Name: סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: למד הדמיית סידן רציומטרית של פעילות נוירונים HSN ב Caenorhabditis elegans מתנהגים. שיטה זו מאפשרת לחקור את הקשר בין פעילות מעגלים עצביים להתנהגות בעלי חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו מומן על ידי מענק מ NINDS KMC (R01 NS086932). LMN נתמך על ידי מענק של התוכנית NIGMS IMSD (R25 GM076419). זנים השתמשו במחקר זה C. elegans מרכז הגנטיקה, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). אנו מודים ג'יימס בייקר, מייסון קליין על דיונים מועילים.

1. זנים, תרבות בתקשורת, ואני הולכת וגוברת של בעלי חיים
<ol><li>לגדול בתולעים המוטנטיות ב 20 מעלות צלזיוס על תקן 60 מ מ בינוני צמיחה תולעים נימיות (NGM) אגר צלחות עם מזון חיידקי e. coli . OP5019.</li>
	<li>להתכונן פלסמידים 2 כל יזם תא ספציפי של עניין: אחד, נהיגה הביטוי של GCaMP5 כדי להקליט תאיים Ca2 +, ואת השני, נהיגה הביטוי של mCherry כדי לאפשר רציומטרי כימות של שינויים זריחה GCaMP5 ו לפשט את מציאת האובייקט ומדידה. הערה: מתקן הדמיה רציומטרי GCaMP5:mCherry על תנודות GCaMP5 זריחה הנובעים מביצוע שינויים בתנועה המוקד של בעלי חיים, שינויים לא בפועל ב Ca תאיים2 +.</li>
	<li>מזריקים GCaMP5 - ו mCherry-ביטוי פלסמידים יחד עם פלסמיד סמן הצלה גלויה pL15EK לתוך הגונדות של LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X חיות מוטציה ולשחזר חיות lin-15(+) הלא-Muv לבטא GCaMP5 ו mCherry מ- high-עותק transgene20,21,22. השתמש ברקע מוטציה לייט-1 אור כחול הימנעות התנהגות23,24.</li>
	<li>שלב transgenes כדי כרומוזומים כדי להפחית פסיפס ולפשט את הדור של זנים מוטציה מתחם25. הערה: המתח LX2004 המתוארים כאן נושא transgene גבוהה-העתק של משולב, המבטאת GCaMP5 ו- mCherry, HSNs של האמרגן nlp-3 (ראה טבלה של חומרים)26,27, 28 , 29. האמרגן nlp-3 נמצא ביטוי חזק כונן HSNs של L4 מאוחר ובעלי למבוגרים ללא גרימת פגמים משמעותיים HSN פיתוח או התנהגות להטלת ביצים, בהשוואה היזמים האחרים שנבדקו (e.g.,tph-1. egl-6ו- unc-86). זן זה ואחרים לבטא GCaMP5 ו- mCherry הגחוני כבל (VC) מוטורי לגלוקוז, שרירי vulval, וכן תאים נוירואנדוקריניים uv1 הינם זמינים מן המרכז גנטיקה Caenorhabditis , הפרטים של הבנייה שלהם תוארו 27.</li>
	<li>החל OP50 חיידקי מזון מן צלחת אגר NGM הזריעה לתחתית של תולעת פלטינה לבחור, ולהשתמש בו כדי להעביר ~ 20 חיות L4 LX2004 מאוחר לבטא GCaMP5 ו- mCherry, HSNs של האמרגן nlp-3 . ודא כי הפות המתפתח מופיע ב- stereomicroscope כמו כתם כהות מוקף סהר לבן. דגירה חיות ב- 20 ° C עבור h 24-40.</li>
	<li>לאחר הדגירה, להחיל את OP50 על האיסוף והעברת ~ 3 של התולעים על צלחת NGM unseeded, להשאיר כמות קטנה של אוכל. מאחורי לתולעים להאכיל על במהלך דימות. להבטיח מספיק אוכל, מזון חיידקי מעט מדי תעודד את התולעים להתרחק ממרכז הצלחת בזמן יותר מדי אוכל להגדיל את רקע זריחה ולגרום היפוקסיה.</li>
	<li>להשתמש במרית שטוחה מעוגלים כדי לחתוך ~ 20 מ מ x 20 מ מ צ'אנק מהצלחת נושאת את התולעים ולהעביר את צ'אנק, פנים כלפי מטה במרכז coverslip נקי 24 מ"מ x 60 מ"מ #1.5 (איור 1). הפעל את היישום מצד אחד למנוע בועות להיות לכודה תחת coverslip ו מתערב עם הדמיה. החל coverslip של 22 מ"מ x 22 מ"מ #1 לחלק העליון של גוש כדי להפחית דבק ואת אידוי.</li>
