Name: דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: למד שיטה יעילה להפקת נוירונים מושרים מפיברובלסטים עור מבוגרים תוך 25 יום. שיטה זו מאפשרת מידול מחלות נוירולוגיות תוך שמירה על גיל התאים המקוריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מארי פרסון Vejgården לקבלת סיוע טכני. המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון קרן תאי גזע בניו-יורק, המועצה האירופית למחקר תחת תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי: FP 2007-2013 נוירו תאי גזע (מספר 602278) ותיקון הסכם גרנט ERC אין. 30971, המועצה למחקר השבדי (להעניק הסכם 521-2012-5624, 2016-00873 ו- 70862601 / Bagadilico), פרקינסון שבדי קרן (Parkinsonfonden), לבין אזור מחקר אסטרטגי-Multipark אוניברסיטת לונד (מחקר רב תחומי ב מחלת פרקינסון). ג'אנל דראון-Ouellet נתמך על-ידי התחברות קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR) (#358492), רוג'ר בארקר הוא נתמך על ידי מענק NIHR מרכז מחקר ביו-רפואי לבית החולים האוניברסיטה של קיימברידג/Addenbrooke של. מלין Parmar הוא חוקר רוברטסון ניו יורק קרן תאי גזע. שלבי Shrigley ממומן על ידי האיחוד האירופי אופק 2020 התכנית (H2020-MSCA-ITN-2015) תחת מארי הספרותמוזאון רשת הדרכה חדשניות וגרנט הסכם מס 676408.

