שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לבדוק את ההשפעות של תרכובות שונות על אורגניזמי המודל C.elegans בבדיקת תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכימיה, הביולוגיה וההזדקנות, כגון האם מבנים כימיים ספציפיים מאריכים את תוחלת החיים של C.elegans? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הקרנה של תרכובות רבות בצורה יעילה ומהירה בזמן.

להכנת צלחות תרבית המוניות לייצור מספר רב של תולעים, בארון זרימה למינרית, יש להוציא תחילה 30 מיליליטר של 60 מעלות צלזיוס אגר בינוני לגידול נמטודות על צלחות תרבית של 10 סנטימטר להתמצקות לילה. למחרת בבוקר, הוסיפו שני מיליליטר של E.coli מרוכז על כל צלחת, הטו וסובבו את הצלחת כדי לפזר את החיידקים לחלוטין על פני הצלחת. כאשר צלחות התרבות ההמוניות התייבשו, יש לאחסן אותן בארבע מעלות צלזיוס עד שבועיים.

כדי להכין לוחות תרבית בדיקה בתפוקה גבוהה להקרנה, השתמש במתקן אוטומטי של שמונה ערוצים כדי להוסיף 0.15 מיליליטר של אגר בינוני לגידול נמטודות מותכות לכל באר של צלחת 96 בארות. הניחו לאגר להתמצק למשך הלילה. לאחר מכן אחסן את לוחות הבדיקה בתפוקה גבוהה בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.

כדי להקים את תרביות C.elegans, השתמש במכוש תולעים ובמיקרוסקופ מנתח כדי להעביר 20 ביצים על כל צלחת תרבית המונית ולדגור את הצלחות ב-20 מעלות צלזיוס למשך שישה ימים. ביום השביעי, השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי לאשר חזותית את נוכחותן של ביציות ברחם. כדי לאסוף את הבוגרים הכבדים, השתמשו בפיפט זכוכית כדי להוסיף שניים עד שלושה מיליליטר של תמיסת S Basal לכל צלחת וסובבו את התמיסות סביב כל צלחת ביד.

השתמש בצינור הזכוכית כדי להעביר את התולעים לצינור של 15 מיליליטר ולגלול את התולעים באמצעות צנטריפוגה. השעו מחדש את התולעים ב-10 מיליליטר של תמיסת היפוכלוריט ונערו במהירות את הצינורות למעלה ולמטה למשך חמש שניות. לאחר מכן, דגרו על התולעים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור כל 2.5 דקות.

בתום הדגירה יש לצנטריפוגה שוב את התולעים. הכדורים צריכים להיות חומים צהבהבים. החלף את הסופרנטנטים ב -10 מיליליטר תמיסת היפוכלוריט טרייה ונער שוב את הצינור במרץ.

דגרו על התולעים למשך דקה עד שלוש דקות נוספות עם טלטול מדי פעם. כאשר נותרו רק ביצים, צנטריפוגה את הצינורות ושואבת את הסופרנטנטים. הכדורים צריכים להיות לבנים ללא צבע חום.

בטכניקה סטרילית, פתחו את הצינורות בארון זרימה למינרי סטרילי והוסיפו 14 מיליליטר של תמיסת S Basal לכל גלולה. שטפו את הגלולה שלוש פעמים עם 14 מיליליטר S בזל. לאחר שלוש שטיפות על ידי צנטריפוגה, השעו מחדש את הביצים בשניים עד שלושה מיליליטר של תמיסת S Basal טרייה.

כדי להכין זחל C.elegans שלב L1, העבירו את הסופרנטנטים לצלחת פטרי זכוכית סטרילית אחת לכל צינור והשתמשו בשניים עד שלושה מיליליטר של תמיסת S Basal כדי לשטוף את הביצים הנותרות מהצינורות לכל מנה. הוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת S Basal לכל מנה כדי להקל על הצפיפות והניחו את המנה על שייקר מסלולי בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס ו-20 סל"ד למשך 16 עד 24 שעות כדי לעודד בקיעה. כל האבקועים ייעצרו בשלב הזחל הראשון בגלל מחסור במזון.

בעזרת פיפט סרולוגי, העבירו את זחלי L1 לצינור של 15 מיליליטר לצנטריפוגה שלהם. לאחר שכל ה-L1 שבקעו אוחדו באמצעות צנטריפוגה ושאיבה חוזרות ונשנות, יש להשעות מחדש את כדור הזחל עם 10 מיליליטר של תמיסת בסיס S סטרילית. לאחר מכן, העבירו 10 מיקרוליטר לצלחת לא זרועה וספרו את מספר הזחלים שנמצאים על הצלחת.

