות של מחלות בתחום עיצוב והפקת inoculum. השיטה שפותחה כאן באמצעות מערכת זיהוי PCR נייד בזמן אמת מאפשר האבחון באתר בתנאי שדה.
היי שמי ג'וזף דה-שילדס, אני במחלקה לפתולוגיה של צמחים באוניברסיטת וושינגטון סטייט והיום אני אראה לכם פרוטוקול זיהוי באתר לאיתור מחלות המועברות בקרקע באדמה. אבחון באתר של מחלות צמחים בשטח הוא חיוני לניהול יעיל של מחלות ובסופו של דבר יכול להפחית את ההתפשטות המשנית של פתוגנים בשטח. פתוגנים הנישאים בקרקע קשים במיוחד לאבחון בשל סביבות הקרקע הגדולות והמורכבות, וזה יכול להקשות על הבנת מחלות הנישאות בקרקע. תגובת שרשרת פולימראז, הידועה גם בשם PCR, היא כיום הגישה הרגישה והמדויקת המקובלת ביותר לאיתור פתוגנים צמחיים בתחום. הפרוטוקול הבא מדגים שיטה רגישה ובאתר לאיתור פתוגנים הנישאים בקרקע המורכבת ממיצוי DNA מבוסס חרוזים מגנטיים, PCR, שניתן לבצע באמצעות מכשיר PCR נייד, וניתוח נתונים, שניתן לבצע מרחוק, באמצעות מחשב נייד. מיצוי DNA מבוסס חרוזים מגנטיים. ערכת מיצוי ה-DNA וה-RNA הוכנה ושימשה לפי הוראות היצרן עם שינויים קלים. כל הריאגנטים אוחסנו בטמפרטורת החדר והפרוטאינאז K המוכן אוחסן ב-20
סקירה כללית
מאמר זה מציג מערכת ניידת לזיהוי באמצעות real-time PCR לאבחון במקום של פתוגנים של צמחים המועברים בקרקע. זיהוי מהיר חיוני לניהול יעיל של מחלות ולמניעת התפשטותן של מחלות צמחים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פתולוגיה של צמחים
- מיקרוביולוגיה של קרקע
- דיאגנוסטיקה שדה
רקע
- פתוגנים המועברים בקרקע הם מאתגרים לאבחון בשל סביבות קרקע מורכבות.
- אבחון באתר הוא קריטי לניהול יעיל של מחלות צמחים.
- תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא שיטה מקובלת נרחבת לזיהוי פתוגנים.
- מערכות PCR ניידות מאפשרות ביצוע אבחונים בשטח.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה רגישה ומדויקת לזיהוי פתוגנים המועברים בקרקע.
- הדגמת השימוש במערכת PCR ניידת לאבחון באתר.
- צמצום ההפצה המשנית של פתוגנים בסביבות חקלאיות.
שיטות שהשתמשו בהן
- מיצוי DNA מבוסס חרוזי מגנט.
- Real-time PCR לזיהוי פתוגנים.
- שימוש במכשיר PCR נייד לניתוח בשטח.
- ניתוח נתונים מרחוק באמצעות מחשב נייד.
תוצאות עיקריות
- השיטה שפותחה מאפשרת זיהוי מהיר של פתוגנים המועברים דרך הקרקע.
- ניתן לנהל ביעילות תנאי שטח באמצעות מערכת ניידת זו.
- אבחנה באתר יכולה למנוע ייצור נוסף של אינוקולום.
- הפרוטוקול ניתן להתאמה לסביבות קרקע שונות.
מסקנות
- מערכת ה-PCR הניידת משפרת את היכולת לאבחן פתוגנים המועברים בקרקע בשטח.
- זיהוי מהיר ומדויק חיוני לניהול יעיל של מחלות.
- שיטה זו יכולה לתרום באופן משמעותי להפחתת התפשטות מחלות צמחים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי מהיר בשטח של פתוגנים המועברים בקרקע מאפשר התערבות בעיתוי נכון בתהליכי ביוטכנולוגיה חקלאית, ובכך מפחית את אובדן היבולים ותומך באסטרטגיות לניהול מחלות חזוי. דיאגנוסטיקה מולקולרית ניידת מגשרת בין דגימה מהשטח לתיקוף במעבדה, ומאיצה את קבלת ההחלטות בשלבים מוקדמים של פיתוח כימיקלים חקלאיים וביו-פסטיצידים. גישה זו משפרת את תיקוף המטרה במחקרי אינטראקציה בין צמח לפתוגן, על ידי אספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור של עומס הפתוגנים ישירות ממטריצות סביבתיות מורכבות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטי
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף תפקודי של גורמי virulent של פתוגנים באמצעות זיהוי כמותי של עותקי DNA בקרקע.