</ol>2. החומרה וההתקנה אינסטרומנטציה
<ol><li>מקם את בשלבים, תולעים הטרנסגניים לבמה של מיקרוסקופ הפוך עם ≥ 0.7 מספרי הצמצם תוכנית-עדשה אפוכרומטית 20 x אובייקטיבי, ממונע XY הבמה לשליטה באמצעות ג'ויסטיק, מפצל תמונה ו קרינה פלואורסצנטית מסננים עבור GCaMP5 בו זמנית, mCherry עירור פליטה, מצלמות brightfield קרינה פלואורסצנטית ואינפרא הדמיה, מערכת תאורה דיודות פולטות אור (LED) triggerable (איור 2א). הערה: 80/20 קרן-ספליטר שולח 80% של האות תמונות עם המצלמה פלורסצנטיות ו-20% על המצלמה brightfield. ניתן להשתמש במיקרוסקופ זקוף, אך גוש NGM צריך להיות ממוקם בין זכוכית את coverslip גדול במקרה זה.<ol>
<li>השתמש עיניות המשקפת את לבחירת תולעת עבור הדמיה. כשבוחרים חיה, להחליק את מסנן האינפרא-אדום במקום מעל מעבה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>טרנזיסטור-טרנזיסטור לוגיקה (TTL) מפעילים<ol>
<li>לחבר כבלים קואקסיאליים מכל שלושת TTL ההדק פלט הקווים על המצלמה זריחה. לחבר את הפלט הראשון לקלט BNC #3 של מערכת תאורה LED.</li>
		<li>התחבר הפלט השני למתאם 'בננה' BNC עם ירוק, חום חוטים מהמחבר GPIO 8 פינים רץ GPIO קלט #3 (pin 4) ואת הקרקע (pin 5) של מצלמה אינפרא-אדום, בהתאמה.</li>
		<li>הפלט השלישי מתאם BNC 'בננה' עם מגשר חוטים רץ לכניסה דיגיטלי #8 על הקרקע במכשיר רכישה דיגיטלית (איור 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>המכשיר רכישת דיגיטלי (DAQ)<ol>
<li>חבר מועצת המנהלים של מיקרו-בקר DAQ (ראה טבלה של חומרים) למחשב באמצעות כבל USB. לעדכן את הקושחה עם תקן Firmata פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים) ולהגדיר את יציאת ה-USB כדי לתקשר-57600 באוד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נוריות<ol>
<li>להפעיל את התוכנה LED בקר (ראה טבלה של חומרים). לעבור את מפעיל מצב של 'רציף ועד 'מגודרת' בחר גורם מפעיל ערוץ ' 3' עבור שניהם 470 ו 590 nm נוריות.</li>
		<li>הפעל והזן LED כוח עבור כל LED (למשל, סט 470 ננומטר LED 20%, ה-LED nm 590 ל-40%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל את קובץ ה-script 'XY-שלב-גמר' בונסאי (ראה טבלה של חומרים) תקשורת טורית-שלב30. לחץ על הצומת 'CsvWriter' אפור ובחר תיקיה לשמור שנרשמו X ו- Y שלב מידע (איור 3). הקש על החץ הירוק בסרגל הכלים כדי לאתחל את DAQ. הערה: קובץ ה-script יתחיל להקליט את מיקום הבמה X ו- Y כאשר המצלמה פלורסצנטיות שולח אות TTL. קובץ script זה פלטי ארבע עמודות של נתונים: מסגרת מספר, X עמדה (מיקרומטר), מיקום Y (מיקרומטר) ו את מרווח הזמן בין מסגרות (s).</li>
	<li>מצלמה אינפרא אדום הקלטה תוכנה (ראה טבלה של חומרים) תחת "מצבי וידאו מותאם אישית," בחר "מצב 1" (2 x 2 binning; 1,024 x 1,024 פיקסלים), ואת "פיקסל בפורמט Raw 8". תחת ' המפעיל / Strobe', הגדר את ההדק קו הקלט (GPIO) 3, קוטביות 'גבוהה', 'מצב' "14". לעבור 'אפשר' תפסיק מסגרת רכישה עד קבלת אות ההדק TTL.<ol>