Fibroblasts עורי למבוגרים היו המתקבל המרפאות למחקר מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון במרכז ג'ון ואן גיסט לתיקון המוח (קיימברידג ', בריטניה) ומשמשת תחת אישור מוסרי המקומית (REC 09/H0311/88). לקבלת פרטים אודות ההליך דגימה ביופסיה של העור, ראה הפניה8.
1. הכנה של העור Fibroblasts התכנות
<ol><li>באמצעות תא אוטומטיות מפשיר מערכת או באמבט מים 37 ° C, להפשיר את הבוגרים fibroblasts עורי אנושי (aHDFs), צלחת 200,000 לכל T75 הבקבוק (ספירה עם מונה הניתן תא אוטומטיות) ב- 10 מ"ל של פיברובלסט בינוני (ראה טבלה 1) ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.</li>
	<li>לבצע שינוי בינונית בינונית פיברובלסט ביום הבא.</li>
	<li>לשנות את המדיום פיברובלסט כל 3-4 ימים עד התאים מגיעים confluency 95%. הערה: הבקבוק confluent אחד יכיל כ 1,000,000 תאים. AHDFs שיכול להיות קפוא כדי לבנות של המניות של הקו הסלולרי (סעיף 2) או ישירות מחדש מצופה מוכן עבור התכנות (סעיף 3).</li>
</ol>2. הקפאה של העור Fibroblasts
<ol><li>במקום מיכל הקפאה בקצב מבוקר בתוך קופסה עם קרח או במקרר-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>מביצועם התאים עם 0.05% טריפסין (1.5 מ"ל לכל T75 הבקבוק) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.</li>
	<li>הוסף בינוני פיברובלסט (מכיל סרום שור עוברית (FBS)) כדי לנטרל את טריפסין (3 מ"ל פלאש לכל T75 הבקבוק) ולאסוף התאים מנותקת בשפופרת 15 מ"ל על ידי שטיפה את התאים הבקבוקון פעמיים.</li>
	<li>לספור את התאים באמצעות הדלפק תא אוטומטית; ההקפאה (מומלץ) aHDFs כ 500,000 לכל מבחנה.</li>
	<li>ספין למטה התאים ב 400 g x במשך 5 דקות.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מדיום קפוא (ראה טבלה 1) והעברת לתוך הצינור ההקפאה. מניחים את הצינורות ישירות לתוך המיכל הקפאה בקצב מבוקר.</li>
	<li>אחסן את קצב מבוקרת קפוא המנגנון ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, העברת הצינורות ל-140 מעלות צלזיוס מקפיא ולאחסן עד שהוא נדרש.</li>
</ol>3. ציפוי עבור התכנות (יום − 1)
הערה: מומלץ להשתמש ציפוי הג'לטין לניסויים לטווח קצר (עד 30 ימים); לחלופין, לניסויים לטווח ארוך מומלץ להתחיל בפולי-L-ornithine, fibronectin וציפוי laminin (PFL).
<ol><li>60 דקות לפני ציפוי של aHDFs עבור התכנות, מעיל צלחת 24-ובכן עם ג'לטין 0.1% (250 µL טוב), דגירה ב 37 º C.</li>
	<li>האחות המדיום פיברובלסט על aHDFs. לשטוף פעם עם DPBS. מביצועם התאים עם 0.05% טריפסין (1.5 מ"ל לכל T75 הבקבוק) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.</li>
	<li>הוסף פיברובלסט בינוני לנטרל את טריפסין (3 מ"ל פלאש לכל T75 הבקבוק) ולאסוף את התאים מנותקת בשפופרת 15 מ"ל על ידי שטיפה את התאים הבקבוקון פעמיים.</li>
	<li>ספין למטה התאים ב 400 g x עבור 5 דק להשליך תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של פיברובלסט בינוני.</li>
	<li>לספור את התאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות (כדי להבטיח צ'ק. המרת באיכות טובה הכדאיות תא מעל 90% עם trypan blue מכתימה).</li>
	<li>בשביל צלחת מלאה 24-. טוב, הכינו השעיה של תאים 1,320,000 ב- mL 13.2 פיברובלסט בינוני כדי להשיג השעיה של 100,000 תאים למ"ל בינוני (או תאים/באר 55,000 µL 550 בינוני פיברובלסט מוכפל מספר בארות הדרושים).</li>
	<li>האחות הג'לטין מהצלחת, לשטוף פעמיים עם DPBS. להוסיף 500 µL של התליה תא מכל קידוח, דגירה בין לילה ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.</li>
</ol>4. נגיפי התמרה חושית (יום 0)
הערה: עבודה עם חלקיקים lentiviral דורש ציוד קטגוריה 2 השימוש של סוכן כדי לנטרל. את הוירוס. מומלץ מאוד גם לובש זוגי זוגות של כפפות.
<ol><li>לחמם 13.2 מיליליטר פיברובלסט בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הפשרת וקטור lentiviral המכיל את גורמי שעתוק Ascl1 ו- Brn2 עם סיכת ראש קצר שני RNAs (shRNA) מיקוד לנוח בטמפרטורת החדר. הערה: עיין להפנות8; הבונה זמינה במאגר פלסמיד. לפרטים על ההליך כדי לייצר lentiviruses נא לפנות להפנות9.</li>
	<li>הוסף את אמצעי האחסון הדרושים של lentivirus כדי להדביק את aHDFs-ריבוי של זיהום (MOI) של 20 המדיום ללא כל משפרי התמרה חושית. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56904/56904eq1v2.jpg">
</li>
	<li>להחליף את המדיום בצלחת 24-ובכן פיברובלסט בינוני המכיל את הווקטור lentiviral (500 µL טוב), דגירה בין לילה ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.</li>
	<li>למחרת, החלף המדיום בבארות פיברובלסט טריים בינונית ללא וקטור lentiviral. הערה: המדיום הוא נחשב זיהומיות במשך 7 ימים, ככזה, הגנה נאותה ופרוצדורות טיפול יש להשתמש במהלך השבוע הראשון לאחר התמרה חושית ויראלי.</li>
</ol>5. תחזוקה של תאי המרה
הערה: לאחר ההמרה מתחילה תאים רגישים הרמה; לטפל כדי עצה את הצלחת והשתמש על פיפטה µL 1,000 בעת הסרת המדיה כדי להימנע תאים ניתוק.
<ol><li>יום 3, להסיר המדיום פיברובלסט ולהוסיף 500 µL בינוני עצביים המרה מוקדמת (ראה טבלה 1).</li>
	<li>פעמיים או שלוש פעמים בשבוע, להוציא 225 µL של המדיום הישן מן הבאר, תוספת 250 µL טרי בינוני עצביים המרה מוקדמת.</li>
	<li>ביום 18, להסיר את כל של המדיום מכל קידוח ולהחליף עם 500 µL בינוני ההמרה עצביים מאוחר (ראה טבלה 1).</li>
	<li>להמשיך לשנות חצי של המדיום כמו מעל בינונית ההמרה עצביים מאוחר כל 2-3 ימים עד יום 25 או קצה של הניסוי (איור 1 א'). הערה: אם התאים הם לא מצופה היטב כל לניסוי, מלא בארות ריק עם PBS או מים כדי למנוע אידוי עבירה של המדיום ולצמצם את הווריאציה בין בארות.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ריכוז מניות</td>
			<td>ריכוז העבודה</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">פיברובלסט בינוני</td>
		</tr>
<tr>
<td>הבסיס בינוני</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>פניצילין/סטרפטומיצין</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
			<td>100 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">הקפאת בינוני</td>
		</tr>
<tr>
<td>פיברובלסט בינוני</td>
			<td>N/A</td>
			<td>45%</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>45%</td>
		</tr>
<tr>
<td>דימתיל סולפוקסיד</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">המרה עצביים מוקדם בינוני (ENM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>בידול עצבי בינוני</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>פניצילין/סטרפטומיצין</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
			<td>100 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>10 מ מ</td>
			<td>2 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB-431542</td>
			<td>20 מ מ</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>הראש</td>
			<td>µg 100/mL</td>
			<td>µg 0.5/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>-כעבור שנה--1931189</td>
			<td>10 מ מ</td>
			<td>0.5 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>VPA</td>
			<td>1 מ'</td>
			<td>1 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>LM-22A4</td>
			<td>20 מ מ</td>
			<td>2 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>GDNF</td>
			<td>µg 20/mL</td>
			<td>2 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NT3</td>
			<td>µg 10/mL</td>
			<td>10 ng/µL</td>
		</tr>
<tr>
<td>db-מחנה</td>
			<td>50 מ מ</td>
			<td>0.5 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">המרה עצביים מאוחר בינוני (LNM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>בידול עצבי בינוני</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>פניצילין/סטרפטומיצין</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
			<td>100 מ"ג/מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>LM-22A4</td>
			<td>20 מ מ</td>
			<td>2 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>GDNF</td>
			<td>µg 20/mL</td>
			<td>2 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NT3</td>
			<td>µg 10/mL</td>
			<td>10 ng/µL</td>
		</tr>
<tr>
<td>db-מחנה</td>
			<td>50 מ מ</td>
			<td>0.5 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">מאגר FACS</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS 1 x [סידן, מגנזיום, - פנול אדום]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNAase</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: הרכב של התקשורת השונים בשימוש. תיאור מלא של ההרכב על כל אמצעי התקשורת הדרושים פרוטוקול זה כולל פיברובלסט בינוני, הקפאת בינוני, בינוני עצביים המרה מוקדמת, לאחר ההמרה עצביים בינוני ו FACS מאגר.
6. coverslips זכוכית דקה להקלטות אלקטרופיזיולוגיות
הערה: מומלץ ללבוש חלוק מעבדה, משקפי מגן, כפפות כפול של להשלים את כל העבודות בשכונה fume... פרוטוקול זה הוא ממאמרו של 10.
<ol><li>הצב coverslips זכוכית דקה בתחתית צלחת זכוכית ללא חפיפה.</li>
	<li>להוסיף כללי מעבדה ניקוי דטרגנט להטביע את כולם coverslips מבלי להסתכן גלישה במהלך רועד (כ- 30 מ"ל). מניחים על גבי שאכר מסלולית במהירות איטית במשך שעתיים.</li>
	<li>לשטוף שש פעמים (30 דקות כל אחד) עם בלוק מים יונים.</li>
	<li>הוספת אתנול 95% עבור 2 h.</li>
	<li>הסר האתנול והמתן עד coverslips יבשים.</li>
	<li>פעם יבש, להעביר את coverslips לתוך גביע זכוכית ולהוסיף חומצה חנקתית 70% עד coverslips טובע.</li>
	<li>מניחים את הספל זכוכית למקלחת sonicator עבור 60 דקות.</li>
	<li>הסר את חומצה חנקתית, לשטוף שלוש פעמים עם מים יונים בלוק. התראה: תמיד להוסיף חומצה למים, לא להיפך, כמו זה יכול להוביל לתגובה אלימה.</li>
	<li>להסיר כמה שיותר מים כשהספל ככל האפשר ולהוסיף חומצה הידרוכלורית מרוכזת (HCI) עד coverslips טובע; מערבולת את הספל ולכסות עם סרט פרפין.</li>
	<li>Sonicate עבור 60 דקות (50-60 הרץ, 30 W).</li>
	<li>להסיר כמה שיותר HCI coverslips ככל האפשר, המקום לתוך סל פסולת מתאים. לשטוף עם מים יונים בלוק פעמיים.</li>
	<li>קח על coverslips מחוץ למכסה, לשטוף 20 פעמים (או יותר) עם מים יונים בלוק עד כל HCI יוסר.</li>
	<li>פעם יבש, מקום coverslips לוחות 24-ובכן סטרילי.</li>
	<li>מקם את הצלחות אולטרה סגול (UV) אור בן לילה. למחרת coverslips מוכנים לשימוש. הערה: אם נעשה שימוש coverslips זכוכית דקה, מומלץ להשתמש הציפוי PFL. פשוט למקם את אחד coverslip כל טוב של צלחת 24-היטב (באמצעות מלקחיים סטרילי), לפי התקנון להלן.</li>
</ol>7. PFL ציפוי לתרבות לטווח ארוך
<ol><li>מעיל לצלחת 24-ובכן עם פולי-L-ornithine (500 µL טוב) ולהשאיר ללילה ב 37 ° C 5% CO2.</li>
	<li>וארוקן את פולי-L-ornithine, לחכות עד שיהיה מספיק יבש טופס טיפות על העליונה.</li>
	<li>להפוך טיפת (כ-60 µL) laminin במרכז של כל טוב ופרש לכסות את המשטח כולו של coverslip. יוצאים h 2 45 min ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.</li>
	<li>לשטוף שלוש פעמים עם DPBS.</li>
	<li>הוסף fibronectin (500 µL טוב), להשאיר למשך הלילה ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.</li>
	<li>לשטוף פעם עם DPBS לפני הוספת תאים. הערה: ציפוי PFL יכול לשמש זמן המונח תרבויות של In (מעל 100 ימים), למרות מות תאים פרוגרסיבי הוא צפוי מיום 30.</li>
</ol>8. FACS
הערה: על צלחת מחדש את התאים לאחר FACS מיון להכין צלחת מצופים PFL 48 שעות מראש. ניתן למיין תאים באמצעות תאי העצבים אדהזיה נוגדן מולקולה (NCAM), מיום 20 ואילך בעקבות התמרה חושית.
<ol><li>להסיר את התקשורת עם פיפטה 1,000 µL (לא לשטוף כדי להימנע תאים ניתוק).</li>
	<li>הוסף תא בריא הסוכן (250 µL טוב), להשאיר למשך 10 – 20 דקות עד התאים, תניף ו לצוף כמו תאים בודדים.</li>
	<li>במהלך תקופה זו להכין את המאגר FACS.</li>
	<li>Triturate בעדינות עם פיפטה 1,000 µL. אם נשארים כמה גושים, דגירה קצת יותר זמן.</li>
	<li>לאחר השעיה תא בודד מתקבל, להסיר אותו מן הבאר ולמקם לתוך צינור 1.5 מ.</li>
	<li>לרוקן הבאר פעמיים עם בינוני ההמרה עצביים מאוחר והמקום לתוך הצינור 1.5 mL אותו.</li>
	<li>ספין למטה-400 g x עבור 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב 200 µL מאגר FACS.</li>
	<li>ספין למטה התאים ב 400 g x עבור 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.</li>
	<li>חזור על שלבים 8.8 ו- 8.9 פעמיים.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב- 50 µL FACS מאגר המכיל נוגדנים אנושיים CD56 (NCAM)-ריכוז של 1:50 למשך 15 דקות על קרח. להגן מפני אור.</li>
	<li>ספין למטה התאים ב 400 g x במשך 5 דקות.</li>
	<li>Resuspend במאגר FACS µL 200 לשטוף את ספין למטה התאים ב 400 x g למשך 5 דקות.</li>
	<li>חזור על שלב 8.13.</li>
	<li>Resuspend ב µL 200 FACS מאגר המכיל propidium יודיד (PI; 10 µg/mL). למיין את NCAM חיובי (iNs) ותאים PI שלילי (חיים) באמצעות FACS gating מבוסס על קרינה פלואורסצנטית האינטנסיביות של דגימות הבקרה היו מוכתמים עם נוגדנים NCAM או PI.</li>
	<li>איסוף התאים חיובי NCAM בשפופרת המכיל מאוחר עצביים המרה בינוני.</li>
	<li>לספור את התאים באמצעות, מונה תא אוטומטיים ו צלחת מחדש את התאים ב צפיפות גבוהה (50,000 תאים/cm2) במדיום ההמרה עצביים מאוחר בקערה PFL מצופה.</li>
	<li>להמשיך לשנות חצי של המדיום 2-3 פעמים בשבוע מאוחר ההמרה עצביים בינונית עד הקצה הניסוי (איור 1 א').</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17, 170-182 (2016).</li>
<li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+Reprogrammed+Human+Neurons+Retain+Aging-Associated+Transcriptomic+Signatures+and+Reveal+Age-Related+Nucleocytoplasmic+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly Reprogrammed Human Neurons Retain Aging-Associated Transcriptomic Signatures and Reveal Age-Related Nucleocytoplasmic Defects.</a> Cell Stem Cell. 17, 705-718 (2015).</li>
<li>Hashizume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+the+nuclear-coded+GCAT+and+SHMT2+genes+confers+human+age-associated+mitochondrial+respiration+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2 genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects.</a> Sci Rep. 5, 10434(2015).</li>
<li>Lapasset, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rejuvenating+senescent+and+centenarian+human+cells+by+reprogramming+through+the+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Rejuvenating senescent and centenarian human cells by reprogramming through the pluripotent state.</a> Genes Dev. 25, 2248-2253 (2011).</li>
<li>Huh, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+age+in+human+neurons+generated+by+microRNA-based+neuronal+conversion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Maintenance of age in human neurons generated by microRNA-based neuronal conversion of fibroblasts.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Drouin-Ouellet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REST+suppression+mediates+neural+conversion+of+adult+human+fibroblasts+via+microRNA-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">REST suppression mediates neural conversion of adult human fibroblasts via microRNA-dependent and -independent pathways.</a> EMBO Mol Med. , (2017).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Richner, M., Victor, M. B., Liu, Y., Abernathy, D., Yoo, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-based+conversion+of+human+fibroblasts+into+striatal+medium+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-based conversion of human fibroblasts into striatal medium spiny neurons.</a> Nat Protoc. 10, 1543-1555 (2015).</li>
<li>Lau, S., Rylander Ottosson, D., Jakobsson, J., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neural+conversion+from+human+fibroblasts+using+self-regulating+and+nonintegrating+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct neural conversion from human fibroblasts using self-regulating and nonintegrating viral vectors.</a> Cell Rep. 9, 1673-1680 (2014).</li>
<li>Pfisterer, U., Wood, J., Nihlberg, K., Hallgren, O., Bjermer, L., Westergren -Thorsson, G., Lindvall, O., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+functional+neurons+from+adult+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of functional neurons from adult human fibroblasts.</a> Cell Cycle. 10, 3311-3316 (2011).</li>
<li>Caiazzo, M., Dell'Anno, M. T., Dvoretskova, E., Lazarevic, D., Taverna, S., Leo, D., Sotnikova, T. D., Menegon, A., Roncaglia, P., Colciago, G., Russo, G., Carninci, P., Pezzoli, G., Gainetdinov, R. R., Gustincich, S., Dityatev, A., Broccoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Masserdotti, G., Gascón, S., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+learning+from+and+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: learning from and for development.</a> Development. 143, 2494-2510 (2016).</li>
<li>Pereira, M., Pfisterer, U., Rylander, D., Torper, O., Lau, S., Lundblad, M., Grealish, S., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+generation+of+induced+neurons+from+human+fibroblasts+that+transplantation+into+the+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly efficient generation of induced neurons from human fibroblasts that transplantation into the adult rat brain.</a> Sci Rep. 4, 6330(2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

