Name: כימות של אוקסין אנדוגני, ציטוקינין במהלך Internode תרבות הוזמנתי למסיבה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: למדו כיצד לכמת רמות אוקסין וציטוקינין אנדוגניים במהלך היווצרות ניצנים שגשוגיים בצמחי ipecac באמצעות שיטת LC-MS/MS רגישה. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של דינמיקת פיטוהורמונים לחקר מנגנוני התחדשות רקמות צמחיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו אסירי תודה למורקאמי אקירה מר המחלקה של החיים יישומית באוניברסיטה Toyo, מר Koudai Taniguchi של מרכז טכנולוגיה לחקלאות גאנמה לסיוע טכני שלהם אנו אסירי תודה גם פרופסור Shosaku Kashiwada של ד ר Uma Maheswari מאיה לרר, Toyo האוניברסיטה לקבלת הצעות שלהם. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי המרכז לחקר החיים, מדעי הסביבה, אוניברסיטת Toyo.

הערה: איפקאק (ipecacuanha ג) שימש במחקר זה כי הוא מקל הניתוח של phytohormones אנדוגני.
1. צמיחה תנאים לזירוז יורה Adventitious הוזמנתי למסיבה
<ol><li>להכין ללא phytohormone B5 בינוני להתאים ל- pH 5.710והוסיפו החניכיים gellan 0.2%. לחטא על-ידי autoclaving.</li>
	<li>שופכים 25 מ של המדיום בלוק לתוך צלחת פטרי סטריליות (90 מ"מ × 20 מ"מ).</li>
	<li>לחתוך קטעים internodal 8 מ מ של שתילי איפקאק באמצעות אזמל כירורגי עם להב מס 22 על מגש אקריליק סטרילי, ומניחים על המדיום (איור 1).</li>
	<li>תרבות ללא phytohormone B5 בינוני ב 24 ° C תחת 15 µmol מ'−2 s− 1 של אור במחזור 14-h אור/10-h כהה למשך 5 שבועות.</li>
	<li>לזהות אזורים אני (הפסגה) הרביעי (הבסיס) כל קטע (איור 1B). לספור את מספר יורה adventitious > 0.3 מ מ אורך בכל אזור תחת מיקרוסקופ פעם בשבוע.</li>
</ol>2. מיצוי וטיהור של Phytohormones
<ol><li>מכניסים כל אחד הצינורות מדגם 2-mL ארבע חרוז קריסטל 5 מ מ.</li>
	<li>חותכים את מקטעי אזורים אני הרביעי (לכל אורך ממ ב 2) באמצעות אזמל כירורגי על מגש אקריליק סטרילי.</li>
	<li>לאסוף שמונה מקטעים של כל אזור נפרד מדגם צינורות (10-30 מ"ג טריים משקל).</li>
	<li>שוקל, לאחר מכן להקפיא את הדגימות של חנקן נוזלי.</li>
	<li>לרסק את הדגימות קפוא באמצעות מהמגן המבוסס על חרוז.</li>
	<li>להשעות את הדגימות כתוש ב 1 מ"ל acetonitrile המכילות 500 pg של כל תקן פנימי של אוקסין ואת הגרביים (ד5- רשות העתיקות, d5- ט ז, ד5- תצרוכת, ד6- iP, ד6- ריבית) באמצעות מערבל מערבולת.</li>
	<li>להחזיק ב 4 ° C עבור 1 h ולאחר מכן צנטריפוגה-3,500 × g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את צניפה ב- 80% (v/v) acetonitrile המכיל חומצה אצטית 1% (v/v). צנטריפוגה שוב ב 3,500 × g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשלב את supernatants (מתוך שלבים 2.7 ו- 2.8) שפופרת זכוכית חד פעמיות.</li>
	<li>להוסיף 600 µL מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v) כל תגובת שיקוע משולב, והם מתאדים את acetonitrile באמצעות רכז ואקום.</li>
	<li>Equilibrate הידרופיליות-lipophilic-מאוזן מחסניות עמודה (HLB) על-ידי החלת 1 מ"ל כל של acetonitrile, מתנול מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v).</li>
	<li>להחיל פתרון אחד מדגם מכל מחסנית HLB equilibrated.</li>
	<li>לשטוף את מכלי הדיו עם 1 מ"ל מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v).</li>
	<li>Elute הורמונים כל עם 2 מ ל 80% (v/v) acetonitrile המכיל 1% (v/v) חומצה אצטית שפופרת זכוכית.</li>
	<li>להתנדף את acetonitrile, eluate כדי לקבל תמצית במים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v) באמצעות רכז ואקום. הערה: לא יבש זה לחלוטין.</li>
	<li>Equilibrate מחסניות העמודה מצב מעורב, חזק-קטיון (MCX) על-ידי החלת acetonitrile 1 מ"ל, 1 מ"ל מתנול, 0.5 מ"ל 0.1 M HCl ו 1 מ"ל מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v).</li>
	<li>להחיל פתרון אחד מדגם מכל מחסנית MCX equilibrated.</li>
	<li>לשטוף את מכלי הדיו עם 1 מ"ל מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v).</li>
	<li>Elute רשות העתיקות עם 2 מ ל 30% (v/v) acetonitrile המכיל 1% (v/v) חומצה אצטית שפופרת זכוכית.</li>
	<li>לשטוף את מכלי הדיו עם 2 מ ל 80% (v/v) acetonitrile המכיל חומצה אצטית 1% (v/v).</li>
	<li>לשטוף את מכלי הדיו עם 2 מ"ל מים ו- 1 מ"ל מים המכילים אמוניה מימית 5%.</li>
	<li>Elute את הגרביים עם 2 מ ל 60% (v/v) acetonitrile המכילים אמוניה מימית 5% שפופרת זכוכית.</li>
	<li>להתאדות הממיס של כל שבר הורמון באמצעות רכז ואקום ולאחסן ב −30 ° C עד הניתוח LC-MS/MS.</li>
</ol>3. LC-MS/MS ניתוח של רשות העתיקות ואת הגרביים
<ol><li>להמיס כל תמצית הורמון בשפופרת עם 600 µL של מתנול ולהעביר את הפתרון בקבוקון התאוששות מוחלטת של הצוואר בורג. להתנדף הממס באמצעות רכז ואקום.</li>