<li>עוזב את החלון פתוח, לחץ על הכפתור האדום "שיא" בסרגל הכלים תצוגת המצלמה הראשית. בחר את התיקיה עבור רצפי תמונות להינצל. בחר 'Buffered' הקלטה במצב ושמור 'תמונות' בתבנית JPEG. לחץ על "התחל הקלטה" לאתחל את הרכישה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מפצל מצלמה ותמונה קרינה פלואורסצנטית הערה: GCaMP5 וערוצי זריחה mCherry יש לאסוף בו זמנית כדי להבטיח תמונה נכונה ההרשמה רציומטרי כימות. הפיצול התמונה מאפשר רכישת שני ערוצים של זריחה GCaMP5 ו- mCherry על גבי חיישן אחד.<ol>
<li>בכרטיסיה 'ללכוד' של התוכנה רכישת התמונה (ראה טבלה של חומרים), זמן החשיפה set כדי 10 ms, binning 4 x ולאחר עומק תמונה 16 סיביות. בחר subarray של המצלמה ממורכז של 512 פיקסלים לרוחב על 256 פיקסלים גבוהה. לחצו על 'הצג פלט להפעיל אפשרויות' וקבעו כל המפעילים כדי 'חיובית'. הערה: DAQ יכול מדי פעם לפספס גורמים מפעילים TTL אם הם 10 ms או פחות.</li>
		<li>ודא 'המפעיל 1' ו- 'המפעיל 2' הם 'חשיפה' ואילו 'מפעיל 3' מוגדר כ- 'לתכנות' עם 'תקופה' של גב' 25 תחת הכרטיסייה 'רצף', בחר 'זמן לשגות' עם 'Delay1 שדה' של 50 מילישניות לאסוף תמונות ב- 20 הרץ. בחר באפשרות 'שמור למאגר זמני.'</li>
	</ol>
</li>
	<li>PMT לקבל, לייזר בעוצמה במהלך דימות קונאפוקלית ערוץ 3<ol>
<li>הגדר את רווח PMT כך הרקע הוא ברמה ממש מעל המינימום (רמת השחור). להגדיל את עוצמת הלייזר (ירוק) nm 561 עד פיקסל 12 סיביות או 16 סיביות רווי בודד נצפית התחנה הסופית presynaptic בערוץ mCherry.</li>
		<li>להתאים 488 ננומטר לייזר (כחול) עוצמת כך GCaMP5 הוא גלוי רק בקצהו presynaptic מעל הרקע. הגדרה נמוכה זו מונעת את הרוויה של הפיקסלים GCaMP5 כאשר קרינה פלואורסצנטית שמגביר בתגובה חזקה Ca2 + תופעות מעבר. פתח את חריר קונאפוקלית כל הדרך כדי למקסם ללכוד אור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. רציומטרי Ca2 + הדמיה והקלטה התנהגות
<ol><li>תחת לשונית 'רצף' בתוכנה רכישה פלורסצנטיות, לחץ על "התחל" כדי להתחיל את ההקלטה. מסלול התולעת עם הג ' ויסטיק, שומר את תא (ים) ואת הסינפסות עניין בפוקוס ועל במרכז שדה הראייה (FOV). לחץ על לחצן 'סטטיסטיקה' בחלון היסטוגרמה להראות פיקסל סטטיסטיקה של כל ערוץ.</li>
	<li>להתאים את הכוח LED כדי להבטיח פלורסצנטיות מרבי mCherry פיקסל בודד-התחנה הסופית presynaptic של ≥ 8,000 סעיפים (~ 4,000 photoelectrons), נתינה ~ 12 סיביות טווח דינמי מעל הרקע (~ 100 photoelectrons). אותות GCaMP5 התחנה הסופית presynaptic במהלך מנוחה Ca (נמוך)2 + צריך להיות סביב ~ נחשב 2,500 - רק בחציו רקע.</li>
	<li>להקליט עד למצב פעיל להטלת ביצים אחד; זה מתרחש בדרך כלל כל 20-30 דקות ב- פראי-סוג תולעת7. שמור ערכת משנה 10 דקות (מסגרות 12,001), מסגרות 6,000 לפני ואחרי להטלת ביצים האירוע הראשון (מסגרת 6,001). הקפד לשמור את המשנה זהה של brightfield תמונות של תולעת ההתנהגות ואת timepoints של XY הבמה עמדה, או הסינכרון מדויק של זרמי נתונים יאבדו.</li>
	<li>השתמש ImageJ את התוסף BioFormats (ראה טבלה של חומרים) כדי להמיר רצפי תמונות בפורמט תמונה Cytometry רגיל (.ics) כך זה ניתן לייבא לתוך התוכנה רציומטרי כימות.</li>
</ol>4. התמונה פילוח וניתוח כמותי
<ol><li>רצפי תמונות לייבא התוכנה כימות רציומטרי (ראה טבלה של חומרים). לחץ על 'ניגוד אוטומטי' בתפריט 'כלים', והתאם את החדות של כל אחד מערוצי להקים שחור המתאים (~ 1,800) ולבן רמות (10,000). בחר 'שינוי הצבעים...' בתפריט כלים כדי לוודא ש- mCherry ו GCaMP5 ערוץ הקצאות צבעים הם הנכונים (איור 4א - ג).<ol>