וקטור זה one-step/one התכנות שיטת מספק דרך יעילה להשיג תוספות של האדם fibroblasts למבוגרים. האדם fibroblasts למבוגרים הם בדרך כלל הרבה יותר קשה כדי להמיר מאשר fibroblasts עוברית, עם המחקרים מוגבלת קודם לכן דיווח על היעילות של 5-10%12,13. עם זאת, עם פרוטוקול חדש זה אפשרי להשיג תשואה עצביים (נמדד כתאים MAP2 +) של 50%8. בנוסף, פרוטוקול שלנו יכול לשמש על עורי fibroblasts זה יש כבר passaged מספר פעמים מבלי לאבד את היעילות של ההמרה. עד כה השתמשנו תאים passaged עד 14 פעמים ללא זיהוי כל ירידה ביעילות ההמרה. כמו כן, אין שום הבדל ב התכנות יעילות בידיים שלנו עם fibroblasts מתורמים בגיל בין 52 ל- 87. לפרטים נוספים על גיל, מחלות של שורות תאים אחרים שנבדקו עם המבנה הזה, ראה הפניה8. מחקרים אחרים דיווחו גם אין הבדל יעילות ההמרה באמצעות פרוטוקול מבוסס על lentiviral וקטנים מולקולה בעלת משופרת עם תורמים בין 0 ל- 89 שנים4. יתר על כן, ישימות עקבית עם מבוססי miRNA התכנות עצביים דווח ב fibroblasts בני כל הגילאים, תורמים בין 0 לבן 867. דרך זו, ניתן להשיג נוירונים בוגרים כ 12-15 שבועות במבחנה או 8 שבועות בעקבות השתלת ויוו8בקירוב. זה יתרון כי זה נותן גישה המחלה והן החולה תוספות אנושי ספציפי מרקמות כי הוא נגיש בקלות. פרוטוקול זה אמנם יעילה, הוא לא יפיק תשואה עצביים 100%, כך נדרש צעד טיהור באמצעות FACS למשל.
השלב הקריטי ביותר בתוך פרוטוקול זה הוא ויראלי התמרה חושית (פרוטוקול סעיף 4). זה הכרחי כי כייל וירוס הוא מדויק, בנוסף יש מצופה מספר מדויק של aHDFs עבור המרה. כייל נוגדנים מומלץ לשימוש עם פרוטוקול זה הוא בין 4 x 108 ו 4 x 109. כייל של משהו מתחת עונה 1 פרק 108 לא להיות מומלץ להשתמש כמו הוספת כמויות גדולות של וירוס יהיה רעיל לתאים. יתר על כן, כאשר fibroblasts מתחיל חשאי כדי תוספות הם יהפכו רגישים הרמת וחלשים יותר. זה חיוני כדי להיות עדין בעת שינוי התקשורת כדי לא להפריע יותר מדי את התאים. ניתן לבצע זאת על-ידי הסרת את הנוזלים באיטיות עם פיפטה 1,000 µL. לבסוף, כאשר ציפוי עבור התכנות (פרוטוקול בסעיף 3) זה חשוב לוודא אוכלוסיה בריאה פיברובלסט לפני תחילת הניסוי; זה מציינים הכדאיות תא של מעל 90% עם trypan blue מכתים. תמיד צריך להיות passaged את aHDFs לפני שהגיע confluency 95%.
אם יש מוות של תאים מורגש לפני התמרה חושית ויראלי, לא מתחילים המרה: שח כפול כי הכדאיות תא היא מעל 90%, כך שלא היו בעיות עם ציפוי של הצלחת. הוא צפוי יש כמות קטנה של מוות של תאים בעקבות התמרה חושית ויראלי, עם זאת, זה לא צריך להיות משמעותי. במקרה זה, לאשר זריעה מדויקת של 50,000 aHDFs/טוב, לבדוק כייל את הוירוס. אם קיים חוסר עקביות מורגש בין הבארות במהלך ההמרה, בדוק תחילה כי כל טוב מכיל כמות שווה של מדיה, אידוי עבירה אינה מתרחשת בקצוות (אם ניתן להוסיף מדיה נוסף הכרחי הבארות edge). לחלופין, בדוק שלב 4.4, ולהבטיח ערבוב המתאים עבור השעיה הומוגנית כאשר transducing. חשוב להוסיף את lentivirus למדיום קודם, לפני הוספת את זה לתוך הבארות. הוספת ישירות lentivirus לתוך הבארות יגדל השתנות טוב עד טוב והוא גם עלולים להיות רעילים לתאים. לבסוף, בדוק תמיד כי המדיום הוא חימם את 37 ° C לפני הוספת תאים.
פרוטוקול זה כולל מקטעים אופציונליים עבור תנאים ציפוי לתרבות לטווח ארוך של FACS מיון כדי להגדיל את טוהר עצביים והתבניות. לניסויים המבקשים לחקור את אפיון פונקציונלי של In, עבור הכנה של coverslips זכוכית דקה אלקטרופיזיולוגיה פרוטוקול גם היה כלול. פרוטוקול ההמרה כאן מוגדר לשימוש עם צלחת 24-טוב; אם רצונך בכך זה ניתן לשנות ל 6, 12, 48-, 96-ובכן צלחת או מבחנות. במקרה זה, אנא התאם כל אמצעי האחסון פני השטח של הלוח או הבקבוק מנוצל.
פרוטוקול זה משתמש ביטוי מאולץ של Ascl1 ו- Brn2 בשילוב עם מנוחה נוקאאוט כל ארוזים אחד וקטור יחידה8 ליצירת תוספות של הפנוטיפ פאן עצבית. הדור של כל סוגי גליה בשיטה זו, עם זאת, יש לא להיות מוערך. שיטה זו ולכן צריכים להיות שונה לשימוש עם גורמים אחרים התיכנות כדי לקבל סוג של נוירונים ספציפיים. התכנות ישירה בעבר הראו את האפשרות לייצר מוטורי לגלוקוז, החישה הניריונים, photoreceptors, נוירונים קוצני בינוני striatal ו10,של נוירונים דופאמין14. זה יהיה מועיל, כשחוקרים מחלות נוירולוגיות איזה סוג עצביים מסוימים מעדיפים מושפעות, למשל מחלת פרקינסון, נוירונים דופאמין.
עד לאחרונה, ישיר טכנולוגיה התיכנות עצבית לא התירו לייצור של תוספות בצורה סטנדרטית ויעיל — לרמה הנדרשת עבור רעלים וסמים הקרנת מבחני בקנה מידה גדול. שיטה חדשה זו יעילה מאוד והוא יכול לשמש על fibroblasts זה יש כבר passaged פעמים רבות, כך זה עכשיו מסיר הגבלות אלה, נפתח עבור מגוון רחב של מחקרים, לא רק במערכת העצבים האנושית, אלא גם במערכת שניתן לחולה ספציפי. את הפשטות של גישה זו הופך את הטכנולוגיה בתוך נגישים עבור כל קבוצות המבקשים לבצע מחקרים דומים שבאתר ואת יכולה בקלות לשמש לא רק עבור יישומים ביו בקנה מידה גדול, כגון והתרופות הקרנה, מבחני רעלים, אלא גם לתמיכה נתונים נגזר מודלים של בעלי חיים, דגימות רקמה אנושית אחרי המוות .