	<li>להמיס את השבר רשות העתיקות ב 20 µL 30% (v/v) acetonitrile, ושברים CK במים 20 µL המכיל 1% (v/v) חומצה אצטית ב בורג הצוואר התאוששות מוחלטת בקבוקונים.</li>
	<li>לנתח את הדגימות במצב יון חיובי על מערכת MS טריפל-פאול מצויד עם מערכת HPLC. הערה: אנו הגדרת התנאים HPLC כמפורט בטבלה1.<ol>
<li>עבור • תנאי רשות העתיקות, להשתמש הדרגתי בינארי של 5% - 50% ממס B יותר מ 7 דקות, ואז להגדיל על ידי 98% ממס B להחזיק 1 דקות ו ואז equilibrate למשך 2 דקות ב 5% ממס B בזריקה הקן.</li>
		<li>לשימוש • תנאי CK, שיפוע בינארי של 2% - 40% ממס B מעל 5 דקות, 40-70% ממס B ב- 7 דקות, ואז להגדיל על ידי 95% ממס B להחזיק 1 דקות, ואז equilibrate למשך 2 דקות ב 2% ממס B על ידי לקנן הזרקה.</li>
		<li>הגדר את יינון ספקטרומטריית electrospray (ESI)-MS פרמטרים של יון מקור כמפורט בטבלה מס ' 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש התגובה מרובים ניטור (MRM) המעבר על כימות של כל analyte המופיעה בטבלה 3.</li>
	<li>לכמת רשות העתיקות אנדוגני ורמות CK מפני עיקול רגיל של היחס בין ללא תווית התווית על-ידי דאוטריום תקנים.</li>
</ol>

<ol><li>Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).</li>
<li>Skoog, F., Miller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+regulation+of+growth+and+organ+formation+in+plant+tissues+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Symp+Soc+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro.</a> Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).</li>
<li>Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. <a target="_blank" href="NULL">Transgenic plants and crops</a>. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).</li>
<li>Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+emetic+alkaloid+by+in+vitro+culture+of+Cephaelis+ipecacuanha%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).</li>
<li>Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. <a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Cultivation-Utilization-Medicinal-Plants-Kapur/dp/B001I6AQI6">Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research</a>. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).</li>
<li>Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/0167-7799(94)90092-2">Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).</li>
<li>Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24241769">Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).</li>
<li>Yoshimatsu, K., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+shoot+formation+on+internodal+segments+and+alkaloid+formation+in+the+regenerates+of+Cephaelis+ipecacuanha+A.+Richard%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard.</a> Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).</li>
<li>Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00344-017-9684-8">Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac.</a> J. Plant Growth Regul. , (2017).</li>
<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).</li>
<li>Watad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304423896008746">Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures.</a> Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).</li>
<li>Ajithkumar, D., Seeni, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s002990050418">Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree.</a> Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).</li>
<li>Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1010652006417">Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).</li>
<li>Rao, M. S., Purohit, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10535-006-0079-0">In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd.</a> Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).</li>
<li>Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9050-6">TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+negatively+regulates+cell+death+by+controlling+NPR1-dependent+salicylic+acid+signaling+during+senescence+and+the+innate+immune+response+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).</li>
<li>Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin-yang+of+hormones%3A+cytokinin+and+auxin+interactions+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development.</a> Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם שאין ניגודי אינטרסים.