<li>לחץ לחיצה ימנית על סדרת הזמן בכרטיסיה 'רצף' ולהגדיר אותו 20 מסגרות/s ו- 1.25 מיקרומטר לפיקסל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר 'יחס' בתפריט 'כלים' ובחרו "GCaMP5" עבור "ערוץ A" ו- "mCherry" עבור 'ערוץ B'. לחץ על "חשב" ליד 'סף' כדי לחסר את הרקע של כל רצף תמונות. בחר "החל קשת LUT לערוץ יחס". הערה: לצורך הקלטה עם יחס אכזרי בסיסית של 0.3 (נמוך Ca2 +), יחס מקסימום של 2-3 (גבוהה Ca2 +), טבלת בדיקת מידע מתאים יהיה בין 0 (כחול) 1 (אדום).</li>
	<li>ליצור ערוץ עוצמת מאופנן יחס באמצעות תעלת mCherry (איור 4D). ערוץ עוצמת מאופנן יחס היא תמונה מיליונים-של-צבעים שבו הצבע יחס ממופה על הבהירות של הערוץ mCherry.</li>
	<li>תחת לשונית 'המידות', ליצור פרוטוקול למציאת אובייקט על-ידי גרירת הכלי 'למצוא אובייקטים באמצעות עוצמת' לחלונית 'פרוטוקול'. לחץ על 'קוג' כדי להגדיר החלון של mCherry ערכי העוצמה ולמצוא את האובייקטים.<ol>
<li>בחר בעוצמה ערכים ≥ 2 סטיות תקן (SD) מעל הרקע (למשל, הגבול התחתון של ~ 2,500, הגבול העליון של 65,535). ודא הסופית presynaptic מזוהה זה 'באופן אוטומטי עדכון משוב' נבחרה בתפריט מדידות. הערה: התוכנה יכולה גם לזהות עצמים לפי סטיית תקן שלהם רקע באמצעות פרוטוקול קשורים 'עוצמת SD.' עם זאת, אם אובייקט בהיר במיוחד נכנסת של FOV, זה יכול באופן דרמטי עוצמת רשע במהלך שינוי timepoints האלה, המשפיעים על המכנסונים עוצמת נהגה למצוא את HSN. ההשתנות לא יתרחש אם ערכי העוצמה raw משמשים כדי למצוא חפצים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף מסננים נוספים מיקוד רק בערוץ mCherry (גודל, עוצמה מקס, וכו ') במידת הצורך לא לכלול אובייקטים לא רצויים כמו ראש, זנב, בטן זריחה. בחרו 'לבצע מדידה פריט' מתפריט מדידות ובחרו 'Timepoints כל.' הערה: זה תתבצע הפרוטוקול, לכתוב כל המדידות קובץ ערך מופרד באמצעות פסיק (. csv) לייצא באמצעות הפקודה 'ייצוא' מתפריט ' קובץ '.</li>
	<li>פתח קובץ exported.csv והעתק Timepoint, אזור (2מיקרומטר), אומר (יחס ערוץ), Centroid X (מיקרומטר) ונתונים Centroid Y (מיקרומטר) לתוך גיליון חדש. ייצוא קובץ a.csv ללא כותרות עמודה. התוכנה רציומטרי כימות עשוי לסווג תא עניין בתור אובייקט אחד או יותר לכל timepoint.<ol>
<li>כדי נגרם אובייקטים אלה, השתמש סקריפט מותאם אישית 'AnalzyeGCaMP_2017.m'. הערה: קובץ ה-script גם מזהה Ca2 + (יחס) פסגות בנתונים, ושומר a.csv קובץ של timepoints שלהם, amplitudes שיא שיא רוחבי. זה גם מייצר קובצי postscript עקבות יחס raw, המבואר. בעזרת מידע זה, Ca2 + ארעי משרעת ומרווח בין-ארעי צריך להיקבע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף פלט X וערכי Y centroid מכל אובייקט זריחה על הערכים X ו- Y הוקלט על ידי סקריפט XY-שלב של בונסאי. השתמש המיקום XY נטו כדי ליצור עקבות ומכניקה תולעת לחשב הזחה תא והמהירות המלוות התנהגות שונה הברית31.</li>
	<li>לייבא את התמונות מוקלט brightfield ImageJ כמו ערימה וירטואלי. הוספת ביאורים אירועים להטלת ביצים, התנהגויות אחרות. להשוות את התזמון של אירועים אלה Ca2 + פסגות מהעקבות יחס.</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים קיימים.

