Name: תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: למד שיטת SPOt לתיוג מטבולי ויצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות macroarrays. השיטה מאפשרת מדידה סימולטנית של כל רמות ה-tRNA בתוך 24 שעות בלבד, ומספקת כלי אמין לחקר דינמיקת תרגום גנים וסינתזת חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק SC INBRE מ הלאומית המכון כללי רפואי למדע - NIH (P20GM103499 כדי R.G.), מעניקה CA555536 & CA154664 מן המכון הלאומי לסרטן P.H.H. תוכנית זו נתמכה בחלקו על ידי מענק מכללת צ'רלסטון הווארד יוז מכון רפואי דרך ה מכללה קדם & לתואר ראשון במדעי החינוך תוכנית על ידי מענקים של המרכז הארצי עבור משאבים למחקר (5 P20 RR016461) הלאומית המכון כללי רפואי למדעים (8 P20 GM103499) מ המכונים הלאומיים לבריאות.

1. תרבות, תיוג מטבולית
<ol><li>לתקוע פעם למרכז הכיפה של צינורות מיקרו-צנטריפוגה mL 1.5 סטרילי עם מחט אל תדאגי כדי לאפשר אוורור נאות. לחסן µL 500 של שהושלם סטרילי 7 שעות 9 מרק עם 5 µL של smegmatis מ מ starter תרבות מבוגר לילה12. הערה: את המתכון ליטר אחד של 7 שעות 9 הוא ציר: 4.7 g מסחרי H 7 9. אבקה, 2 מ ל גליצרול, 1 מ"ל Tween 80, g 0.85 NaCl, 5 g אלבומין, 2 גרם דקסטרוז, H2O (להביא את הנפח הכולל עד 1 ליטר).<ol>
<li>
(זהירות) בעקבות שיטות המכון להגנת סטנדרטי, ספייק התקשורת תרבות עם µCi/mL 20 [32P] נה2HPO4. לגדול חיידקים על העצבנות 37 ° C ו- 1,200 סל ד, ב חממה שאכר מאחורי מגן אקרילי בעובי 9 מ מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בשלב midlog (O.D.600 ננומטר ~ 0.5), להעביר את תרבות שלמה לתוך צינור 2-mL בורג-קאפ ואת הצניפה חיידקים רדיואקטיבי בטמפרטורת החדר על ידי צריך שתוציאו במשך 2 דקות ב- 10,000 x ג לאסוף supernatant האורטו רדיואקטיבי המכיל טריטוריה ב פח אשפה המתאים.</li>
</ol>2. הכנת RNAs סה
הערה: RNAs הכולל המחולצים כדורי חיידקי באמצעות ריאגנט החילוץ RNA מסחרי (מכיל guanidinium thiocyanate, פנול, כלורופורם) ע פ הפרוטוקול של היצרן.
<ol><li>להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט החילוץ RNA מסחרי ו כ-200 µL של חרוזי זכוכית על גבי בגדר. קאפ הצינור בצורה מאובטחת, לשבש את בקטריאלי ב מהמגן למשך 2 דקות תחת עצבנות המרבי, (קביעת מספר חמש על המכשיר שבחרת (ראה את הטבלה של חומרים)).</li>
	<li>צנטריפוגה מדגם ב g x 12,000 10 דקות ב 4 º C. להעביר את תגובת שיקוע צינור 2-mL וזורקים את החרוזים כראוי. להוסיף 0.2 מ של כלורופורם, לנער צינור נמרצות על ידי יד צנטריפוגה ס' 15 ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>לאסוף את פאזה מימית של המדגם לתוך צינור חדש על ידי לדוג את הצינור ב- 45 מעלות. להימנע מהדפסת לאטמוספרה או שכבה אורגני. להוסיף 2 µL של precipitant בצבע ו- 0.5 מ ל אלכוהול איזופרופיל 100%. לנער את הצינור נמרצות על ידי יד צנטריפוגה ס' 5 ב 12,000 x g 10 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע מהצינור ולמחוק כראוי כפי השבר נוזלי עשוי להכיל עקבות של קרינה רדיואקטיבית. אוויר יבש גלולה עבור 5 דקות ואז resuspend ב 200 µL של 2 X תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס), 0.1% (w/v) dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) הסופי. הערה: ההרכב של המניה 20 X האס הוא 3.0 M NaCl, 0.3 M סודיום ציטרט, pH 7.0.</li>
</ol>3. הכנת לוחות מדפסת טוב 96
הערה: מיקרו-מערכים tRNA מודפסים באופן ידני עם ארבעים ושניים 70-מר דנ א משלים 3' בסוף כל tRNA smegmatis מ' (מסוף המרכז לאמנות עכשווית נכלל) באמצעות arrayer 8 פינים של oligonucleotides. מסדרות את הגששים oligonucleotide דנ א, כמו גם את הפריסה החוקרת את הצלחת-. ובכן, את המערך מסופקים (1 קובץ משלים - גיליון 1 עד 3 בהתאמה).
<ol><li>עיצוב ה-DNA רגשים הראשון רצפים tRNA איחזור או גנים קידוד tRNA ממסדי tRNA כגון tRNA גנומית מסד הנתונים13. לקצץ שנשמרת 3' סוף המרכז לאמנות עכשווית, אם מקודד. הפוך משלים הרצף שנוצר. . בדיקת סדר בהתבסס על נוקלאוטידים תחילה 70</li>