כדי לזהות את ההפצה של phytohormones מעורב organogenesis, חשוב להשתמש בחומרים המפעל שבו organogenesis יכול להיות שנצפו על ללא phytohormone בינוני, כי כאשר phytohormones exogenously חלות explants להשראת יורה או שורשים, הם משפיעים על כל explant, ולכן קשה להעריך את פלסטיות הטבועה של צמחים תאית התמיינות, organogenesis. נצרי adventitious יכולה להיגרם על phytohormone ללא התקשורת תרבות מינים אחרים כגון ל' ציפורן caryophyllus 11Corrêa Aegle marmelos (ל')12, Pennell...

Haberlandt גוטליב (1854-1945) הציע את הרעיון של "totipotency", על ידי הצמח אילו תאים יכולים לחלק, להבדיל, והפק צמחים שלמים גם לאחר בידול מוקדמת שלהם לתוך תאים מסוים סוגי שתילים בוגרים1. בתרבות רקמה, אם התחדשות הצמח יכולה להיגרם או לא נקבעת על ידי שילוב של ריכוז phytohormones exogenously יישומית במצע הגידול. Skoog ומילר מצא כי נצרי adventitious יכולים להיגרם מן קסם טבק באמצעי תרבות המכיל יחס גבוה של הגרביים כדי auxins, ואילו שורשים adventitious יכולים להיגרם על בינוני המכיל יחס נמוך2. מאז הממצאים, תרביות רקמה כבר בשימוש נרחב על התפשטות של הגידולים החקלאיים כלכלית ועל לרגנרציה של הצמחים הטרנסגניים3. נצרי adventitious יכולה להיגרם רקמות חוץ meristem apical לירות, כגון עלים, שורשים, פרקי הגבעולים. Phytohormone טיפול נדרש אינדוקציה של נצרי adventitious של רוב מיני צמחים. עם זאת, ריכוז אופטימלי ושילובים שונים על ידי מינים ובקרב רקמות משמש explants. כך, מאמץ רב נכנס לקביעת ריכוזים מיטביים של שילובים של phytohormones לניסויים.
Carapichea ipecacuanha (ברוט.) ל' אנדרסון (איפקאק) הוא צמח מרפא המכיל אלקלואידים כגון emetine ו- cephaeline, ובעיקר השורשים4. תמציות בסיס משמשים ומכייח, של כל ו של amoebicide5. למרות איפקאק גדל באופן טבעי הגשם הטרופיים של ברזיל, זה מסרבים להגדיר זרעים בתרבות, מקטינה שיעור הנביטה במהלך האחסון זרע ביפן, עם אקלים קר שלה6. במקום זאת, זה הופץ על ידי תרביות רקמה, אשר adventitious לירות7,השיטה היעילה ביותר8הוא היווצרות על פרקי הגבעולים. מעניין, יורה adventitious יכולה להיגרם במין זה ללא טיפול phytohormone8.
נצרי adventitious נוצרות על האפידרמיס באזור הפסגה של מקטעי internodal ללא callusing, אך לא את הבסיס באזור9. הבדל זה מציין קוטביות רקמות בקטעים internodal, שהוא כנראה לפי תקנה phytohormonal. מערכת התרבות איפקאק מאפשר הזדמנות ייחודית לנתח את השינויים ברמות phytohormone אנדוגני במהלך היווצרות לירות adventitious. כאן אנו מציגים שלנו שיטה לניתוח של רמות אנדוגני של אחד אוקסין (חומצה אינדול-3-אצטית (רשות העתיקות)) ואת הגרביים ארבע (isopentenyl אדנין (iP), isopentenyl אדנין riboside (ריבית), טרנס-zeatin (ט ז), טרנס-zeatin riboside (תצרוכת)) בקטעים internodal באמצעות LC-MS/MS.

