תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

אנו מתארים פלטפורמה ניתוח העברה RNA המקורי בשם ספוט (פלטפורמה יעילה להתבוננות tRNA). המקום בו זמנית מודד רמות התאית של כל tRNAs בדגימות ביולוגיות, רק שלושה צעדים, פחות מ-24 שעות.

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד בו זמנית את הרמות התאיות של כל ה-RNA המועבר בדגימות ביולוגיות על ידי שילוב של תיוג מטבולי in vivo עם ניתוח מקרו-מערך. רנ"א העברה נחשבו במשך זמן רב כמולקולות משק בית חסרות פונקציות רגולטוריות. עם זאת, גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך שרמות ה-tRNA התאיות משתנות בתגובה לתנאים משתנים כגון סוג התא, הסביבה והלחץ.

התנודות בביטוי tRNA משפיעות ישירות על תרגום הגנים, ומעדיפות או מדכאות את הביטוי של חלבונים מסוימים. הבנת הדינמיקה של סינתזת חלבונים דורשת שיטות המסוגלות לספק פרופילי tRNA באיכות גבוהה. אנו מציגים כאן, טכניקה אמינה ופשוטה המאפשרת כימות מהיר ומדויק של רמות RNA העברה באורגניזמים שגודלו במעבדה.

כדי להתחיל, בעזרת מחט בגודל 18, הנח חור בודד במרכז הכובע של צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר כדי לאפשר אוורור תקין. לאחר מכן, עם חמישה מיקרוליטרים של Mycobacterium smegmatis מתרבית התחלה ללילה, יש לחסן 500 מיקרוליטר של מרק 7H9 סטרילי בתוסף. בהתאם לשיטות ההגנה הסטנדרטיות מפני קרינה, יש להגדיל את אמצעי התרבות עם 20 מיקרוקוריות למיליליטר של אורתופוספט המסומן בזרחן-32.

גדל חיידקים ב-37 מעלות צלזיוס ו-1,200 סל"ד, באינקובטור שייקר הממוקם מאחורי מגן אקרילי בעובי תשעה מילימטרים. בשלב האמצע, העבירו את כל התרבית לצינור מכסה בורג של שני מיליליטר, וגלולה חיידקים רדיואקטיביים בטמפרטורת החדר על ידי צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 10,000 למשך שתי דקות. אסוף את הסופרנטנט המכיל אורתופוספט רדיואקטיבי לא משולב במיכל פסולת מתאים.

להכנת RNA כולל, הוסף מיליליטר אחד של מגיב מיצוי RNA מסחרי וכ-200 מיקרוליטר חרוזי זכוכית לגלולה. מכסה היטב את הצינור, ושבש את החיידקים בהומוגנייזר בתסיסה מקסימלית למשך שתי דקות. צנטריפוגה את הדגימה בכוח הכבידה פי 12,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של שני מיליליטר, והשליכו את החרוזים כראוי. הוסף 0.2 מיליליטר כלורופורם, ונער במרץ את הצינור ביד למשך 15 שניות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה בכוח הכבידה פי 12,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

אסוף את השלב המימי של הדגימה לצינור חדש על ידי זווית הצינור ב-45 מעלות. הימנע מציור כל אחד מהשכבה הבין-פאזית או האורגנית. הוסף שני מיקרוליטר של משקעים צבעוניים ו -0.5 מיליליטר של 100% איזופרופנול לשלב הימי.

נענע את הצינור במרץ ביד למשך חמש שניות וצנטריפוגה שוב. הסר את הסופרנטנט מהשפופרת, והשליך אותו כראוי, מכיוון שהחלק הנוזלי עשוי להכיל עקבות של רדיואקטיביות. לאחר מכן, לאחר ייבוש הגלולה באוויר למשך חמש דקות, השעו אותה מחדש ב-200 מיקרוליטר של 2X SSC עם 0.1% משקל לנפח SDS.

באמצעות מסד הנתונים הגנומי tRNA, תכנן בדיקות DNA על ידי אחזור רצפי tRNA או גנים מקודדי tRNA. לאחר חיתוך CCAs משומרים עם שלושה ראשוניים אם הם מקודדים ויוצרים את המשלים ההפוך, הזמינו בדיקות על סמך 70 הנוקלאוטידים הראשונים. כדי לבצע הדפסת מערך, הפשירו את הצלחת בעלת 96 הבארות בטמפרטורת החדר.

בעזרת עט יהלום, סמן שקופיות זכוכית מצופות אמין. לאחר מכן, מקם את השקופיות ביחידת אינדקס. לאחר מיקומי הרשת, טבלו בזהירות את סיכות המשכפל בבארות.

תוך שימוש בלחץ מינימלי, הדפס בעדינות את המערך על שקופיות הזכוכית. המשך להדפיס מבלי לנקות את המערך עד לסיום עם בלוק A.It דורש קצת תרגול כדי להיות מסוגל להדפיס באופן עקבי. אנו ממליצים להדפיס לא יותר משמונה עד 10 מערכים בכל הפעלה.