חזור על פעולה זו 10 פעמים כדי לקבל את הצפיפות הממוצעת של L1s בתמיסה שלך. בעזרת פיפט סרולוגי סטרילי, קבע את הנפח הכולל של התמיסה המכילה את L1s. לאחר מכן, השתמש בנפח של תמיסת L1 ובצפיפות של L1s בתמיסה כדי לחשב את המספר הכולל של L1s הקיימים בפתרון שלך.

כדי לצלחת את התולעים בצלחת בדיקה בעלת תפוקה גבוהה של 96 באר, יש לדלל את מתלה L1 לזחל L1 אחד למיקרוליטר בבקבוק מדיה סטרילי ועגול, המצויד במוט ערבוב איטי למדי ולאפשר ללוחות הבדיקה להתחמם לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בארון זרימה למינרית, הוסף חמישה מיקרוליטר של E.coli מרוכז לכל באר, ואחריו 10 מיקרוליטר של תרחיף L1 לבאר כדי להניב בממוצע 10 תולעים לבאר. לאחר שכל התולעים מצופות, מכסים את הצלחות ודוגרים על תולעים למשך יומיים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר לזחלים להתפתח לבוגרים.

בתום הדגירה, הביאו את לוחות הספרייה הכימית לטמפרטורת החדר מהקפאה. יש לנער בעדינות את הצלחות המופשרות ב-60 סל"ד על שייקר מיקרופלייט למשך דקה אחת מיד לפני השימוש. באמצעות מטפל נוזלים אוטומטי של 96 בארות, העבירו 0.75 מיקרוליטר של תרכובת מלוח הספרייה ללוחית הבדיקה.

לאחר שכל הבארות טופלו, יבש את התרכובת באוויר מפני השטח של הלוחות בארון זרימה למינרי למשך ארבע עד שמונה שעות, והסר את הלוחות הבודדים ברגע שהם יבשים. אוטמים את הצלחות המיובשות בסרט שקוף ומכסים אותן. לאחר מכן סובב את הלוחות למשך 45 שניות ב 1000 גרם ואחסן אותם במצב הפוך ב -25 מעלות צלזיוס.

כדי לבחון את תגובותיו של C.elegans לתרכובות המעניינות, ניתן להשתמש בלוחית בקרה שלילית כדי לנקד את ההישרדות הכוללת עד ש-95% מחיות הביקורת מתות, ואז ניתן לנקד את כל לוחיות הבדיקה. לדוגמה, במחקר זה, נצפו 57 פגיעות מספריית הבדיקה החוזרת של 179 תרכובות, מה שהראה כי 32% מהכימיקלים שנבדקו מחדש נמצאו חיוביים בסך הכל. שילוב של הציונים הממוצעים בחיים עבור בארות הבקרה והבדיקה השליליות הצביע על כך שבארות הבדיקה עלו על בארות הבקרה.

ניתן לבצע גם מסכים בקנה מידה קטן, כפי שהודגם בבדיקת בדיקה מייצגת זו בה נעשה שימוש ב-50 ריכוזים מיקרו-מולאריים ו-100 מיקרו-מולרים של תרכובת הבדיקה. ניקוד מחדש של לוחות הבדיקה הקטנים הללו כאשר יותר מ-99% מבעלי החיים שטופלו בביקורת שלילית היו מתים, הצביע על כך שבארות הבקרה החיוביות עלו בהרבה על בארות הבקרה והבדיקה השליליות בכך שבארות הבדיקה ביצעו מעט טוב יותר מהביקורת השלילית. בניסוי זה, התוצאה האחרונה הייתה מוטה על ידי האינדיקציה שרבות מבארות הבדיקה הפגינו רעילות ביחס לטיפול הביקורת, ובכך בלבלה את הפרשנות הפשוטה הזו.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שבועיים עד ארבעה שבועות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשמור על שלמות לוחות הבדיקה, ולוודא שהם בתוליים לפני השימוש בהם. בעקבות טכניקה זו, ניתן לענות על שאלות נוספות, כגון, איזו מהתרכובות הללו גורמת למיטופגיה?

לבדיקת מיטופגיה, ייעשה שימוש בחוט כתב מיטופגי. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבצע מסך כימי בתפוקה גבוהה באמצעות C.elegans כאורגניזם מודל.