<table><tbody><tr><td>[2H5] חומצה אינדול-3-אצטית</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>031 1531</td><td>תקן פנימי עבור LC-MS / MS</td></tr> <tr><td>[2H5] טרנס-זיאטין</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0301</td><td>תקן פנימי עבור LC-MS / MS</td></tr> <tr><td>[2H5] טרנס-זיאטין ריבוזיד</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0311</td><td>תקן פנימי עבור LC-MS / MS</td></tr> <tr><td>[2H6] N6-isopentenyl adenine</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0161</td><td>תקן פנימי עבור LC-MS / MS</td></tr> <tr><td>[2H6] N6-isopentenyl adenosine</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0171</td><td>תקן פנימי עבור LC-MS /</td></tr><tr><td>MS אינדול-3-חומצה אצטית</td><td>Wako</td><td>098 00181</td><td>תקן עבור LC-MS / MS</td></tr><tr><td>טרנס-זיאטין</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z0876 תקן 5MG</td><td>עבור LC-MS /</td></tr><tr><td>MS טרנס-זיאטין ריבוזיד</td><td>Wako</td><td>262 01081</td><td>תקן עבור LC-MS / MS</td></tr><tr><td>N6-isopentenyl אדנין</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D7674 תקן 1G</td><td>עבור LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-isopentenyl אדנוזין</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>22648 1000</td><td>תקן עבור LC-MS/MS</td></tr><tr><td>אצטוניטריל היפרגראד עבור LC-MS LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.00029.1000</td><td>ממס עבור LC-MS/</td></tr><tr><td>MS מים לכרומטוגרפיה LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.15333.1000</td><td>ממס עבור LC-MS/MS</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>SHIMADZU</td><td>בולטות</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Sciex</td><td>3200QTRAP</td><td></td></tr><tr><td>אואזיס HLB 30 מ"ג/1 סמ"ק</td><td>ווטרס</td><td></td><td>WAT094225 עמודת מחסנית</td></tr><tr><td>אואזיס MCX 30 מ"ג/1 סמ"ק</td><td>מחסנית מים</td><td>186000252</td><td>עמוד</td></tr><tr><td>בורג צוואר בקבוקון התאוששות כולל בקבוקון ווטרס</td><td></td><td></td> כחול 186002805<td></td></tr><tr><td>, 12 x 32 מ"מ מכסה צוואר בורג ומחיצת PTFE/סיליקון</td><td>מים</td><td></td><td></td>186000274</tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 מ"מ</td><td>ווטרס</td><td>186002350</td><td>עמודת UPLC</td></tr><tr><td>Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 מ"מ</td><td>Agilent</td><td>699775-902</td><td>עמודת UPLC</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיגיטלי</td><td>Leica</td><td>DHS1000</td><td></td></tr><tr><td>רקמות Lyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי</td><td>נוצה</td><td>מס' 22</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל</td><td>נוצה</td><td>מס' 4</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac/מלכודת אדים מחודשת</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD111/RVT4104</td><td>רכז ואקום</td></tr><tr><td>טופ זכוכית חד פעמי (13x100 מ"מ)</td> <td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>סטרילית INA OPTICA</td><td>I-90-20</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות של אוקסין אנדוגני, ציטוקינין במהלך internode תרבות הוזמנתי למסיבה

Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac

לירות adventitious צורה היא טכניקה חשוב התפשטות של הגידולים החקלאיים כלכלית ועל לרגנרציה של הצמחים הטרנסגניים. Phytohormone טיפול נדרש אינדוקציה של נצרי adventitious של רוב המינים. אם יורה adventitious יכולה להיגרם נקבעת על-ידי האיזון בין אוקסין ציטוקינין (CK) רמות. מאמץ רב נכנס לקביעת ריכוזים מיטביים ושילובים של phytohormones כל רקמה משמש explants, כל מיני צמחים. ב. הוא אדם חכם, עם זאת, יורה adventitious יכולה להיגרם במקטעים internodal תרבות בינוני ללא טיפול phytohormone. פעולה זו מאפשרת את פלסטיות הגלום הוזמנתי למסיבה עבור תאית התמיינות להערכה. לזירוז יורה adventitious, הוזמנתי למסיבה, אנחנו תרבותי מקטעים internodal ב 24 ° C תחת 15 µmol מ'−2 s− 1 של אור במחזור 14-h אור/10-h כהה. ללא phytohormone B5 בינוני פני השטח למוצק עם מסטיק gellan 0.2% למשך 5 שבועות. לחקור phytohormone dynamics במהלך היווצרות לירות adventitious, מדדנו אנדוגני חומצה אינדול-3-אצטית ואת הגרביים בתוך המקטעים באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית LC-MS/MS. שיטה זו מאפשרת ניתוח של חומצה אינדול-3-אצטית אנדוגני ורמות הגרביים בדרך פשוטה. ניתן להחיל אותה לחקור את הדינמיקה של אוקסין אנדוגני, CK במהלך organogenesis של מיני צמחים אחרים.