Transgenes:
משום mCherry ביטוי שופרה דרך הכניסה codon-אופטימיזציה ואינטרון (ויש עיתונאים GCaMP הזמינה ביותר לא), להזריק ~ 4 x כמות פלסמיד מביע GCaMP5 כדי להבטיח רמות דומות של זריחה GCaMP5 במהלך Ca חזק 2 + תופעות מעבר. חילוץ של המוטציה lin-15(n765ts) מאפשר התאוששות נתיישב של חיות הטרנסגניים עם תופעות מינימליות להטלת ביצים ואת שאר התנהגויות35. Transgenes צריך להיות משולב כדי להבטיח תנאים בין בעלי חיים שונים25ביטוי אחיד והדמיה. סמני לבחירה כולל עמידות לאנטיביוטיקה36,37 והצלה של lethals הרגיש38 צריך גם לעבוד, אלא, משום שאינם הטרנסגניים בעלי חיים מתים, אישור של אינטגרציה transgene ו homozygosity קשה יותר בהשוואה סמני שמציגים של פנוטיפ גלוי25. סמנים דומיננטי לשבש ומכניקה נורמלי ולא להקטין כושר, כגון rol-6(dm), צריך להיות נמנעה39. הדמיה לייט-1 רקע מוטציה חיוני כדי להפחית את הבריחה אור כחול תגובות במהלך23,הדמיה40,41. מוטציה נוספת של גור-3, הפועל במקביל ל- lite-1, אפשר להוסיף ולצמצם את התנהגות שיורית ושינויים פיזיולוגיים הנגרמת על ידי אור כחול42. בנוחות, גור-3 lite-1, לין-15 כולם ממוקמים על החצי נכון של כרומוזום X, אשר צריך לפשט הבנייה של זנים חדשים עבור Ca2 + הדמיה וניסויים optogenetic.
מכיוון פעמים חשיפה קצרה תמונות נאספים ב 20 הרץ, GCaMP5, mCherry אותות חייב להיות בהיר. ההסבר הסביר ביותר עבור Ca רועש2 + הקלטות הוא עמום פלורסצנטיות הנגרמת על ידי ביטוי עיתונאי חלש. היזמים צריכים להיות גם סביר ספציפי עבור האזור להיות עם תמונה. בגלל HSN תא ובגוף הסינפסות על השרירים vulval במרכז הגוף, ביטוי נוסף מ האמרגן nlp-3 בראש וזנב בדרך כלל בחוץ שדה הראיה, יכול ייכללו שימוש במסננים נוספים ב- תוכנה רציומטרי כימות. כדי להבטיח כי נצפו שינויים GCaMP5 קרינה פלואורסצנטית כתוצאה משינויים בפועל Ca תאיים2 +, transgenes שליטה לבטא GFP במקום GCaMP5 כדאי להיערך באופן עצמאי וניתח26. Ca2 + כתבים חדשים עם שונה Ca2 + רגישויות, קינטיקה וצבעים הרחיבו את הבחירה של הדמיה כלים זמינים, אך כל הכתב החדש לאמת באמצעות Ca2 +-variant פלורסנט רגישות14 ,16.
מדיה:
NGM לוחות עבור הדמיה צריך להיות מוכן עם אגר באיכות גבוהה. אגר באיכות נמוכה לא יימס לחלוטין על autoclaving, עוזב את פיזור האור במהלך דימות, והגברת רקע זריחה חלקיקים קטנים. ביולוגיה מולקולרית כיתה agarose יכול לשמש במקום, אבל צריך להיות מופחת הסכום הוסיף כדי לשמור על צלחת המקביל מוצקות.
השוואות לשיטות אחרות הרכבה:
גישות הקודם תמונת פעילות המעגל ההתנהגות להטלת ביצים השתמשו תולעים עם הדבק אל רכיב pad agarose. מרותק למיטה. תחת תנאים אלה, פעילות מעגל ההתנהגות להטלת ביצים אינה המועדף ללא ירידה תרבות המדיה osmolarity8,10,44,45. ממצאים אחרונים מעידים כי מספר התנהגויות תולעת הם מווסת על ידי המדינה גפיים, העלאת שאלות על מערכת היחסים של פעילות התאים שנצפה בחיות קיבוע כי ראיתי בחיות מתנהגות באופן חופשי. אנחנו הראו לאחרונה כי פעילות מעגל להטלת ביצים באופן בלתי צפוי בהדרגה עם גפיים26,27. באופן דומה, ממודר Ca2 + איתות ב interneuron ריאה משלבת פעילות נוירונים סנסוריים, ראש מוטורי לגלוקוז במהלך שיחור מזון בתנועות46. התנהגות מפיסורה מלווה גם שינוי מדויק, סטריאוטיפית ומכניקה המאפשר לבעלי תעבור מקומם הרעיה לפני סילוק פסולת47. יחד, תוצאות אלה מראים כי הקלטות קצרה של מעגל הפעילות מחיות קיבוע עשוי להיות שונה בתכלית מכל אלה בשנת בחיות מתנהגות באופן חופשי.
למרות היותו ישירות מתחת coverslip, ההתנהגות של התולעת דומה אליו לראות את לוחות NGM סטנדרטי. ביצים הניח תמשיך לבקוע, ומאפשר כמות קטנה של אוכל להפקיד את הזחלים L1 לגדול לתוך מבוגרים (נתונים לא מוצג). גודל גוש גדול אגר מאפשר חילוף הגזים סבירה, המתנגד התייבשות, למרות יותר מדי אוכל יגדל רקע זריחה. אמנם שיטה זו פועלת הטוב ביותר עבור מבוגרים, הטכניקה גם ניתן לבעלי L4 התמונה. עם זאת, עובי השכבה המימית בין גוש של coverslip הוא כזה זחלים קטנים יותר יש קושי זוחל, יכול לעיתים קרובות להילכד בעקבות של מבוגר נע.