	<li>Resuspend יבש DNA הגששים במים. להתאים את הגששים ריכוז 100 מיקרומטר. ב- 96 טוב-צלחת, להכין µL 120 של 50 מיקרומטר oligos ב 3 X האס, 0.01% (w/v) מרחביות הסופי (שתדללו 60 µL של הגששים מניות בודדות היטב עם 60 µL של 6 X האס, 0.01% (w/v) מרחביות.</li>
	<li>מכסים בצלחת בנייר כסף כדי למנוע אידוי או זיהום, להקפיא מיידית ולשמור ב-20 ° C עד שהוא נדרש.</li>
</ol>4. מערך ההדפסה
<ol><li>להפשיר את הצלחת 96-ובכן בטמפרטורת החדר (לוקח בערך 20 דקות).</li>
	<li>תווית שקופיות זכוכית מצופים אמין עם עט יהלום. במקום מגלשות לתוך יחידה יצירת אינדקס. בצע את מיקומי רשת, לעשות כדלקמן.<ol>
<li>בזהירות טובלים הפינים משכפל הבארות.</li>
		<li>הדפס בעדינות את המערך בשקופיות זכוכית, באמצעות לחץ מינימלי (אתם תרגישו התנגדות קטנה). להמשיך בהדפסה ללא ניקוי את arrayer עד גמר עם בלוק א</li>
	</ol>
</li>
	<li>כשתהיה מוכן להמשיך הלאה הבלוק הבא, בצע את ההליך כביסה המתוארים להלן.<ol>
<li>טובלים משכפל לבן 5% ומנערים בעדינות.</li>
		<li>לחץ משכפל לנייר סופג.</li>
		<li>טובלים משכפל במים מזוקקים, לנער בעדינות, והקש לתוך נייר. חזור על שלב זה פעם אחת.</li>
		<li>טובלים משכפל ב אלכוהול איזופרופיל, לנער בעדינות, והקש לתוך העיתון.</li>
		<li>יבש המשכפלים על המאוורר עבור 20 s לפני שהמשכנו הבלוק הבא של צלחת 96-ובכן. להמשיך מספר הדפסים הרצוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאפשר את השקופיות להתייבש ואז crosslink oligos אל השקופית באמצעות crosslinker UV של 254 ננומטר.<ol>
<li>הגדר את רמת האנרגיה µJ/cm 999,9902.</li>
		<li>לשים את הפנים שקופיות על משטח נקי ב crosslinker. לחץ על "התחל".</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחסום את מערכי לילה ב 450 מ של חסימת פתרון על פגים, בטמפרטורת החדר ותחת עצבנות איטי. לאסוף ולהשתמש פתרון חסימה עד פי ארבעה. הערה: המתכון עבור הפתרון החסימה היא: 125 מ מ פוספט מאגר (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2.25% מרחביות (w/v), 0.5 מ מ EDTA, האס X 0.5, 1% BSA (w/v).</li>
	<li>לשטוף את השקופיות פי 2 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר 500 מ ל מים מזוקקים. יבש את השקופיות על-ידי צריך שתוציאו בשביל 10 s בטמפרטורת החדר ומפרידה microarray. מאגר מערכי במקום חשוך ויבש עד 6 חודשים.</li>
</ol>5. מערך הכלאה
<ol><li>לפני הכלאה השקופיות במים רותחים, שוטפים ומייבשים על ידי צנטריפוגה (כמו 4.6).</li>
	<li>במקום מערך בתוך קלטת הכלאה וטען radiolabeled מדגם ה-RNA.</li>
	<li>להפעיל תחנת הכלאה-כביסה אוטומטיים הפארמצבטית המרבי.<ol>
<li>תוכנית השלבים להלן. אטמים תנאי למשך 2 דקות ב 75 º C. להציג את המכשיר ב 60 מעלות צלזיוס. Denature הגששים ודוגמאות 5 דקות ב- 90 ° C. Hybridize דוגמאות עבור h 3 ב 60 מעלות צלזיוס.<ol>
<li>לשטוף שקופיות ב 50 מעלות צלזיוס פעמיים עם 2 X האס, 0.1% (w/v) מרחביות, זרימה 10 s והחזק 20 ס' שטיפת שקופיות ב 42 ° C פעמיים עם 0.1 X SSC, 0.1% מרחביות, זרימה 10 s והחזק שקופיות שטיפת ס' 20-42 ° C פעמיים עם 0.1 X האס , זרימה 10 s ו- s להחזיק 20.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>יבש שקופיות על ידי צנטריפוגה (כמו 4.6).</li>
</ol>6. מערך כמת
<ol><li>גלישת טקסט שקופיות באמצעות סרט פלסטיק דק. בדוק שקופיות לאות רדיואקטיבי בעזרת מונה גייגר על ההגדרה הרגישים ביותר שלה. חושפים את השקופיות על מסך פוספור אחסון במגרה חשיפה בטמפרטורת החדר במשך 10-90 h בהתאם עוצמת האות. הערה: כפי הרגישות של מוני גייגר משתנים בין מכשיר אחד למשנהו, פעמים חשיפה חייב להיות מותאם מדעית.</li>
	<li>סריקת שקופיות ברזולוציה 50 מיקרומטר, באמצעות phosphorimager. לכמת ולחסר רקע-עוצמות קרינה רדיואקטיבית בנקודה כל בדיקה באמצעות תוכנה J תמונה חופשית משודרג עם פרופיילר microarray.</li>
	<li>לארגן, לעבד נתונים באמצעות גיליון אלקטרוני אלקטרונית. צור מפות חום באמצעות כלי עיצוב מותנה. מייצגים לדוגמה כל אות בדיקה כשבר (המתבטא וניתן) של האות הכולל בדיקה.</li>
</ol>