פיתוח תכליתי טיפולים עבור הפרעות נוירולוגיות יש כבר הקשו על ידי גישה מוגבלת לתאי המוח האנושי חי כדי לבצע מחקרים מכניסטית, מבחני פונקציונלי. לפני כעשור, מצב זה השתנה באופן קיצוני עם התפתחות pluripotent המושרה תא גזע (iPSCs) טכנולוגיה1,2. זה, בשילוב עם הבנה טובה יותר של המנגנונים העצביים בידול המתרחשים במהלך ההתפתחות האנושית הרגילה, אפשרה לדור של תת עצביים מוגדרים ומגוונים מן החומר הספציפי החולה ומחלות. עם חומר כזה, עכשיו זה אפשרי ללמוד מנגנונים תאיים שבבסיס את הפוטנציאל של תרכובות שונות כדי להקל על אלה תכונות פתולוגיים3ומחלות נוירולוגיות.
בעוד iPSCs היה מהפכני בתחום של מדעי המוח, אחד החיסרון העיקרי של תאים אלה הוא כי החתימה שלהם הזדקנות נמחק במהלך תהליך התיכנות בצורה כזאת, כי נוירון מחודש לא שומרים על הפגיעות המשויך הזדקנות4,5,6. תכונה מיוחדת זו של הנוירונים המיוצרים שבסופו ביקורתי על היבטים רבים של המפל פתוגניים תאיים, במיוחד במקרה של מחלות אשר בגיל מבוגר הינו גורם סיכון חשוב recapitulating.
ישיר התכנות עצבית היא טכנולוגיה שבו תאים סומטיים מומר ישירות ב מבלי לעבור דרך pluripotent ביניים הבמה. דבר זה מאפשר יצירה מהירה של נוירונים אנושיים במבחנה ניתן גם למטופל וגם מחלות ספציפיות. מאפיין יוצא דופן אחת של התכנות ישירה היא גיל התחלת מהתא התורם נשמר, עם זה, כדי הזדקנות תהליכים כגון הפגיעות שלו גדל הייצור של סטרס חמצוני4,7. כתוצאה מכך, תוספות של חולים עם מחלות נוירולוגיות הקשורים עם הזדקנות, כמו אלצהיימר, פרקינסון, מתאימים היטב למגוון רחב של יישומים ביו כולל מחלת דוגמנות, סמים הקרנת מבחני, ומחקרים טוקסיקולוגיה .
אזהרה הראשי זה מנעה הארצי של חולים עם הפרעות ניווניות בשימוש נרחב הוא כי הם אינם קלים לתכנת, זה הופך להיות קשה עוד יותר עם התרחבות fibroblasts. כתוצאה מכך, דור של תאים בכמויות הדרושות עבור סוגים אלה של יישומים לא הושגה עד לאחרונה רק8. עכשיו פיתחנו שיטה פשוטה לתכנת fibroblasts מתורמים בכל גיל בצורה יעילה מאוד. שיטה זו משלבת ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק עצביים Ascl1 ו- Brn2 עם נוק-אאוט של מדכא. שבולם חלבון להשתיק RE1 שעתוק הגורם (השאר) באמצעות וקטור יחידה. כאן, אנו מתארים את השלבים השונים שהובילו הדור של תוספות שהומרו מהעור fibroblasts ביופסיה מתורמים קשישים.