מגבלה של טכניקה זו הרכבה הוא כימי מכניים או גירוי ישיר לאזורים מדויקים של הגוף הוא קשה. התפתחויות בטכניקות תאורה בדוגמת מאפשרים את עירור נפרד של הראש או הביע את הזנב opsins חיידקים עם תאורה נפרדים וזיהוי של GCaMP/mCherry זריחה ב- the midbody48,49. כתוצאה מכך, ייתכן שתהיה אפשרות להתגבר על בעיה זו באמצעות גישות optogenetic.
השוואות ל Ca אחרים 2 + הדמיה גישות:
שיטה זו עובדת היטב עבור הקלטה שינויים cytoplasmic Ca2 + של יחיד, נפתרה תאים ואזורים הסינפטית שלהם. הדמיה בזמן אמת, נפח של נוירונים בראש לאחרונה הושגה באמצעות המיקום של גרעין התא עבור זיהוי תא, quantitate לשינויים סידן nucleoplasmic50,51,52. היחסים בין גרעינית, סינפטית Ca2 + עדיין לא ברור. הנתונים שלנו להציע שהשינויים הבולטים HSN תאיים Ca2 + מתרחשים טרמיני presynaptic הרחק סומה תא (איור 4D). טרמיני presynaptic של HSN, הנוירונים VC מוטבעות postsynaptic שרירי vulval26. לא ברור אם יהיו מספיק רזולוציה בממד Z אפילו עם ספינינג דיסק או טכניקות אור גיליון לייחס presynaptic Ca2 + אותות תאים ספציפיים מבלי להסתמך בצורה כלשהי על סידן סומאטית לזיהוי תא . תוך שימוש בטכניקות המתוארות כאן, כל 10 דקות, שני ערוצים הקלטה עם 12,001 256 x 256 פיקסלים 16 סיביות TIFF תמונות ~ 4 ג'יגה-בתים. היחס מאופנן יחס ועוצמה ערוצי כפול גודל הקובץ כדי ~ 8 ג'יגה-בתים. ניסוי טיפוסי הקלטה 10 חיות מכל שני אחרים (פראי-סוג, ניסיוני) יוצר כמעט 150 ג'יגה-בתים של נתונים עיקריים ודורשת 20 h לאסוף ולנתח. ניתוחים volumetric עם 10 פרוסות Z לכל timepoint ידרוש בסדר גודל יותר נתונים וזמן אנליטית, שמסביר למה כל כך מעט מחקרים כאלה הושלמו.
חומרה:
אנחנו לתעד ולנתח רצפי תמונות בתחנות מעבד כפול עם ביצועים גבוהים וכרטיסים גרפיים (למשל, המשחקים), 64 ג'יגה-בתים של זיכרון RAM, וכונני solid-state ביצועים גבוהים (ראה טבלה של חומרים). הנתונים צריכים להיות המאוחסנים ברשת מערך יתיר של דיסקים עצמאיים (RAID), גיבוי לענן-מרכז נתונים מחוץ לאתר.
אנו ממליצים על שימוש ובעוצמת ממוקדת נוריות עבור עירור קרינה פלואורסצנטית פעמו halide ממתכת או מבוסס כספית מקורות אור. מספר מערכות LED צבע רב זמינים מסחרית זמינים. בעוד כמה מהמערכות הללו LED יש עלות גבוהה יותר מראש, הם חיים ארוך (> 20,000 h), יכולים בו זמנית לרגש ארבעה או יותר fluorophores שונים, ולהציע שליטה טמפורלית מדויקת באמצעות סדרתי ו/או TTL ממשק עם השהיה נמוכה (10-300 µs לעבור זמן). מפעילה מבטיחה כי המדגם מואר רק כאשר נתונים למעשה הנאספות. אנו משתמשים בדרך כלל חשיפה של 10 ms כל 50 מילישניות (20% שיעור חובה). זה מפחית phototoxicity, טשטוש תנועה במהלך לכידת תמונה, כפי שדווחה בעבר43.