<ol><li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li>
<li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221(2006).</li>
<li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA+over-expression+in+breast+cancer+and+functional+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).</li>
<li>Giegé, R., Jühling, F., Pütz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+transfer+RNAs%3A+similarity+and+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Structure of transfer RNAs: similarity and variability.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Torres, A. G., Piñeyro, D., Rodríguez-Escribà, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-Léger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inosine+modifications+in+human+tRNAs+are+incorporated+at+the+precursor+tRNA+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level.</a> Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).</li>
<li>Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Maréchal-Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+evolution+and+expression+of+Chlamydomonas+reinhardtii+nucleus-encoded+transfer+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes.</a> Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).</li>
<li>Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+quantitative+high-throughput+tRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing.</a> Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).</li>
<li>Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOt%3A+A+novel+and+streamlined+microarray+platform+for+observing+cellular+tRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels.</a> PLoS One. 12 (5), e0177939(2017).</li>
<li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%2C+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042(2015).</li>
<li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-%CE%B2-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li>
<li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li>
<li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GtRNAdb%3A+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li>
<li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li>
</ol>

אין ניגוד אינטרסים הכריז.

פליטת חלקיקי ביתא ידועים סוכנים אחרים bacteriostatic14, אולם קרינה בטווח שנבדקו יש השפעה משמעותית על כושר התא. נצנוץ ספירת הראה כי הרדיואקטיביות הוא שולב 25% סה כ- cell תמציות ובהמשך, 1% של RNAs הכולל מטוהרים.
את הגששים בגדלים זהים, טמפרטורת ההיתוך דומה ותוכן GC, יחד עם פרוטוקול אחיד לאיתור macroarray, הכלאה, כימות מאפשר למדידת רמות tRNA ישירות מן האותות ספוט לא משוחדת.
המקום הספציפי הדירים. שלה טווח גדול ודינמי, סף מתכוונן בקלות מאפשר יצירת פרופיל נמוך שופע מינים, כגון tRNAs הקשורים polysomes, פשוט על-ידי הארכת מערך החשיפה פעמים9. לאחר ההשקעה הראשונית עבור הציוד הנדרש, הפעלה עלות לדוגמה, כולל מתכלים, הממוצע של 15 דולר לכל דגימות.
ספוט חל כל אורגניזם הגנום של מי זמין עבור עיצוב המכשיר. אורגניזמים דוגמנית מגודלים במבחנה הם מועמדים אידיאליים עבור תיוג מטבולית. כמו הגנום יונקים לעתים קרובות לקודד רבים isodecoders (tRNAs לשתף anticodons זהה, אך הצגת הבדלים קטנים ברצפים הגוף שלהם) הגששים צריך להיות חלקית מנוונת לשמר הומוגנית הכלאה של מינים קרובים tRNA. לבסוף, תאים בתרבית של חסיד תשואה נמוכה יותר בדרך כלל כמויות של RNA הכולל לעומת אורגניזמים גדל ההשעיה כגון smegmatis מ', כך תרבויות צריך להיות קנה המידה באופן משמעותי.