1 בשבועst , יורה adventitious לא יצרו. השבוע 2nd , הופיע נצרי קטן. את 3rd ו 4 שבועותth , המספר יורה מוגברת בעיקר באזורי הפסגה (I ו- II) (איור 2א). בשבועה 5, המספר של נצרי היה כ- 7 בתוך אזור אני 5 באזור השני (איור 2B). לעומת זאת, רק כמה נצרי נוצרו באזורים III ו- IV.
לפני תרבות, רמת ר...

נצרי adventitious יכולה להיגרם במקטעים internodal הוזמנתי למסיבה ללא טיפול phytohormone. כדי להעריך את הדינמיקה phytohormone במהלך היווצרות לירות adventitious, מדדנו אוקסין אנדוגני, ציטוקינין בקטעים internodal על-ידי LC-MS/MS.

כימות של אוקסין אנדוגני, ציטוקינין במהלך Internode תרבות הוזמנתי למסיבה

Adventitious shoot formation is an important technique for the propagation of economically important crops and for the regeneration of transgenic plants. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר כיצד רמות פיטוהורמונים אנדוגניים משתנות במהלך היווצרות יורה הרפתקנית באיפקק. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות להתחדשות רקמות בגלגל תרבית רקמות הצמח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הרמה האנדוגנית של חומצה אינדול-3-אצטית וניתן לנתח ציטוקינינים ברגישות גבוהה.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לאורך כל הקמת ניוון רקמת הצמח מכיוון ששינויים ברמת הפיטוהורמונים האנדוגניים מעוררים היווצרות יורה הרפתקנית. כדי להתחיל, הכינו מדיום B5 נטול פיטוהורמונים והוסיפו 0.2 אחוז מסטיק גלאן. לאחר מכן, חיטוי המדיום כדי לעקר אותו.בעזרת אזמל כירורגי על צלחת אקרילית סטרילית, פורסים מקטעים פנימיים של שמונה מילימטר של שתילי איפקק ומניחים אותם על המדיום. לאחר מכן, תרבית את מקטעי האיפקאק ב-24 מעלות צלזיוס מתחת ל-15 מיקרומול למטר רבוע של שניות אור במחזור אור של 14 שעות ו-10 שעות חושך למשך חמישה שבועות. לאחר תרבית מקטעי האיפקאק, זהה אזורים אחד עד ארבעה בכל מקטע.פעם בשבוע, השתמש במיקרוסקופ כדי לספור את מספר הקלעים ההרפתקניים בכל אזור. ראשית, הנח חרוז זירקוניה של חמישה מילימטר לתוך ארבעה צינורות דגימה של שני מיליליטר. לאחר מכן, השתמש באזמל כירורגי על צלחת אקרילית סטרילית כדי לחתוך את מקטעי האיפקאק לאזורים I עד IV. לאחר מכן אסוף שמונה מקטעים מכל אזור לצינור דגימה אחד.שקלו כל אחת מהדגימות והקפיאו אותן בחנקן נוזלי. לאחר מכן, השתמש בהומוגנייזר מבוסס חרוזים כדי לרסק את הדגימות הקפואות. השתמש במערבל מערבולת כדי להשעות את הדגימות במיליליטר אחד של האצטוניטריל עם 500 פיקוגרם מכל תקן פנימי של שוורים ו-CKs.הביתה את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. ואז צנטריפוגה את הדגימות ב -3500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים את הגלולה ב-80 אחוז ניטריל אצטל עם אחוז אחד של חומצה אצטית.לאחר מכן חזור על הצנטריפוגה והשתמש בצינור חד פעמי כדי לשלב את הסופרנטנטים. הוסף 600 מיקרוליטר מים עם אחוז אחד של חומצה אצטית לסופרנטנט המשולב. לאחר מכן השתמש ברכז ואקום כדי לאדות את הניטריל האצטי.