סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הדמיית סידן רציומטרית של ההשפעות של נוירון ספציפי להרמפרודיטה, או פעילות HSN, על התנהגות Caenorhabditis elegans. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח ההתנהגותיים לגבי האופן שבו פעילות מעגלים עצביים מייצרת שינויים בהתנהגות בעלי חיים כאשר בעלי חיים מתחלפים בין מצבי התנהגות. טכניקה זו מאפשרת לרשום שינויים בפעילות הסידן התוך-תאית עם יחס אות לרעש גבוה, תוך מעקב אחר התנהגות ותנועה של בעלי חיים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי פעילות עצבית ב-C.elegans, ניתן ליישם אותה גם על מערכות מודל שקופות אחרות כולל זחלי דרוזופילה ודגי זברה. ידגימו איתי את ההליך, תלמידי Collin's Labs: ריצ'רד קופקוק, פראוואט דאקל וליילה נסאר. כדי להרכיב את בעלי החיים, יש למרוח תחילה מזון חיידקי OP50 מצלחת אגר מדיום גידול נמטודה זרוע לתחתית קוטף תולעת פלטינה והשתמש בפיק כדי להעביר כ-20 L מאוחר ארבע L-X 2, 000 לבעלי חיים המבטאים את מדווח הסידן הרגיש GCaMP5 ו-mCherry ב-HSN ממקדם NL שלוש P על צלחת מדיום גידול נמטודות זרע.

אשר את נוכחות הפות המתפתחת תחת מיקרוסקופ סטריאו כנקודה כהה ברורה המוקפת בסהר לבן ודגר על התולעים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 24-40 שעות. בתום הדגירה, יש למרוח OP50 על קטיף חדש ולהעביר שלוש תולעים לצלחת בינונית לגידול נמטודות לא זרועות ולהשאיר חלק קטן של מזון על הצלחת החדשה לתולעים להאכיל במהלך ההדמיה. לאחר מכן, השתמש במרית מעוגלת שטוחה כדי לחתוך נתח בגודל 20 על 20 מילימטר מהצלחת הלא זרועה ולהניח את הנתח, צד התולעת כלפי מטה, על קצה אחד של כיסוי נקי בגודל 24 על 60 מילימטר מספר 1.5.

לאחר מכן, החלק בזהירות את נתח האגר למרכז החלקת הכיסוי והנח החלקת כיסוי מספר אחת בגודל 22 על 22 מילימטר על גבי חתיכת האגר כדי להפחית את ההדבקה והאידוי. כדי להגדיר את ההדמיה, הנח את התולעים על הבמה של מיקרוסקופ הפוך ובחר את הסובייקטיבי פי 20. השתמש בחלקי העיניים המשקפת כדי לבחור תולעת להדמיה והחלק את מסנן האינפרא אדום והנח מעל הקבל.

פתח תוכנית ניתוח וידאו מתאימה והפעל את סקריפט התקשורת הסופי של שלב XY הסדרתי. לחץ על CsvWriter ובחר תיקיה לשמירת המידע המוקלט על שלב X ו-Y. לאחר מכן, לחץ על ראש החץ הירוק כדי לאתחל את תוכנית הרכישה הדיגיטלית.

בתוכנת הקלטת מצלמת האינפרא-אדום תחת הגדרות, בחר Toggle Camera Control Dialog. לאחר מכן בחר בתפריט מצבי וידאו מותאמים אישית ובחר מצב 1 ופורמט פיקסל גולמי שמונה. תחת מהלך טריגר, הגדר את קו הקלט של ההדק לשלוש, את הקוטביות לגבוהה ואת המצב ל-14.

Toggle Enable כדי לעצור את רכישת המסגרת עד לקבלת אות ההדק של המתח ממצלמת הפלואורסצות. כשחלון הצגת התמונות פתוח, לחץ על הקלט ובחר את התיקייה לשמירת רצפי התמונות. בחר Buffered Recording Mode ושמור את התמונות בתבנית JPEG.

לאחר מכן, לחץ על התחל הקלטה כדי לאתחל את הרכישה. לאחר מכן, פתח את הכרטיסייה לכידה בתוכנת רכישת פלורסנט והגדר את זמן החשיפה ל-10 אלפיות השנייה, את ה-Binning ל-4 X ואת עומק התמונה ל-16 סיביות. בחר תת-מערך מצלמה ממורכז של 512 פיקסלים רוחב על 256 פיקסלים גובה.

התוכנית תחלק אוטומטית את התמונה הרחבה לשניים כדי ליצור את ערוצי הפריחה הנפרדים. לחץ על Show Output Trigger Options והגדר את כל הגורמים המפעילים לחיוביים. ודא שהטריגר הראשון והטריגר שניים מוגדרים לחשיפה וטריגר שלוש מוגדר לניתן לתכנות עם פרק זמן של 25 אלפיות השנייה.

לאחר מכן, תחת הכרטיסייה רצף, בחר Time Lapse תחת הגדרות סריקה, הגדר את עיכוב השדה בין 1 ל-50 אלפיות השנייה כדי לאסוף תמונות ב-20 הרץ. בחר שמור במאגר זמני. עבור הדמיית סידן רציומטרית, תחת הכרטיסייה רצף, לחץ על התחל כדי להתחיל להקליט ולעקוב אחר התולעת עם הג'ויסטיק תוך שמירה על התאים והסינפסות של העניין במוקד במרכז שדה הראייה.