רמות tRNA הסלולר משתנים בהתאם לתנאים כגון סוג התא, הסביבה מתח1,2,3. ספוט, פלטפורמה יעילה להתבוננות tRNA, הוא המקורי, אמין, טכניקה פשוטה המאפשר כימות מהיר ומדויק של העברת RNA רמות אורגניזמים שגודלו במעבדה.
tRNAs יש מבנים משניות ושלישוניות יציב4. הם גם מציגים שינויים post-transcriptional מספר5. תכונות אלה מייצגים מבני משמעותי והמחסומים רצף ממתח או לפעמים מניעת לשחזור הישירים tRNA פרופיל משתמש ביצוע סטנדרטיים RNA כימות טכניקות6. קבוצות מחקר ברחבי העולם נאלצו לפתח טכניקות יצירתי אך לעיתים קרובות מפותל כדי להעריך את רמות tRNA הסלולר. כמה שיטות אלו כוללים: (1) הפרדת tRNAs סמויה שכותרתו electrophoretic דו-ממדית בשילוב עם הקצאה ספוט שיטתי על-ידי חשופה צפון1; (2) כימות בודדים על ידי צפון למחוק משתמש בזהירות מתוקננת רדיואקטיבי DNA הגששים7; (3) לאחר החילוץ תיוג עם cyanine fluorochromes ואחריו microarray ניתוח3ו (4) במבחנה בנוכחות אחר של tRNA ייודע אנזימים demodification רקומביננטי, אשר בשילוב עם שעתוק במהופך רצף תפוקה גבוהה8.
המקום פשוט ומקורי בשילוב של שתי הגישות רגילה וישירה: גוף (1) RNA תיוג, אשר מורכב ב הסינתזה, גדל אורגניזמים, רדיואקטיבי RNAs סה כ ו (2) tRNA macroarrays, כלי גנומית שיטתית, ולמחקר אופטימיזציה עבור tRNA סגרגציה.
דוגמאות בנויים אווירודינמית של אורגניזמים פלטפורמת כמת. הם מנותחים ישירות לאחר החילוץ, לא מעובד רחוק יותר אשר מגביל משמעותית את הטיות לעומת טכניקות הדורשות החילוץ שלאחר הגברה או טיפולים אנזימטיות. מקום רב תכליתי, ניתן לשלב בקלות כדי polysome fractionation כדי לזהות ולכמת subpopulations tRNA המשויכות פיזית לתרגם את הריבוזומים.
פרוטוקול המובאת כאן ממוטבת עבורו Mycobacterium smegmatis, גם בהצלחה שהשתמשו tRNAs פרופיל ב- Escherichia coli9 האפייה10, עכבר, תרביות תאים אנושיים11 .

<table><tbody><tr><td>מערכת אינדקס שקופיות זכוכית</td><td>V& פי סיינטיפיק בע"מ</td><td>VP 470</td><td></td></tr><tr><td>משכפל מערך שקופיות זכוכית</td><td>V& פי סיינטיפיק בע"מ</td><td>VP 478</td><td></td></tr><tr><td>96 באר מערכת אינדקס מיקרופלייט</td><td>V& פי סיינטיפיק בע"מ</td><td>VP 472</td><td></td></tr><tr><td>תחנת שטיפה וכתמים</td><td>V& פי סיינטיפיק בע"מ</td><td>VP 475</td><td></td></tr><tr><td>מייבש פינים משכפל</td><td>V& פי סיינטיפיק בע"מ</td><td>VP 474</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מצופות אמין</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>היברידייזר / תחנת הכלאה ושטיפה אוטומטית</td><td>Digilab</td><td>Hyb10022</td><td></td></tr><tr><td>חממת שייקר</td><td>Eppendorf Themomixer</td><td>05-400-200</td><td></td></tr><tr><td>מכסה בורג 2 מ"ל צינורות</td><td>Thermo Scientific</td><td>21-403-201</td><td></td></tr> <tr><td>[32P] Na2HPO4</td><td>פרקין אלמר</td><td></td><td></td>NEX011001MC</tr><tr><td>גואנידיניום תיוציאנט-פנול-כלורופורם (טריזול)</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית 0.5 מ"מ</td><td>Research Products International Corp.</td><td>9831</td><td></td></tr><tr><td>מיני טחנת חרוזים</td><td>VWR</td><td>25-020</td><td></td></tr><tr><td>אחסון מסך זרחן</td><td>Fujifilm</td><td>BAS-IP SR 0813</td><td></td></tr><tr><td>זרחן GE</td><td>בריאות</td><td>טייפון FLA7000</td><td></td></tr><tr><td>DNA אוליגונוקלאוטידים</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker</td><td>ספקטרולין</td><td>סלקט סדרה 254 ננומטר</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מיקרו-מערך</td><td>Arrayit Corporation</td><td>MHC110V</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium smegmatis</td><td>ATCC</td><td>700084</td><td></td></tr><tr><td>מחטים חד פעמיות</td><td>BD (Becton Dickinson)305185</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>צינור צנטריפוגה 2 מ"ל</td><td>Fisherbrand</td><td>14-666-317</td><td></td></tr><tr><td>משקעים (GlucoBlue)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>7H9 מרק</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>פישר כימיקלים</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>פישר כימיקלים</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>20 X SSC</td><td>Lonza</td><td>51205</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>קלטת הכלאה</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Amresco</td><td>M126-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>כימיקלים ספקטרום</td><td>אלבומין</td><td>A3611</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>פישר כימיקלים</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)</td> <td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ' חוצץ פוספט pH 7.2</td><td>אלפא אסאר</td><td>AAJ63974AP</td><td></td></tr></tbody></table>