טען את פתרונות הדגימה למחסניות HLB מאוזנות בודדות. ושוטפים את המחסניות במיליליטר מים עם אחוז אחד של חומצה אצטית. ואז רמז לכל ההורמונים עם שני מיליליטר של 80 אחוז אצטיל ניטריל עם אחוז אחד של חומצה אצטית בצינור זכוכית.בעזרת רכז ואקום, מאדים את ניטריל האצטל לקבלת תמצית במים עם אחוז אחד של חומצה אצטית. טען את תמיסות הדגימה למחסניות MCX מאוזנות בודדות ושטוף את המחסניות במיליליטר מים עם אחוז אחד של חומצה אצטית. לאחר מכן רמז IAA בצינור זכוכית, עם שני מיליליטר של 30 אחוז ניטריל אצטל עם אחוז אחד של חומצה אצטית.לאחר מכן שטפו את המחסניות בשני מיליליטר של 80 אחוז ניטריל אצטל עם אחוז אחד של חומצה אצטית. לאחר מכן, שטפו את המחסניות בשני מיליליטר מים ומיליליטר מים עם אמוניה מימית של חמישה אחוזים בתא טיוטה. רמז על ה-CKs בצינור זכוכית עם שני מיליליטר של 60 אחוז ניטריל אצטל עם חמישה אחוז אמוניה מימית בתא טיוטה.לאחר מכן השתמש ברכז ואקום כדי לאדות את הממס של כל חלק הורמון. מערבבים את הדגימות במינוס שלושים מעלות צלזיוס עד לניתוח LCMSMS. ראשית, ממיסים כל תמצית הורמונים בשפופרת עם 600 מיקרוליטר מתנול.לאחר מכן העבירו את התמיסה לבקבוקון התאוששות כולל עם צוואר בורג והשתמשו ברכז ואקום כדי לאדות את הממס. ממיסים את שבר ה-IAA ב-20 מיקרוליטר של 30 אחוז אצטל ניטריל ואת שברי ה-CK ב-20 מיקרוליטר מים עם אחוז אחד של חומצה אצטית. לאחר מכן השתמש במערכת MS משולשת מרובעת המצוידת במערכת HPLC כדי לנתח את הדגימות במצב יונים חיוביים.לבסוף לכמת IAA אנדוגני ברמות CK מול עקומה סטנדרטית של היחס של תקני תווית ללא תווית דאוטריום. בפרוטוקול זה נמדד ציטוקינין מחמצן אנדוגני במצנחים הרפתקניים באמצעות LCMSMS במשך חמישה שבועות. בשבוע הראשון לא נוצרו מצנחים הרפתקניים והמצנחים הקטנים הראשונים הופיעו במהלך השבוע השני.במהלך השבועות השלישי והרביעי, מספר המצנחים גדל בעיקר בעוצר הראשון והשני. במהלך השבוע החמישי מספר המצנחים היה בערך שבעה באזור 1, ו-5 באזור 2. לפני התרבות, רמת רשות העתיקות הייתה מעט גבוהה יותר באזור 1 מאשר באזורים 2, 3 ו-4.בשבוע הראשון רמת רשות העתיקות עלתה מאוד באזור 4, וירדה מעט באזורים 1, 2 ו-3. לאחר חמישה שבועות של תרבית הופיע שיפוע ריכוז IAA. עם עלייה ברמות מאזור אחד לאזור ארבע.לפני התרבות, היו רק רמות עקבות של רוב ה-CKs. בשבוע הראשון, רמת ה-tZR עלתה ל-13.8 פיקוגרם למיליגרם באזור השני. ו-18.1 פיקוגרם למיליגרם באזור שלוש.לעומת זאת, רמות tZ, iP ו-iPR השתנו רק במעט במהלך התרבית. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור שהורמון החלק האנדוגני יציב. לאחר שפיתחה את האדם, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום תרבית רקמות צמחים.לחקור היווצרות הרפתקנית באורגניזמים אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח חומצה אנדוגנית אינדול-3-אצטית וציטוקינינים.

quantification-endogenous-auxin-cytokinin-during-internode-culture

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

סרטון זה מדגים את בדיקת עיכוב צמיחת השתיל בצמח Arabidopsis thaliana . ההשפעה של ריכוז מוגבר של פפטיד חיסוני מעורר על צמיחת שתילים נקבעת.