<table><tbody><tr><td><קווי תאים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיברובלסטים עוריים אנושיים בוגרים&nbsp;</td><td></td><td></td><td>[קטע C2 #7] התורמת הייתה אישה בת 67. תאים שהתקבלו מהפרקינסון s מחקר מחלות והנטינגטון' מרפאות מחלות במרכז ג'ון ואן גיסט לתיקון מוח (קיימברידג', בריטניה).</td></tr><tr><td><ריאגנטים חזקים>ריאגנטים לתרבית פיברובלסטים, התמרה והמרה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט (DPBS) של דולבקו [-CaCl2, -MgCl2]</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA [0.5%]</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>מדלל ל-0.05% ב-DPBS.</td></tr><tr><td>וירקון (חומר המשמש לנטרול נגיף)</td><td>וירודרם</td><td>7511&nbsp;</td><td>מדללים לתמיסה של 1% במים חמים.</td></tr><tr><td>Milli-Q מים</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>בינוני בסיסי</חזק> - Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>61965059</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין [10,000 U/mL]</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS&reg; &nbsp; דימתיל סולפוקסיד (DMSO) 10</td><td>Miltenyi</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מדיום התמיינות עצבית</חזק> - NDiff 227</td><td>Takara-Clontech</td><td>Y40002</td><td></td></tr><tr><td>LM-22A4&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>4607</td><td>יש לדלל 10 מ"ג ב-1450 ומיקרו; L DMSO. <חזק>ריכוז מלאי: 20 מ"מ.</חזק></td></tr><tr><td>גורם נוירוטרופי הנגזר מקו תאי גליה (GDNF) [אדם רקומביננטי]</td><td>R& מערכות D</td><td>212-GD-010</td><td>לדלל 10 ug ב-500 ומיקרו; L 0,1% BSA ב-DPBS. <חזק>ריכוז מלאי: 20 ומיקרו; גרם/מ"ל.&nbsp; </חזק></td></tr><tr><td>NT3 [אדם רקומביננטי]</td><td>R& מערכות D</td><td>267-N3-025</td><td>דילול 25 ומיקרו; g ב-2,5 מ"ל 0,1% BSA ב-DPBS. <חזק>ריכוז מלאי: 10 ומיקרו; גרם/מ"ל.&nbsp; </חזק></td></tr><tr><td>db-cAMP&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0627</td><td>יש לדלל 1 גרם ב-40,7 מ"ל מים Milli-Q. לסנן וליצור 500 ומיקרו; L aliquots או צינורות מלאי של 10 מ"ל. <חזק>ריכוז מלאי: 50 מ"מ. </חזק></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>דילול 2 ומיקרו; g ב-429,8 ומיקרו; L DMSO. <חזק>ריכוז המלאי: 10 מ"מ. </חזק></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Axon</td><td>1661</td><td>יש לדלל 5 מ"ג ב-595 ומיקרו; L DMSO. <חזק>ריכוז המלאי: 20 מ"מ. </חזק></td></tr><tr><td>נוגין [אדם רקומביננטי]</td><td>Miltenyi</td><td>130-103-456</td><td>לדלל 100 ומיקרו; גרם ב-100 ומיקרו; ליטר מים Milli-Q + 900 ומיקרו; L 0,1% BSA ב-DPBS. <חזק>ריכוז מלאי: 100 ומיקרו; גרם/מ"ל.</חזק></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Axon</td><td>1509</td><td>יש לדלל 2 מ"ג ב-360 ומיקרו; L DMSO. <חזק>ריכוז מלאי: 10 מ"מ.</חזק></td></tr><tr><td>מלח נתרן חומצה ולפרואית (VPA)</td><td>Merck Millipore</td><td>676380</td><td>יש לדלל 5 גרם במי Milli-Q כדי להשיג ריכוז <מלאי חזק> של 1 מ'. זהירות:</חזק> יש להימנע מבליעה, מגע עם העור ונשימת היווצרות אבק.</td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים לציפויים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2500</td><td>יש לדלל ל-0.1% במי Milli-Q.</td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P3655</td><td>מתמוסס במי Milli-Q. <חזק>לשימוש בגיל 15 ומיקרו; גרם/מ"ל.&nbsp; </חזק></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33010-018</td><td>2 מ"ל מים Milli-Q + 70 ומיקרו; L 0,25 מ' NaOH. <חזק>לשימוש ב-5 ומיקרו; גרם/מ"ל.&nbsp; </חזק></td></tr><tr><td>למינין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>יש לאחסן בטמפרטורה של -80&80 מעלות צלזיוס. להפשיר על קרח, לשמור על קור רוח ולצרוך 30 & מיקרו < > לשימוש ב 5 & מיקרו; גרם/מ"ל.&nbsp; </חזק></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים למיון תאים פעילים פלואורסצנטיים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומר דיסוציאציה של תאים - Accutase (Stem Pro)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) 1X [-סידן, -מגנזיום, - פנול אדום]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175-046</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>השתמש בריכוז של 1% עבור CD56 אנטי אנושי (NCAM).</td></tr><tr><td>DNAase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN-25</td><td>השתמש בריכוז של 0.05%.</td></tr><tr><td>נוגדן CD56 (NCAM) אנטי אנושי [עכבר]</td><td>BD Pharmingen</td><td>555518</td><td>לשימוש ב-1:50.</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td>יש לדלל ל-1 מ"ג/מ"ל ב-PBS ולשמור על סטרילי. <חזק>יש להשתמש ב-1:1000 כדי להשיג ריכוז של 10&micro; גרם/מ"ל.</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>ריאגנטים לכיסויי זכוכית</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr>מים <tr><td>נטולי</td><td></td><td></td><td></td>יונים אוטוקלאב</tr><tr><td>חומר ניקוי אלקונוקס</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Z273228</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 95%</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>חומצה חנקתית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>438073-M</td><td><חזק>זהירות:</חזק> חומצה חנקתית מרוכזת היא קורוזיבית מאוד, והאדים שלה עלולים להזיק.</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית מרוכזת (HCI)</td><td></td><td></td> <td><חזקה>זהירות:</חזקה> חומצה הידרוכלורית מרוכזת היא קורוזיבית מאוד, והאדים שלה עלולים להזיק.</td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים לאימונוציטוכימיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td>לשימוש בריכוז של 4%. <חזק>זהירות:</חזק> PFA הוא מקבע רב עוצמה. הימנע מבליעה ומגע עם העור</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>10254640</td><td>לשימוש בריכוז של 0.1%.</td></tr><tr><td>סרום [חמור]</td> <td>Merck Millipore</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד MAP2 [עוף]</td> <td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>לשימוש בריכוז של 1: 5,000.</td></tr><tr><td>Tau HT7 נוגדן חד שבטי [עכבר]</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>MN1000</td><td>שימוש בריכוז של 1: 500.</td></tr><tr><td>Cy3 נוגדן נגד עוף [חמור]</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-165-155</td><td>שימוש בריכוז של 1: 400.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 נוגדן נגד עכבר [חמור]</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-150</td><td>שימוש בריכוז של 1: 400.</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidine-2&prime;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>מרכיבים מחדש את האבקה במי Milli-Q ל-1 מ"ג/מ"ל. Aliquot ואחסון ב-20&deg; C, <חזק>רגיש לאור</חזק>. יש להשתמש בריכוז של 1:500.</td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 בקבוק [משטח דלתא Nunclon]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות [Nunc]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>צינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z336769</td><td></td></tr><tr><td>צינור בז 15 מ"ל&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>צינור בז 50 מ"ל&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת CryoPure 1.6 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72.380</td><td></td></tr><tr>בקר <td></td><td></td><td>פיפטה</td><td>לנפחי פיפטינג 1-25 מ"ל.</td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות סטריליות: 5, 10 ו-25 מ"ל&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>פיפטורים בנפח מתכוונן: 5, 20, 200 ו-1,000 ומיקרו; L&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קצות</td><td></td><td></td> פיפטה <td>סטריליות לנפחי פיפטינג של 0.5 - 1,000 & מיקרו ליטר.</td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-1.5-oz</td><td>#1.5 עובי, קוטר 12 מ"מ, 0.5oz, מוסמך CE, מתאימים ל-24 לוחות באר.</td></tr><tr><td>צלחת</td><td></td><td></td> זכוכית <td>בקוטר 150 מ"מ בערך.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> זכוכית <td>הקפד שתהיה לך בגודל מתאים לאמבט הסוניקטור. מים מאמבט הסוניקטור לא צריכים לעלות על גדותיהם לכוס הזכוכית.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThawSTAR מערכת הפשרת תאים אוטומטית</td><td>BioCision</td><td>BCS-601</td><td></td></tr><tr><td>Countess II מונה תאים אוטומטי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>תאי ספירת תאים [50 שקופיות] וכחול טריפאן [0.4%]</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>לשימוש עם מונה תאים אוטומטי של Countess II.</td></tr><tr><td>CoolCell Cell LX מיכל הקפאה בקצב מבוקר</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>מכסה זרימה</td><td></td><td></td><td></td>למינרי</tr><tr><td>לחות 5% CO2 37 &deg; צנטריפוגת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> חממה C <td>מתאימה לצינורות של 1,5, 15 ו-50 מ"ל.</td></tr><tr><td>שייקר</td><td></td><td></td><td></td>אורביטלי</tr><tr><td>סוניקטור - מנקה Bransonic דגם B200</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Z305359</td><td>תדר = 50-60 הרץ, משרעת = 30 וואט</td></tr><tr><td>סדרן תאים FACS Aria III</td> BD <td>פארמינגן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניגודיות פאזה</td><td>אולימפוס</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr></tbody></table>