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של rnas העברה באמצעות macroarrays

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

העברת RNAs (tRNA) נמצאים בשפע קצר ללא קידוד RNA מינים שהם בדרך כלל 76 ל-90 נוקלאוטידים אורך. tRNAs אחראים ישירות על סינתזת החלבון על ידי מתרגם codons ב mRNA לתוך רצפים של חומצות אמיניות. tRNAs נחשבו זמן כמו מולקולות משק בית חסר פונקציות רגולטוריות. עם זאת, גוף גדל והולך של ראיות מציין כי רמות tRNA הסלולר משתנים בהתכתבות לתנאים משתנים כגון סוג התא, הסביבה מתח. התנודות של tRNA ביטוי השפעות ישירות ג'ין תרגום, העדפה או מדחיק את הביטוי של חלבונים מסוימים. בסופו של דבר בדיוק את הדינמיקה של סינתזת חלבונים מחייב בפיתוח שיטות מסוגל לספק פרופילים tRNA באיכות גבוהה. השיטה שבה אנו מציגים כאן נקרא המקום, אשר מייצג עבור פלטפורמה יעילה Observing tRNA. ספוט בנויות משלושה שלבים החל תיוג מטבולית של תרביות תאים עם האורטו רדיואקטיבי, ואחריו guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם החילוץ של RNAs הכולל רדיואקטיבי והודפס סוף סוף הכלאה-ללא צורך במיקור חוץ macroarrays. רמות tRNA מוערך על ידי לכימות עוצמות קרינה רדיואקטיבית בנקודה כל בדיקה. בפרוטוקול המובאת כאן אנחנו פרופיל tRNAs Mycobacterium smegmatis mc2155, חיידק nonpathogenic משמש לעתים קרובות כאורגניזם מודל כדי ללמוד שחפת.

שלושה ביולוגית עצמאית משכפל מראים כי, בכפוף לתנאים צמיחה שנבדקו, כל מ smegmatis tRNAs באים לידי ביטוי מעל פני רקע (איור 1). בניסוי מסוים זה, נצפתה סטיית התקן עבור כל בדיקה מורכבת בין 2% (Arg (TCT)) 22% (Cys (GCA)) עם חציון ב-5% (איור 1). שינויים שווא בין משכפל מושפעים באופן משמעותי גורמים כמו הכלאה והכנה של מערך. הפארמצבטית גבוהה מושגת באמצעות מערך זהיר ועקבית הדפסה, כמו גם אוטומטי מדגם הכלאה. יש הבדל 5-fold בין סינתזת איל (גת) ו- tRNA (Val (עיגול), המין הגבוה ביותר ושופע הנמוך ביותר בהתאמה. המקום מראה כי הביטוי של tRNA isoacceptors אינה אחידה. Isoacceptors הם מינים להחזיק את חומצת אמינו אותו אבל להציג רצפים שונים anticodon ופענוח ולכן שונים codons על mRNAs. לדוגמה, כל isoacceptors אלנין באים לידי ביטוי ברמות דומות, ואילו ארגינין הגבוהים והנמוכים ביותר tRNAs מקבל נבדלים מקופלים ל- 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> איור 1: נציג tRNA macroarray תוצאות. (א) שנסרקו בקטריאלי, העכבר, macroarrays האנושית. מ smegmatis מערכים להשתמש רק 43 הגששים במקום 48 על העכבר ועל האדם. כתוצאה מכך, המערך חיידקי מציג כתמים ריקים 40 (הגששים משוכפלים שמונה פעמים על כל מערך) כי להתמזג עם הרקע. רובם מקובצים בפינה השמאלית העליונה. (B) ייצוגים היסטוגרמה, heatmap פרופילי tRNA smegmatis מ בתנאים מיטביים לצמיחה. אותות לווין הממוצע של 3 ניסויים עצמאית (כולל התפתחות חיידקים, תיוג מטבולית, הכלאה החילוץ ית), באים לידי ביטוי לפי אלף ערכים של tRNAs הכולל. סטיות תקן עבור שלושה משכפל מסומנים קווי שגיאה, גוונים של כתום על ההיסטוגרמה, heatmap בהתאמה. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