ספור 10 עד 15 דקות לכל מערך. קל לאבד את המעקב אחר רצף דפוסי ההדפסה, לכן הקדישו את כל תשומת הלב שלכם למשימה וכבו את כל הסחות הדעת. כשמוכנים לעבור לבלוק הבא, טבלו את המשכפל באקונומיקה של 5% ונערו בעדינות.

לחץ את המשכפל לתוך נייר סופג. לאחר מכן, טובלים את המשכפל במים מזוקקים, מנערים בעדינות ולוחצים לנייר. חזור על שלב זה פעם אחת.

לאחר מכן, טבלו את המשכפל באיזופרופנול, נערו בעדינות ולחצו אותו לתוך הנייר. יבש את המשכפל על המאוורר למשך כ-20 שניות לפני שתעבור לבלוק הבא של צלחת 96 הבארות. המשך למספר ההדפסות הרצוי.

לאחר מכן, הניחו לשקופיות להתייבש. הנח את השקופיות המיובשות עם הפנים כלפי מעלה על משטח נקי ב-254 ננומטר צולב UV. הגדר את רמת האנרגיה ל-999, 990 מיקרו-ג'אול לסנטימטר בריבוע, ולאחר מכן לחץ על התחל.

העבירו את המערכים ל-450 מיליליטר של תמיסת חסימה, ודגרו אותם בטמפרטורת החדר על מערבל מגנטי, בתסיסה איטית למשך הלילה. שוטפים את המגלשות ב -500 מיליליטר מים מזוקקים בטמפרטורת החדר, פעמיים למשך חמש דקות כל אחת. יבש את השקופיות על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה מיקרו-מערך בטמפרטורת החדר למשך 10 שניות.

אחסן את המערכים במקום יבש וחשוך עד שישה חודשים. לפני ההכלאה יש לשטוף את המגלשות במים רותחים ולייבש אותן באמצעות צנטריפוגה. הנח את המערך בתוך קלטת הכלאה, וטען את דגימת ה-RNA עם תווית הרדיו.

הפעל את הדגימות בתחנת הכלאה-שטיפה אוטומטית לשחזור מקסימלי בהתאם לפרוטוקול הטקסט. בסוף הריצה יש לייבש את המגלשות באמצעות צנטריפוגה. עטפו שקופיות עם פלסטיק דק.

לאחר מכן, השתמש במונה גייגר בהגדרה הרגישה ביותר שלו כדי לבדוק את השקופיות לאיתור אות רדיואקטיבי. חשוף את השקופיות על מסך זרחן אחסון בקלטת חשיפה בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 90 שעות, בהתאם לעוצמת האות. זמן חשיפה שיכול להימשך מספר שעות עד מספר ימים תלוי ישירות באות המערך.

נדרש קצת תרגול כדי להיות מסוגל לתרגם את הספירה על מונה גייגר לזמן חשיפה. סרוק שקופית ברזולוציה של 50 מיקרומטר באמצעות מצלמת זרחן. כימות והפחתת עוצמות רדיואקטיביות ברקע בכל נקודת בדיקה באמצעות תוכנת ImageJ החינמית המשודרגת עם פרופיל מיקרו-מערך.

צור מפות חום לפי פרוטוקול הטקסט. מוצגים כאן, מקרו-מערכי חיידקים, עכברים ובני אדם סרוקים. מערכי M.smegmatis משתמשים רק ב-43 בדיקות במקום 48 המשמשות לעכבר ולאדם.

כתוצאה מכך, מערך החיידקים מציג 40 נקודות ריקות שמתמזגות עם הרקע. שלושה שכפולים ביולוגיים בלתי תלויים מראים כי בתנאי הגידול שנבדקו, כל M.smegmatis tRNAs באים לידי ביטוי מעל רמת הרקע. בניסוי הספציפי הזה, סטיית התקן הנצפית עבור כל בדיקה היא בין 2% ארגינין TCT ל-22% ציסטאין GCA כאשר החציון הוא 5%בנוסף, ניסוי זה מראה כי הביטוי של איזומקבלים tRNA אינו אחיד.

לדוגמה, כל האיזו-מקבלי אלנין באים לידי ביטוי ברמות דומות, בעוד שה-tRNA הגבוה והנמוך ביותר המקבלים ארגינין שונים פי שלושה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-24 שעות אם היא מבוצעת כראוי ואם אות הנקודה מתאים. השיטה שלנו ישימה לכל אורגניזם שהגנום שלו זמין לתכנון בדיקה.

אורגניזמים מודלים הגדלים במבחנה הם מועמדים אידיאליים לתיוג מטבולי. הפרוטוקול המוצג כאן מותאם ל-Mycobacterium smegmatis, אך הוא שימש בהצלחה גם לפרופיל tRNA ב-E.coli, שמרים, עכברים ותאים מתורבתים אנושיים. הטכניקה שלנו ניתנת לשחזור וספציפית.

הטווח הדינמי הגדול והסף המתכוונן בקלות מאפשרים פרופיל של מינים בעלי שפע נמוך, כגון tRNAs הקשורים לפוליזומים, פשוט על ידי הארכת זמני החשיפה של המערך.