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ fibroblasts עור מבוגר

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

המושרה נוירונים (iNs), התוצר של תאים סומטיים המרה ישירות נוירונים, הם דרך להשגת נוירונים נגזר החולה מרקמות כי הוא נגיש בקלות. דרך זו, ניתן להשיג נוירונים בוגרים עניין של כמה שבועות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול בשלב אחד פשוטה ומהירה להשיג תוספות של עורי fibroblasts מושגת באמצעות דגימות ביופסיה מתורמים האנושי למבוגרים. נוכל להסביר כל שלב של התהליך, לרבות קיום עורי fibroblasts, הליך ההקפאה לבנות מלאי של הקו הסלולרי, זריעה של התאים עבור התכנות, כמו גם התנאים תרבות במהלך תהליך ההמרה. בנוסף, אנו מתארים את הכנת coverslips זכוכית דקה הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, לטווח ארוך תנאים ציפוי של התא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS). אנחנו גם להמחיש דוגמאות לתוצאות צפויות. הפרוטוקול המתואר כאן הוא קל לביצוע, fibroblasts יישומית האדם הנגזרות ביופסיות עור מחולים עם אבחנות שונות בגילאים שונים. פרוטוקול זה מייצר כמות מספקת של תוספות אשר יכול לשמש עבור מגוון רחב של יישומים ביו-רפואית, כולל המידול מחלת, והתרופות הקרנה היעד אימות.