אנו מתארים פלטפורמה ניתוח העברה RNA המקורי בשם ספוט (פלטפורמה יעילה להתבוננות tRNA). המקום בו זמנית מודד רמות התאית של כל tRNAs בדגימות ביולוגיות, רק שלושה צעדים, פחות מ-24 שעות.

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד בו זמנית את הרמות התאיות של כל ה-RNA המועבר בדגימות ביולוגיות על ידי שילוב של תיוג מטבולי in vivo עם ניתוח מקרו-מערך. רנ"א העברה נחשבו במשך זמן רב כמולקולות משק בית חסרות פונקציות רגולטוריות. עם זאת, גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך שרמות ה-tRNA התאיות משתנות בתגובה לתנאים משתנים כגון סוג התא, הסביבה והלחץ.התנודות בביטוי tRNA משפיעות ישירות על תרגום הגנים, ומעדיפות או מדכאות את הביטוי של חלבונים מסוימים. הבנת הדינמיקה של סינתזת חלבונים דורשת שיטות המסוגלות לספק פרופילי tRNA באיכות גבוהה. אנו מציגים כאן, טכניקה אמינה ופשוטה המאפשרת כימות מהיר ומדויק של רמות RNA העברה באורגניזמים שגודלו במעבדה.כדי להתחיל, בעזרת מחט בגודל 18, הנח חור בודד במרכז הכובע של צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר כדי לאפשר אוורור תקין. לאחר מכן, עם חמישה מיקרוליטרים של Mycobacterium smegmatis מתרבית התחלה ללילה, יש לחסן 500 מיקרוליטר של מרק 7H9 סטרילי בתוסף. בהתאם לשיטות ההגנה הסטנדרטיות מפני קרינה, יש להגדיל את אמצעי התרבות עם 20 מיקרוקוריות למיליליטר של אורתופוספט המסומן בזרחן-32.גדל חיידקים ב-37 מעלות צלזיוס ו-1,200 סל"ד, באינקובטור שייקר הממוקם מאחורי מגן אקרילי בעובי תשעה מילימטרים. בשלב האמצע, העבירו את כל התרבית לצינור מכסה בורג של שני מיליליטר, וגלולה חיידקים רדיואקטיביים בטמפרטורת החדר על ידי צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 10,000 למשך שתי דקות. אסוף את הסופרנטנט המכיל אורתופוספט רדיואקטיבי לא משולב במיכל פסולת מתאים.להכנת RNA כולל, הוסף מיליליטר אחד של מגיב מיצוי RNA מסחרי וכ-200 מיקרוליטר חרוזי זכוכית לגלולה. מכסה היטב את הצינור, ושבש את החיידקים בהומוגנייזר בתסיסה מקסימלית למשך שתי דקות. צנטריפוגה את הדגימה בכוח הכבידה פי 12,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של שני מיליליטר, והשליכו את החרוזים כראוי. הוסף 0.2 מיליליטר כלורופורם, ונער במרץ את הצינור ביד למשך 15 שניות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה בכוח הכבידה פי 12,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.אסוף את השלב המימי של הדגימה לצינור חדש על ידי זווית הצינור ב-45 מעלות. הימנע מציור כל אחד מהשכבה הבין-פאזית או האורגנית. הוסף שני מיקרוליטר של משקעים צבעוניים ו -0.5 מיליליטר של 100% איזופרופנול לשלב הימי.נענע את הצינור במרץ ביד למשך חמש שניות וצנטריפוגה שוב. הסר את הסופרנטנט מהשפופרת, והשליך אותו כראוי, מכיוון שהחלק הנוזלי עשוי להכיל עקבות של רדיואקטיביות. לאחר מכן, לאחר ייבוש הגלולה באוויר למשך חמש דקות, השעו אותה מחדש ב-200 מיקרוליטר של 2X SSC עם 0.1% משקל לנפח SDS.באמצעות מסד הנתונים הגנומי tRNA, תכנן בדיקות DNA על ידי אחזור רצפי tRNA או גנים מקודדי tRNA. לאחר חיתוך CCAs משומרים עם שלושה ראשוניים אם הם מקודדים ויוצרים את המשלים ההפוך, הזמינו בדיקות על סמך 70 הנוקלאוטידים הראשונים. כדי לבצע הדפסת מערך, הפשירו את הצלחת בעלת 96 הבארות בטמפרטורת החדר.בעזרת עט יהלום, סמן שקופיות זכוכית מצופות אמין. לאחר מכן, מקם את השקופיות ביחידת אינדקס. לאחר מיקומי הרשת, טבלו בזהירות את סיכות המשכפל בבארות.תוך שימוש בלחץ מינימלי, הדפס בעדינות את המערך על שקופיות הזכוכית. המשך להדפיס מבלי לנקות את המערך עד לסיום עם בלוק A.It דורש קצת תרגול כדי להיות מסוגל להדפיס באופן עקבי. אנו ממליצים להדפיס לא יותר משמונה עד 10 מערכים בכל הפעלה.