מדידת עיכוב של צמיחת שתילים על ידי מערכת החיסון

מערכת השראת השורש הרוחבי (LRIS) מאפשרת אינדוקציה סינכרונית של שורשים לרוחב ומוצגת עבור Arabidopsis thaliana ותירס.

מערכת עין מתנהל שורש לרוחב ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; ותירס

הפרוטוקולים המתוארים כאן מקלים על החקירה הנוחה של תגובות אתילן חיידקיות על ידי שימוש בחומצה 2-כלורואתילפוספונית (CEPA).  אתילן מיוצר באתרו באמצעות פירוק CEPA במצע גידול חיידקים מימי, תוך עקיפת הדרישה לגז אתילן טהור.

ניצול במגרש משחררים אתילן, 2-Chloroethylphosphonic חומצה, ככלי לחקר תגובה אתילן בחיידקים

מערכת cocultivation הידרופוני שתואר תומך צמחים שלם עם מסכי רשת מתכת cocultivates אותם עם חיידקים. רקמות הצמח, חיידקים, ומולקולות מופרדים אז ניתן לקצור בנפרד עבור ניתוחים במורד הזרם, בו זמנית מאפשר תגובות מולקולריות של שני המארחים צמח אינטראקציה חיידקים או microbiomes להיחקר.

הידרופוני Co- טיפוח מערכת לניתוח סימולטני ושיטתי של הצמח / מיקרובי אינטראקציות מולקולרית איתות

הפרוטוקול המתואר במסמך זה היא שיטה למדידת endoreduplication בתוך פקעות של תפוחי אדמה (סולנום יכולת להתקשר אלי). הוא כולל פעולות החילוץ פלסמוליזה ו פרוטופלאסט כדי להקטין את רעש ופסולת בניתוח cytometric במורד הזרם.

מדידת Endoreduplication על ידי Cytometry זרימה של פקעת מבודד Protoplasts

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ביעילות ובמיוחד לרוקן חלבון של עניין השמרים סכביסיטאה cerevisiae ס באמצעות מערכת העזרה β-est.

כוונון הירידה כדי להשיג חלבון ספציפי ויעיל המחסור

אנו מספקים שיטה לזיהוי מודולים של דיות שקרנים על ידי הקרנת בקנה מידה גדול של ספריה מורכבת.

זיהוי של הרגולטורים הרומן של דיות צמח על ידי הקרנת הדמיה תרמית בקנה מידה גדול בהליוציץ השנתי

כאן אנו מתארים חילופי אניון חזקים כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים של [3H]-מיו-אינוזיטול תווית שתילים אשר היא שיטה רגישה מאוד כדי לזהות ולכומת פוליפוספטים אינוזיטול בצמחים.

מיצוי וכימות של פוליפוספטים לאנוזיטול מסיסים עם תיבול רדיו ממין צמחי שונים באמצעות SAX-HPLC

מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפ ללא שימוש בקליפות אפידרמיס כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות הסטומטלית. השיטה הראשונה מדגימה כיצד לנתח פנוטיפ סטומטלי באמצעות אפידרמיס צמחי מוכתם O כחול טולוידין. השיטה השנייה מתארת כיצד לזהות ליגנדות סטומטיות ולנטר את פעילותן הביולוגית.

זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי

במאמר זה אנו מתארים כלי מתקדם המיועד לניטור ביוסינתזה של כלורופיל בשלבים המוקדמים של דה-אטיולציה של שתילי ארבידופסיס . המתודולוגיה החדשנית מספקת דימות פלואורסצנטי כלורופיל לא פולשני בזמן אמת ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.

בדיקה לא פולשנית לביוסינתזה של כלורופיל קביעת קינטיקה בשלבים מוקדמים של דה-אטיולציה של ארבידופסיס

למדו כיצד לכמת רמות אוקסין וציטוקינין אנדוגניים במהלך היווצרות ניצנים שגשוגיים בצמחי ipecac באמצעות שיטת LC-MS/MS רגישה. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של דינמיקת פיטוהורמונים לחקר מנגנוני התחדשות רקמות צמחיות.

כימות של אוקסין אנדוגני, ציטוקינין במהלך Internode תרבות הוזמנתי למסיבה

גלה סרטונים נוספים