שינוי ברור מורפולוגיה התא צריך להיות גלוי מיום 5 ואילך (איור 1B). מות תאים מסוימים אמנם צפוי לאחר התמרה חושית ויראלי, לא בגלוי. מכל קידוח לתוך צלחת 24-ובכן תשואה בתא סכום של 20,000-40,000 תאים אמור להיות צפוי ביום 25, מתוכם כמחצית צריכה להפוך נוירונים. חשוב לציין כי התשואה וטוהר יכול להשתנות על פני תאים בטור, כמו גם עם מחלת המדינה ווירוסים אצוות.
התאים מבטאים סמנים עצביים הכי סטנדרטי כולל MAP2 וטאו (איור 1C) ביום 25 בנוסף מפגין מורפולוגיה עצביים בוגרת. זה אפשרי לקבל טהור באוכלוסיה על-ידי ביצוע FACS המבוסס על סמן NCAM (ראו הפניות8,11). התאים יכולים לאחר מכן להיות גם מחדש מצופה על ציפוי טריפל PFL (ראה התייחסות10) או ישירות קפוא עבור ניתוחים למערכות ביולוגיות.
אם התאים לא ממוינים, immunofluorescence תיוג עם MAP2 או טאו צריך להיות שבוצעה כדי לזהות את התאים שהומרו בהצלחה ומוענקת משותפת החלבון עניין.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56904/56904fig1.jpg"> איור 1: האבולוציה של ההמרה בתוך לאורך זמן. ציר הזמן של הניסוי, מפה של הבונה בחבילה של lentivirus נהגה לתכנת מחדש את הבוגרים fibroblasts עורי אנושי (A). כל חץ שחור מייצג שינוי בינוני. (B) שלב נציג חדות תמונות המתארות את השינויים במורפולוגיה של תאים במהלך תהליך ההמרה בין יום 0 עד יום 22 (כפי שמצוין על הפינה הימנית העליונה של כל לוח). התמונות צולמו על מיקרוסקופ לעומת זאת שלב באמצעות המטרה X 10. (ג) Immunofluorescence דימוי טאו, MAP2 זוגי מכתים-התמרה חושית שלאחר יום 35. התאים היו קבוע ב- 4% paraformaldehyde ו- permeabilized עם 0.1% Triton ב- DPBS עבור 10 דקות תאים נחסמו למשך 30 דקות בפתרון סרום 5% ב- DPBS. הנוגדנים היו מעורבבת עם חסימת פתרון, חלה בן לילה ב 4 º C. Fluorophore מצומדת נוגדנים משניים היו מעורבבת עם חסימת פתרון ומוחלים על ה 2 תאים היו counterstained עם דאפי למשך 15 דקות ולאחריו 3 מנקי עם DPBS. התמונות צולמו על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה באמצעות המטרה X 20. גודל ברים = 100 מיקרומטר (B, C). קיצורים: ENM: בינוני עצביים מוקדם; LNM: בינוני עצביים מאוחר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56904/56904fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

התכנות עצביים ישיר יוצרת הנוירונים זה לשמור על הגיל לתא ההתחלה סומטיים. כאן, אנו מתארים שיטה המבוססת על וקטורים יחיד לייצר נוירונים המושרה fibroblasts עורי שהושג מתורמים האנושי למבוגרים.

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ליצור תרבית תפוקה גבוהה של נוירונים מושרים מפיברובלסטים של עור אנושי בוגר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההפרעות הנוירולוגיות מכיוון שהיא מאפשרת ניוון של מערכת עצבית מבוססת מטופל השומרת על גיל התא. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת יצירת נוירונים מושרים מאנשים בכל גיל בצורה סטנדרטית ויעילה מאוד תוך 25 יום בלבד.זה מאפשר מגוון עצום של יישומים ביו-רפואיים, כולל מודלים של מחלות, טוקסיקולוגיה, אבחון, כמו גם בדיקות סינון תרופות בקנה מידה גדול מאוד. תדגים את ההליך שלבי, דוקטורנטית ביחידה שבה המוח מתאמן, כמו גם קרלוניה, במעבדה שלנו. כדי להתחיל, הפשירו את הפיברובלסטים העוריים האנושיים הבוגרים באמצעות מערכת הפשרת תאים אוטומטית.לאחר ספירת מספר התא עם מונה תאים אוטומטי, זרע מאתיים אלף תאים לכל בקבוק T-75 המכיל 10 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים. שמור על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, החלף את המדיום הישן במדיום פיברובלסטים טרי.המשך להחליף את מדיום הפיברובלסטים כל שלושה עד ארבעה ימים עד שהתאים מגיעים למפגש של 95%. שעה לפני ציפוי הפיברובלסטים העוריים האנושיים הבוגרים מתכנות מחדש, מצפים כל באר של צלחת בת 24 בארות ב-250 מיקרוליטר של 0.1% ג'לטין. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.שאפו את המדיום הפיברובלסטי מהבקבוק, ושטפו פעם אחת עם תמיסת מלח עם פוספט של Dulbecco. לאחר הכביסה יש לבזבז את התאים עם 1.5 מיליליטר של 0.05% טריפסין לבקבוק T-75 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר של מדיום פיברובלסטים לנטרול תמיסת הטריפסין.מצננים את התאים המנותקים בצינור של 15 מיליליטר על ידי שטיפת התאים בבקבוק פעמיים. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב -400 גרם למשך חמש דקות. הוצא את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מדיום פיברובלסטים.לאחר מכן, הכינו תרחיף סלולרי של 1,320,000 תאים ב-13.2 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים על מנת להשיג 100,000 תאים למיליליטר מדיום. לאחר שאיבת הג'לטין מהצלחת, שטפו את הצלחת עם מי מלח עם פוספט של Dulbecco פעמיים. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל אחת מהבארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.חם 13.2 מיליליטר פיברובלסטים בינוני עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפשירו את הווקטור הלנטי-ויראלי במכסה המנוע הלמינרי בטמפרטורת החדר. הוסף את הנפח הנדרש של lentivirus הדרוש כדי להדביק את הפיברובלסטים העוריים האנושיים הבוגרים בריבוי זיהום של 20 למדיום ללא משפרי התמרה.לאחר מכן החלף את המדיום ב-500 מיקרוליטר של מדיום פיברובלסטים בתוספת הווקטור הלנטי-ויראלי. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, החלף את המדיום המכיל לנטי-וירוס במדיום פיברובלסטים טרי ללא הווקטור הלנטי-ויראלי.ביום השלישי לאחר התמרה ויראלית, הסר את מדיום הפיברובלסטים והוסף 500 מיקרוליטר של מדיום המרה עצבי מוקדם. פעמיים או שלוש בשבוע, החלף 225 מיקרוליטר של מדיום ישן מכל באר ב-250 מיקרוליטר של מדיום המרה עצבי מוקדם טרי. ביום ה-18 לאחר התמרה ויראלית, הסר את מדיום ההמרה העצבי המוקדם והחלף ב-500 מיקרוליטר של מדיום המרה עצבי מאוחר.המשיכו להחליף את המדיום כל יומיים-שלושה כמו קודם עד ליום ה-25 או לנקודת הסיום של הניסוי. השתמש בפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי להסיר את המדיום. לאחר מכן הוסיפו שני 250 מיקרוליטר של חומר פירוק תאים לכל באר והשאירו את הצלחת בחממה למשך 10 עד 20 דקות עד שהתאים מתנתקים וצפים כתאים בודדים.בינתיים, הכן את מאגר ה-FACS. טריטוראט עם פיפטה של 1000 מיקרוליטר. דגירה עוד קצת אם נותרו גושי תאים.העבירו את מתלה התא היחיד שהתקבל לצינור של 1.5 מיליליטר. שטפו את הבארות פעמיים עם מדיום המרה עצבי מאוחר והעבירו לאותו צינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה בחום של 400 גרם למשך חמש דקות והשליכו את הסופרנטנט.לאחר מכן, השעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS. שוב, סובב את התאים ב-400 גרם למשך חמש דקות והשליך את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים במאגר FACS ובצנטריפוגה.חזור על הפעולה פעמיים נוספות. לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא ב-50 מיקרוליטר של מאגר FACS המכיל נוגדן CD56 אנושי בריכוז של 1 עד 50 למשך 15 דקות על קרח, הרחק מהאור. צנטריפוגה של התאים ב-400 גרם למשך חמש דקות וממיסים את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS כדי לשטוף את התאים.שוב, צנטריפוגה את התאים ב -400 גרם למשך חמש דקות. יש לשטוף עם מאגר FACS פעמיים ואחריו עם צנטריפוגה. לבסוף, השעו מחדש 200 מיקרוליטר של מאגר FACS המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר של פרופידיום יודיד.מיין את התאים השליליים החיוביים של NCAM ופרופידיום יודיד באמצעות שער על בסיס רמת עוצמת הקרינה של דגימות ביקורת שלא הוכתמו בנוגדני NCAM או בפרופידיום יודיד. השתמש במונה תאים אוטומטי כדי לספור את מספר התא ולזרוע 50,000 תאים לסנטימטר רבוע על צלחת מצופה פולי-L-אורניתין פיברונקטין ולמינין עם מדיום המרה עצבי מאוחר. המשך להחליף מחצית מהמדיום פעמיים עד שלוש בשבוע עם מדיום המרה עצבי מאוחר עד לסיום הניסוי.תמונות מייצגות של ניגודיות פאזה מציגות את השינויים המורפולוגיים בתאים במהלך תקופת ההמרה. שינוי משמעותי במורפולוגיה התאית נראה מהיום החמישי. עד היום ה-22, כמחצית מהתאים הפכו לנוירונים.תמונות פלואורסצנטיות אמינו מייצגות מראות נוכחות של סמנים עצביים סטנדרטיים בתאים. עד היום ה-25, תאים מקבלים מורפולוגיה עצבית ומבטאים סמנים עצביים כמו MAP2 ו-TAU. הגרעינים מוכתמים ב-DAPI.לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד ליצור נוירונים מושרים מפיברובלסטים אנושיים בוגרים. וזה כולל ציפוי התאים לתכנות מחדש, התמרה ויראלית, תחזוקת תאים, כמו גם מיון FACS לטיהור. פיתוח טכניקה זו סולל את הדרך לחוקרים בתחום ההפרעות הנוירולוגיות לחקור מאפיינים שונים הקשורים למחלה כמו גם טיפולים פוטנציאליים.וזה יכול להיעשות במערכת שהיא לא רק מערכת עצבית אנושית אלא שיכולה להיות גם ספציפית לחולה וגם למחלה.