ספור 10 עד 15 דקות לכל מערך. קל לאבד את המעקב אחר רצף דפוסי ההדפסה, לכן הקדישו את כל תשומת הלב שלכם למשימה וכבו את כל הסחות הדעת. כשמוכנים לעבור לבלוק הבא, טבלו את המשכפל באקונומיקה של 5% ונערו בעדינות.לחץ את המשכפל לתוך נייר סופג. לאחר מכן, טובלים את המשכפל במים מזוקקים, מנערים בעדינות ולוחצים לנייר. חזור על שלב זה פעם אחת.לאחר מכן, טבלו את המשכפל באיזופרופנול, נערו בעדינות ולחצו אותו לתוך הנייר. יבש את המשכפל על המאוורר למשך כ-20 שניות לפני שתעבור לבלוק הבא של צלחת 96 הבארות. המשך למספר ההדפסות הרצוי.לאחר מכן, הניחו לשקופיות להתייבש. הנח את השקופיות המיובשות עם הפנים כלפי מעלה על משטח נקי ב-254 ננומטר צולב UV. הגדר את רמת האנרגיה ל-999, 990 מיקרו-ג'אול לסנטימטר בריבוע, ולאחר מכן לחץ על התחל.העבירו את המערכים ל-450 מיליליטר של תמיסת חסימה, ודגרו אותם בטמפרטורת החדר על מערבל מגנטי, בתסיסה איטית למשך הלילה. שוטפים את המגלשות ב -500 מיליליטר מים מזוקקים בטמפרטורת החדר, פעמיים למשך חמש דקות כל אחת. יבש את השקופיות על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה מיקרו-מערך בטמפרטורת החדר למשך 10 שניות.אחסן את המערכים במקום יבש וחשוך עד שישה חודשים. לפני ההכלאה יש לשטוף את המגלשות במים רותחים ולייבש אותן באמצעות צנטריפוגה. הנח את המערך בתוך קלטת הכלאה, וטען את דגימת ה-RNA עם תווית הרדיו.הפעל את הדגימות בתחנת הכלאה-שטיפה אוטומטית לשחזור מקסימלי בהתאם לפרוטוקול הטקסט. בסוף הריצה יש לייבש את המגלשות באמצעות צנטריפוגה. עטפו שקופיות עם פלסטיק דק.לאחר מכן, השתמש במונה גייגר בהגדרה הרגישה ביותר שלו כדי לבדוק את השקופיות לאיתור אות רדיואקטיבי. חשוף את השקופיות על מסך זרחן אחסון בקלטת חשיפה בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 90 שעות, בהתאם לעוצמת האות. זמן חשיפה שיכול להימשך מספר שעות עד מספר ימים תלוי ישירות באות המערך.נדרש קצת תרגול כדי להיות מסוגל לתרגם את הספירה על מונה גייגר לזמן חשיפה. סרוק שקופית ברזולוציה של 50 מיקרומטר באמצעות מצלמת זרחן. כימות והפחתת עוצמות רדיואקטיביות ברקע בכל נקודת בדיקה באמצעות תוכנת ImageJ החינמית המשודרגת עם פרופיל מיקרו-מערך.צור מפות חום לפי פרוטוקול הטקסט. מוצגים כאן, מקרו-מערכי חיידקים, עכברים ובני אדם סרוקים. מערכי M.smegmatis משתמשים רק ב-43 בדיקות במקום 48 המשמשות לעכבר ולאדם.כתוצאה מכך, מערך החיידקים מציג 40 נקודות ריקות שמתמזגות עם הרקע. שלושה שכפולים ביולוגיים בלתי תלויים מראים כי בתנאי הגידול שנבדקו, כל M.smegmatis tRNAs באים לידי ביטוי מעל רמת הרקע. בניסוי הספציפי הזה, סטיית התקן הנצפית עבור כל בדיקה היא בין 2% ארגינין TCT ל-22% ציסטאין GCA כאשר החציון הוא 5%בנוסף, ניסוי זה מראה כי הביטוי של איזומקבלים tRNA אינו אחיד.לדוגמה, כל האיזו-מקבלי אלנין באים לידי ביטוי ברמות דומות, בעוד שה-tRNA הגבוה והנמוך ביותר המקבלים ארגינין שונים פי שלושה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-24 שעות אם היא מבוצעת כראוי ואם אות הנקודה מתאים. השיטה שלנו ישימה לכל אורגניזם שהגנום שלו זמין לתכנון בדיקה.אורגניזמים מודלים הגדלים במבחנה הם מועמדים אידיאליים לתיוג מטבולי. הפרוטוקול המוצג כאן מותאם ל-Mycobacterium smegmatis, אך הוא שימש בהצלחה גם לפרופיל tRNA ב-E.coli, שמרים, עכברים ותאים מתורבתים אנושיים. הטכניקה שלנו ניתנת לשחזור וספציפית.הטווח הדינמי הגדול והסף המתכוונן בקלות מאפשרים פרופיל של מינים בעלי שפע נמוך, כגון tRNAs הקשורים לפוליזומים, פשוט על ידי הארכת זמני החשיפה של המערך.