אנו משתמשים sCMOS מצלמות מהירות, מערך גדול של פיקסלים קטנים, רגיש. מצלמה EM-CCD הוא חלופה יותר יקר, אבל אפקטים 'לפרוח' יכול לגרום photoelectrons שנתפסו לשפוך לתוך פיקסלים סמוכים. מצלמות sCMOS בחזרה מואר חדשות יש רגישות דומה של EM-CCDs במחיר מוזל משמעותית. בלי קשר חיישן אשר משמש, הערוצים GCaMP5 ו- mCherry יש להשיג בו זמנית. לכידת רציפים במעבר תולעים תוביל לתמונות לקוי רשום מתאים רציומטרי כימות. ערוץ כפול הדמיה יכול להתבצע לתוך מצלמה אחת לאחר פיצול של ערוצים באמצעות הפיצול של התמונה (איור 2) או באמצעות שתי מצלמות זהים. הטווח הדינמי של 16 סיביות תמונות מומלץ על רקע תמונות של 8 סיביות עבור כימות מדויק רציומטרי. לתמונות brightfield של אופן פעולה של תולעת, תופסים בעזרת מצלמה USB3 in 1. 4.1-סגול MP כדי ללכוד גדולים 2 x 2 רצפי תמונות 8 סיביות 1,024 x 1,024 נשברתי לאחר דחיסת JPEG. FOV גדול יותר זמין על הדגמים המיקרוסקופ מאפשר של התולעת הבוגרת ניתן לאבחן ב- 20 x לאחר 0.63 x demagnification עם רק קלה פינות כהות (איור 4E).
אנו ממליצים להשתמש אותות מתח אורך חיים רגיל כדי לסנכרן תאורה ו לכידת מסגרת. בגלל השהיות פוטנציאליים בתוכנות שונות, מומלץ למשתמשים להגדיר המצלמה פלורסצנטיות עם ההדק פלטי כמאסטר עם תפוקות TTL נהיגה כל ההתקנים האחרים. בדרך זו, brightfield ומידע מיקום הבמה ייאספו למדידה כל2 + Ca.
שסע - או תהודה לסריקת נקודת קונאפוקלית מיקרוסקופים נמצאו בדרך כלל מתקנים קונאפוקלית משותפים גם לתת ביצועים מצוינים במהלך רציומטרי Ca2 + הדמיה. כלי כזה יכול לשמש כדי ללכוד שניים או יותר קרינה פלואורסצנטית ערוצים יחד עם brightfield24. במקרה זה, חריר קונאפוקלית אמור להיפתח כדי הקוטר המרבי שלה, גלאי ספקטרלי אמור לשמש כדי להפריד בין GCaMP5 mCherry, אותות אינפרא-אדום brightfield. זה הגדלת אוסף אור מ עבה (~ 20 מיקרומטר) פרוסה תוך מתן אפשרות דחייה של out-of-להתמקד זריחה. אחת החיסרון הוא של FOV קטנים יותר, מגבלות נוספות עבור התאמה אישית חומרה ותוכנה.
תוכנה:
רוב היצרנים הספינה ולהתקין מצלמות ומיקרוסקופים שלהם בתוכנה קניינית, כולל תצורת מפעילה כניסות ויציאות. התכונות והביצועים של תוכנה זו במהלך ההקלטה יכול להשתנות. כי עובר מהר תולעים עשויה להיות מאתגרת כדי לעקוב אחר, תמונה תצוגה במהלך ההקלטה צריך להיות חלקה ויציבה ב 20 הרץ. כדי לשפר את הביצועים, רצפי תמונות ניתן באופן זמני לשמור בזיכרון RAM עם קבוצות משנה בהתנהגותו הרלוונטיים הצילה בסוף הניסוי. קבצים אלה רצף תמונות בשני ערוצים ניתן להמיר לתבנית תמונה Cytometry הסטנדרטית פתוחה (.ics) עבור ייבוא לתוך התוכנה רציומטרי כימות. הביתה-TIFF הוא פורמט פתוח תמונה עדכנית יותר, למרות התקנות שונות עשויים להיות מסוגל להציל את רצפי תמונות TIFF גדול מ- 4 ג'יגה-בתים.
תכונה מרכזית של הצינור כימות הוא הדור של הערוץ יחס ולאחר מכן שגרת פילוח מוטים התמונה באמצעות קרינה פלואורסצנטית mCherry כדי למצוא תאים עניין. מכל אובייקט מצאה, את גודל אובייקט העמדה centroid XY, המינימום, כלומר, מחושבים ערכי העוצמה פלורסצנטיות המרבי לכל ערוץ (כולל את הערוץ יחס). יחד, ערכים אלה משמשים quantitate שינויים תאיים Ca2 + על כל timepoint בהקלטה. מידות האובייקט עבור כל timepoint ואז מיוצא כקובץ a.csv עבור ניתוחים שלאחר מכן.