- ערך תפעולי: תומך בבדיקת השערות בתהליכי תיקוף מטרות (target validation) על ידי אספקת כימות פתוגנים הניתן לשחזור מדגימות שנאספו מהשדה.
- ערך ניבוי: מייצר נתוני תגובה למנה (dose-response) עבור סריקת תרכובות אנטימיקרוביאליות או תרכובות השוברות עמידות בתנאים סביבתיים מציאותיים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מיצוי חומצות גרעין מבוסס חרוזי מגנט מספק הכנה סטנדרטית של דגימות העמידה בפני מעכבים, לצורך זיהוי פתוגנים בסריקה רחבה.
- פלט כמותי: בדיקת real-time PCR מבוססת גששים פלואוריגניים מספקת ערכי Ct המאפשרים קביעת גבול גילוי (עד ל-100 copies) לצורך אופטימיזציה של הבדיקה.
- ניתנות להעברה בין פלטפורמות: תאימות הפרוטוקול למכשירים ניידים תומכת בתהליכי סריקה מבוזרים באתרים גיאוגרפיים מגוונים של הניסוי.
מחקר תרגומי ופקליני
- מערכת רלוונטית למחלה: משתמשת ב- Spongospora subterranea במטריצות של קרקע כדי לדמות אתגרי גילוי פתוגנים בעולם האמיתי בגידולי שורש.
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין פיתוח בדיקות מעבדה לאבחון שניתן לפרוס בשטח, ובכך מפחיתה את הסיכון בתהליך התרגום בביוטכנולוגיה חקלאית.
- הסרת סיכונים מכניסטית: מאפשרת ניטור של דינמיקת עומס הפתוגן כדי להעריך את מנגנון הפעולה של חומרים ביולוגיים או חומרי הגנה כימיים המיושמים בקרקע.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי ליישום (discovery-to-translational continuum) בכך שהיא מאפשרת כימות מוקדם של פתוגנים בשלב תיקוף המטרה, תומכת בסטנדרטיזציה של בדיקות בתהליכי סריקה, ומספקת מידע לקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go decisions) בפיתוח פרה-קליני של חומרי הגנה על גידולים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת חקירה מונחית-השערה של אינטראקציות בין פתוגן למארח באמצעות כימות מדויק של DNA מטרה בסביבות קרקע טבעיות.
- סריקה: מספקת תוצרי זיהוי פתוגנים כמותיים וסטנדרטיים המתאימים להערכת ספריות תרכובות בפורמטים של בדיקות מבוססות קרקע.
- אנליטיקה: מייצרת ערכי Ct ועקומות הגברה הדירות המאפשרים השוואה סטטיסטית של השפעות טיפול תחת תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות מבדיקות מעבדה מבוקרות למחקרי תיקוף בשטח, על ידי שמירה על ביצועי הבדיקה לאורך סוגי דגימות שונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניידת והדירה לזיהוי פתוגנים, הניתנת ליישום במערכות רבות של גידול-פתוגן ברשתות מו"פ גלובליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרי צמחים-פתוגנים באמצעות אספקת מדידות מדויקות ומאומתות בשטח של עומס הפתוגן.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה של זיהוי פתוגנים באתרים מגוונים בשטח, באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של מיצוי והגברה.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות "המשך/עצור" בתוכניות להגנת גידולים בשלבים מוקדמים, על ידי הפחתת שיעורי השליליים השקריים בזיהוי פתוגנים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מועמדים מובילים המותאם לסיכון, בהתבסס על יעילות מוכחת תחת תנאי לחץ פתוגני ריאליסטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באבחון מולקולרי ובפתולוגיה של צמחים לצורך תכנון ופירוש הבדיקה.
- תלוי בגישה למכשירי real-time PCR ניידים ולערכות פרובים פלואוריגניים תואמות.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי איסוף ועיבוד דגימות בין אתרי השדה כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- חייב להתחשב במעכבי PCR שמקורם בקרקע באמצעות תיקוף של יעילות הסרטה מבוססת חרוזי מגנט במטריצות המטרה.
- מוגבל לגילוי מבוסס חומצות גרעין; אינו מעריך חיוניות או יכולת הדבקה של הפתוגן ללא בדיקות משלימות.
