כימות של אוקסין אנדוגני, ציטוקינין במהלך Internode תרבות הוזמנתי למסיבה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר כיצד רמות פיטוהורמונים אנדוגניים משתנות במהלך היווצרות יורה הרפתקנית באיפקק. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות להתחדשות רקמות בגלגל תרבית רקמות הצמח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הרמה האנדוגנית של חומצה אינדול-3-אצטית וניתן לנתח ציטוקינינים ברגישות גבוהה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לאורך כל הקמת ניוון רקמת הצמח מכיוון ששינויים ברמת הפיטוהורמונים האנדוגניים מעוררים היווצרות יורה הרפתקנית. כדי להתחיל, הכינו מדיום B5 נטול פיטוהורמונים והוסיפו 0.2 אחוז מסטיק גלאן. לאחר מכן, חיטוי המדיום כדי לעקר אותו.

בעזרת אזמל כירורגי על צלחת אקרילית סטרילית, פורסים מקטעים פנימיים של שמונה מילימטר של שתילי איפקק ומניחים אותם על המדיום. לאחר מכן, תרבית את מקטעי האיפקאק ב-24 מעלות צלזיוס מתחת ל-15 מיקרומול למטר רבוע של שניות אור במחזור אור של 14 שעות ו-10 שעות חושך למשך חמישה שבועות. לאחר תרבית מקטעי האיפקאק, זהה אזורים אחד עד ארבעה בכל מקטע.

פעם בשבוע, השתמש במיקרוסקופ כדי לספור את מספר הקלעים ההרפתקניים בכל אזור. ראשית, הנח חרוז זירקוניה של חמישה מילימטר לתוך ארבעה צינורות דגימה של שני מיליליטר. לאחר מכן, השתמש באזמל כירורגי על צלחת אקרילית סטרילית כדי לחתוך את מקטעי האיפקאק לאזורים I עד IV. לאחר מכן אסוף שמונה מקטעים מכל אזור לצינור דגימה אחד.

שקלו כל אחת מהדגימות והקפיאו אותן בחנקן נוזלי. לאחר מכן, השתמש בהומוגנייזר מבוסס חרוזים כדי לרסק את הדגימות הקפואות. השתמש במערבל מערבולת כדי להשעות את הדגימות במיליליטר אחד של האצטוניטריל עם 500 פיקוגרם מכל תקן פנימי של שוורים ו-CKs.

הביתה את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. ואז צנטריפוגה את הדגימות ב -3500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים את הגלולה ב-80 אחוז ניטריל אצטל עם אחוז אחד של חומצה אצטית.

לאחר מכן חזור על הצנטריפוגה והשתמש בצינור חד פעמי כדי לשלב את הסופרנטנטים. הוסף 600 מיקרוליטר מים עם אחוז אחד של חומצה אצטית לסופרנטנט המשולב. לאחר מכן השתמש ברכז ואקום כדי לאדות את הניטריל האצטי

טען את פתרונות הדגימה למחסניות HLB מאוזנות בודדות. ושוטפים את המחסניות במיליליטר מים עם אחוז אחד של חומצה אצטית. ואז רמז לכל ההורמונים עם שני מיליליטר של 80 אחוז אצטיל ניטריל עם אחוז אחד של חומצה אצטית בצינור זכוכית.

בעזרת רכז ואקום, מאדים את ניטריל האצטל לקבלת תמצית במים עם אחוז אחד של חומצה אצטית. טען את תמיסות הדגימה למחסניות MCX מאוזנות בודדות ושטוף את המחסניות במיליליטר מים עם אחוז אחד של חומצה אצטית. לאחר מכן רמז IAA בצינור זכוכית, עם שני מיליליטר של 30 אחוז ניטריל אצטל עם אחוז אחד של חומצה אצטית.

לאחר מכן שטפו את המחסניות בשני מיליליטר של 80 אחוז ניטריל אצטל עם אחוז אחד של חומצה אצטית. לאחר מכן, שטפו את המחסניות בשני מיליליטר מים ומיליליטר מים עם אמוניה מימית של חמישה אחוזים בתא טיוטה. רמז על ה-CKs בצינור זכוכית עם שני מיליליטר של 60 אחוז ניטריל אצטל עם חמישה אחוז אמוניה מימית בתא טיוטה.

לאחר מכן השתמש ברכז ואקום כדי לאדות את הממס של כל חלק הורמון. מערבבים את הדגימות במינוס שלושים מעלות צלזיוס עד לניתוח LCMSMS. ראשית, ממיסים כל תמצית הורמונים בשפופרת עם 600 מיקרוליטר מתנול.

לאחר מכן העבירו את התמיסה לבקבוקון התאוששות כולל עם צוואר בורג והשתמשו ברכז ואקום כדי לאדות את הממס. ממיסים את שבר ה-IAA ב-20 מיקרוליטר של 30 אחוז אצטל ניטריל ואת שברי ה-CK ב-20 מיקרוליטר מים עם אחוז אחד של חומצה אצטית. לאחר מכן השתמש במערכת MS משולשת מרובעת המצוידת במערכת HPLC כדי לנתח את הדגימות במצב יונים חיוביים.

לבסוף לכמת IAA אנדוגני ברמות CK מול עקומה סטנדרטית של היחס של תקני תווית ללא תווית דאוטריום. בפרוטוקול זה נמדד ציטוקינין מחמצן אנדוגני במצנחים הרפתקניים באמצעות LCMSMS במשך חמישה שבועות. בשבוע הראשון לא נוצרו מצנחים הרפתקניים והמצנחים הקטנים הראשונים הופיעו במהלך השבוע השני.

במהלך השבועות השלישי והרביעי, מספר המצנחים גדל בעיקר בעוצר הראשון והשני. במהלך השבוע החמישי מספר המצנחים היה בערך שבעה באזור 1, ו-5 באזור 2. לפני התרבות, רמת רשות העתיקות הייתה מעט גבוהה יותר באזור 1 מאשר באזורים 2, 3 ו-4.

בשבוע הראשון רמת רשות העתיקות עלתה מאוד באזור 4, וירדה מעט באזורים 1, 2 ו-3. לאחר חמישה שבועות של תרבית הופיע שיפוע ריכוז IAA. עם עלייה ברמות מאזור אחד לאזור ארבע.

לפני התרבות, היו רק רמות עקבות של רוב ה-CKs. בשבוע הראשון, רמת ה-tZR עלתה ל-13.8 פיקוגרם למיליגרם באזור השני. ו-18.1 פיקוגרם למיליגרם באזור שלוש.

לעומת זאת, רמות tZ, iP ו-iPR השתנו רק במעט במהלך התרבית. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור שהורמון החלק האנדוגני יציב. לאחר שפיתחה את האדם, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום תרבית רקמות צמחים.

לחקור היווצרות הרפתקנית באורגניזמים אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח חומצה אנדוגנית אינדול-3-אצטית וציטוקינינים.