ברגע תחילת הקלטת התפריחה, נשלחים טריגרים למצלמת השדה הבהיר הממתינה ולבקר הבמה שמתחילים לאסוף תמונות מסונכרנות ומיקום במה. לחצו על הלחצן 'סטטיסטיקה' בחלון 'היסטוגרמה' להצגת סטטיסטיקת פיקסלים לכל ערוץ. כוונן את עוצמת ה-LED כדי להבטיח פיקסל בודד מקסימלי של תפרחת mCherry בקצה הפרה-סינפטי של גדול או שווה ל-8,000 ספירות בערוץ האדום, מה שנותן טווח דינמי של כ-12 סיביות מעל הרקע.

אותות מדווח הסידן בקצה הפרה-סינפטי במהלך מנוחה או סידן נמוך צריכים להיות בסביבות 2,500 ספירות בערוץ הירוק. רשום את ההתנהגות עד להגעה למצב פעיל של הטלת ביצה אחת. לאחר מכן, שמור תת-קבוצה של 10 דקות המכילה 6,000 פריימים לפני ו-6,001 פריימים אחרי אירוע הטלת הביצים הראשון.

הקפד לשמור על אותה תת-קבוצה של תמונות שדה בהיר של התנהגות תולעת ונקודות זמן של מיקום שלב XY אחרת הסנכרון המדויק של זרמי הנתונים יאבד. עבור פילוח תמונה, ייבא את רצפי התמונות לתוכנית תוכנת קוונטיזציה רציומטרית מתאימה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על סדרת הזמן בכרטיסיית הרצף כדי להגדיר את סדרת הזמן ל-20 פריימים לשנייה ו-1.25 מיקרומטר לפיקסל. תחת תפריט כלים, בחר יחס ולאחר מכן בחר mCherry עבור ערוץ A ו- GCaMP5 עבור ערוץ B ולחץ על חשב כדי להחסיר את הרקע מכל רצף תמונות.

בחר החל טבלת חיפוש קשת בערוץ היחס והשתמש בערוץ mCherry כדי ליצור ערוץ יחס מאופנן עוצמה כדי למפות את צבע היחס על הבהירות של ערוץ mCherry . לחץ על יחס כדי ליצור את שני הערוצים. כדי ליצור בפרוטוקול איתור אובייקטים, גרור את הכלי Find Objects using intensity תחת לשונית המדידות לחלונית הפרוטוקול ולחץ על גלגל השיניים כדי להגדיר את החלון של ערכי עוצמת mCherry ולחפש אובייקטים.

בחר ערכי עוצמה גדולים או שווים לשתי סטיות תקן מעל הרקע תוך הקפדה על זיהוי גוף התא והקצה הפרה-סינפטי. הוסף מסננים נוספים המכוונים לערוץ mCherry רק לפי הצורך כדי לא לכלול אובייקטים לא רצויים, כגון: ראש, זנב או תפרחת מעיים. לאחר מכן, פתח את תפריט מדידות ובחר הפוך פריט מדידה ובחר את כל נקודות הזמן כדי לבצע פרוטוקול ניתוח קוונטיזציה של תמונה.

רכישה בו-זמנית של אותות תפרחת GCaMP5 ו-mCherry משמשת ליצירת ערוץ יחס פיקסל אחר פיקסל המפצה על שינויים בתנועה ובמיקוד של בעלי חיים. עבור כל בעל חיים, שינויים בסידן HSN תוך-תאי פרה-סינפטי יכולים להיות בקורלציה עם התנהגויות הניכרות בהדמיית שדה בהיר כולל שחרור ביציות ושינויים בתנועה. ואכן, ניתן להבחין בהבדלים משמעותיים במהירות התולעת לפני, במהלך ואחרי המצב הפעיל של הטלת הביצים.

התקרבות לאירוע הטלת ביצים אחד, מגלה שינוי משמעותי בפריחה של GCaMP5 לפני אירוע הטלת הביצים. בעוד שהפריחה של mCherry נשארת יחסית ללא שינוי. בנוסף, שינויים שנמדדו ביחס GCaMP5:mCherry מראים בבירור חולף סידן HSN כ-4 שניות לפני שחרור הביצית.

המשך התכווצות שרירי הפות ניכרת בהאטה ברורה של תנועת התולעים שמסתיימת בשחרור ביציות. יתר על כן, הדמיה ומעקב אחר התולעים כפי שהודגם זה עתה, מאפשרים הדמיה של הארגון המרחבי של התנהגות הטלת הביצים מחיפוש מזון, שינויים חולפים בסידן HSM ופעילות HSN שעוברת לירי פרץ לפני תנועה למקום הטלת הביצים. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעה או שעתיים, אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על מיקוד בתאים המעניינים ובמסופים הפרה-סינפטיים שלהם במהלך שלבי ההדמיה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון הפעלה אופטוגנטית, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו HSN מגיב לגירוי פרה-סינפטי. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את תפקוד מעגל הטלת הביצים ב-C.elegans.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הדמיית סידן רציומטרית של HSN ב- Caenorhabditis elegans פעיל.