metabolic-labeling-and-profiling-of-transfer-rnas-using-macroarrays

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

סה"כ הסלולרי RNA מספק תבנית עניים לחקר שינויים קצרי טווח בסינתזה וריקבון RNA, כמו גם את הקינטיקה של רנ"א עיבוד. כאן, אנו מתארים תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד עם 4-thiouridine אחרי biotinylation תיאול ספציפי ולטיהור של RNA החדש שעבד ומאפשר להתגבר על המגבלות האלה.

סימון מטבולי של רנ&quot;א חדש עיבד לביטוי פרופיל גנטי רזולוציה גבוהה של הסינתזה רנ&quot;א, עיבוד וריקבון בתרבית תאים

מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכניקות שונות בקנה מידה גדולה.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

משואות bimolecular ratiometric (RBMBs) יכולות לשמש לתעתיקים בודדים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים. כאן, אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, מסירה של RBMBs לתוך תאים על ידי microporation ודימות פלואורסצנטי של מולקולות RNA אחת בזמן אמת.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

פיתחנו פרוטוקול מהיר, רגיש וניתן לשחזור לפרופיל ביטוי גנים פתוגני במהלך זיהום.

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על כימות ברמת הגנום של mRNA החדש מסונתז מטוהרים מתאי שמרים עם 4-thiouracil תוויות. שיטה זו מאפשרת למדוד את סינתזת mRNA חשיפות מהשחתה mRNA ומספק, לפיכך, מדידה מדויקת של RNA פולימראז II שעתוק.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

השימוש העצמי אורציל לטיהור ברגישות ובמיוחד לטהר את ה-RNA החדש שהועתק מן השמרים סכביסיטאה.

מהירה מאוד וספציפית תיוג מטבולי של RNA ב Vivo עם 4-Thiouracil (Ers4tU)

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר מדידת פלואורסצנציה כמותית לאורך החיים של גשושי ריבוגלו עבור תהליכי דימות RNA ניתנים לשחזור במבחנה, בתאי יונקים חיים, ובמודלים תלת-ממדיים תלת-ממדיים. אנו מתכננים תהליכי הכנת דגימות, אספקת גשושים, איסוף נתונים וניתוח כמותי להפקת מדידות חיים של פלואורסצנציה בלתי מוטה.

אפיון גשושי ריבוגלו במבחנה כבסיס להדמיה פלואורסצנטית לאורך חיים בתאים חיים ביונקים ובמודלים תלת-ממדיים של תאים

למד שיטת SPOt לתיוג מטבולי ויצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות macroarrays. השיטה מאפשרת מדידה סימולטנית של כל רמות ה-tRNA בתוך 24 שעות בלבד, ומספקת כלי אמין לחקר דינמיקת תרגום גנים וסינתזת חלבונים.

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

גלה סרטונים נוספים