simple-generation-high-yield-culture-induced-neurons-from-human-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הקמנו פרוטוקול לזירוז של neuroblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות העצבית האנושית העצבית תא סוגים של פיתוח עבור מערכת העצבים המרכזית העצבית לתיקון.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד תאי אב עצביים מושרים (iNPCs) שמקורם בפיברובלסטים אנושיים בוגרים. הוא מתאר את הצעדים הכרוכים בבידוד מושבות iNPC וגידולן בבארות מרובות בארות מצופות למינין בנוכחות אמצעי תרבות מתאימים המאפשרים את המשך ההתרבות וההתרחבות של אוכלוסיית iNPC.

בידוד מושבות תאי אב עצביים המושרים שמקורם בפיברובלסטים אנושיים בוגרים

הסרטון מדגים את יצירת תאי העצב מפיברובלסטים עוריים אנושיים בוגרים (aHDFs). ה-aHDFs מתוכנתים מחדש באמצעות וקטור לנטי-ויראלי הנושא גנים עבור גורמי שעתוק עצביים ו-RNA קצר סיכת שיער (shRNAs). ה-shRNAs מעכבים את הביטוי של מדכא שעתוק עצבי, וגורמי השעתוק העצבי מפעילים גנים כדי להתמיין aHDFs לנוירונים. aHDFs מתוכנתים מחדש אלה מתורבתים במדיום המרה עצבי מוקדם ומאוחר כדי ליצור נוירונים בוגרים.

יצירת תאי עצב על-ידי תכנות מחדש של תאי פיברובלסט עוריים אנושיים

סרטון זה מתאר שיטה להכנת כיסויי זכוכית המצופים בפוליאורניתין ולמינין כדי לשפר את ההידבקות והצמיחה של תאי גזע עצביים. הטכניקה כוללת דגירות רציפות ושטיפות, מה שמקל על היווצרות מטריצה תומכת המקדמת צמיחה והתמיינות של תאים עצביים, המחקה מבנים הנמצאים בנוירונים.

יצירת נוירונים פירמידליים קורטיקליים מתאי גזע עצביים אנושיים

אנו מדווחים על שיטה לבודד מבשר עור נגזרות נאיביים multipotent (SKP) תאים פיברובלסטים מתרבויות האנושיות העיקריות. אנו מראים כי SKPs אלה נגזרים מתרבויות פיברובלסטים חולקים מאפיינים של תאי גזע דומים לאלה שנגזרים ישירות מביופסיות עור אדם. תאים אלה מבטאים את סמן הרכס העצבי, nestin, בנוסף לסמני multipotent כגון Oct4 וNanog.

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

גזירה חזקים של האדם המושרה האדם pluripotent גזע (hiPS) תאים הושג באמצעות שילוב של וירוס Sendai וירוס (Sev) וקטור בתיווך תיכנות של fibroblasts עורי. HiPS התא תחזוקה התרחבות המשוב בוצע באמצעות xeno חופשי ו מוגדר תנאי תרבות כימית עם laminin רקומביננטי אנושי 521 (LN-521) מטריקס Essential E8 (E8) בינוני.

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

אנו מתארים פרוטוקול לתכנת מחדש פיברובלסטים אנושיים שמקורם בעור לתאי אב עצביים המושרים (iNPCs), ואת הבידול הבא שלהם לאסטרוציטים המושרים (iAs). שיטה זו מובילה לייצור מהיר וניתן לשחזור של iNPCs ו- iAs בכמויות גדולות.

אין ויטרו מידול למחלות נוירולוגיות באמצעות המרה ישירה מפיברובלסטים לתאי אב עצביים ובידול לאסטרוציטים

למד שיטה יעילה להפקת נוירונים מושרים מפיברובלסטים עור מבוגרים תוך 25 יום. שיטה זו מאפשרת מידול מחלות נוירולוגיות תוך שמירה על גיל התאים המקוריים.

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

גלה סרטונים נוספים