מגבלה משמעותית של הפרוטוקול המתואר כאן הוא התלות העברת הנתונים בצורות שונות באמצעות טלאים של מוצרי תוכנה. גירוי נוסף הוא חלק של התוכנה הוא פתוח, חינם בזמן שאחרות סגורות, יקרה ומתעדכן לצר. שיפור משמעותי יהיה להשתמש או לפתח חתיכה אחת של התוכנה (אידיאלי פתוח) המספק רמות דומות של ביצועים, נוחות השימוש משלב הרכישה לניתוח. כפי שצוין לעיל, ניתוח רציומטרי מכפילה את גודל הקובץ ואת משך הזמן הנדרש להשלמת ניסוי. דור של מנהלי התקנים המצלמה בה ניתן לשלב להתאמה אישית משתמש במסגרות כמו בונסאי יאפשר אחרים זרמי נתונים שנאספו, ניתח ותמונות בתפוקה בזמן אמת, שיפור משמעותי.
לעתיד להתרחש:
בזמן שאנחנו בדרך כלל לעקוב אחר תנועות תולעת באופן ידני, מעקב אחר centroid התולעת זוהתה בהקלטות אינפרא-אדום בהיר או כהה-שדה אמור לאפשר לעיבוד צמתים מספקים לולאה סגורה ההתאמה של מיקום הבמה, אוטומטית תמונה נוספת מעקב (איור 3 ונתונים לא מוצג). רוב ההקלטות פלורסצנטיות שהושג עם שיטה זו היא האפל ונטול ביולוגית מעניין נתונים. טכניקות חיתוך רצפי תמונות לאובייקטים הרלוונטיים עיבוד תמונה שלאחר הרכישה על-חיישן או בזמן אמת לאפשר רזולוציה מרחבית מוגברת, לזרז את הצינור ניתוח נתונים, במיוחד אם Z-פרוסות נוספים נאספים עבור כל אחד timepoint להמחיש פעילות בתוך כל התאים מראש ולא postsynaptic במעגל.

מטרה מרכזית של מדעי המוח היא להבין איך נוירונים לתקשר מעגלים להתנהגות בעלי חיים נסיעה. המעגלים העצביים לשלב מגוון רמזים חושית מגוונת כדי לשנות פעילות מעגל, ובכך נהיגה שינויים התנהגותיים הכרחי עבור בעלי חיים להשיב את הסביבות שלהם. תולעים נימיות, C. elegans, יש מערכת עצבים פשוטה עם נוירונים 302 קשרים סינפטיים אשר היה ממופה לחלוטין1. בנוסף, גנים אשר קידוד חלבונים המעורבים עצבית גבוהה נשמרים בין C. elegans , יונקים2. למרות הפשטות האנטומי של מערכת העצבים שלו, הוא מציג רפרטואר מורכב מאופני שנשמרת מתן פלטפורמה פורה להבין איך נוירונים לווסת את ההתנהגות3.
C. elegans הוא נוטה היישום של מגוון רחב של גישות כמו מניפולציה גנטית, אבלציה לייזר תא, שיטות אלקטרופיזיולוגיות, וכן אין ויוו אופטי הדמיה4,5. מחקרים שנעשו לאחרונה יצרו מפות מפורטות של נוירוטרנסמיטר מרכזי איתות מערכות C. elegans כולל שימוש של רשתות עצביים GABAergic. מחקרים אלה, יחד עם לימודי מתמשך כדי למפות את הביטוי של כל עצביים G-חלבון בשילוב קולטנים למקם את מודל זה במיקום ייחודי כדי למנף את מבנה מאוד מפורט ומפות קישוריות עצביים תפקודית כדי להבין באופן מלא כיצד אלה אותות עצביים שונים דרך רצפטורים שונים, צירי זמן נסיעה בהיבטים שונים של התנהגות בעלי חיים.
ללימוד דפוסי הפעילות העצבית דינמי בכל מערכת, תנאי חיוני הוא לפתח מתודולוגיות חזקים כדי להקליט את פעילות נוירונים בודדים או מעגלים כולו במהלך התנהגויות. חשוב במיוחד amenability גישות כאלה אופטי להמחיש פעילות presynaptic שמניע שלפוחית סינפטית פיוז'ן. כתבים פלורסנט רגישה מאוד ומהירה של תאיים Ca2 +, יחד עם הזמינות הגוברת של רסיברים צילום רגיש, מהפכה את ההקלטה של התא, בפעילות הסינפטית בבעלי חיים ערה, חיה במהלך התנהגות. כי תוצאה העיקריים של הפעילות החשמלית סינפטית היא להסדיר Ca2 + ערוצים, שינויים ב- Ca תאיים2 + נחשבים בנאמנות השינויים הרלוונטיים בהתנהגותו ח בפעילות התא.
במחקר זה, אנו מציגים גישה לביצוע רציומטרי Ca2 + הדמיה בתכולה HSN מוטורי לגלוקוז לקדם התנהגות להטלת ביצים ב- C. elegans6,7. גישה זו מתבסס על הניסיונות להציג באופן חזותי Ca2 + פעילות C . elegans, המעגל להטלת ביצים במהלך התנהגות5,8,9,10,11 . השיטה מאפשרת לתאם בו זמנית את שינויי בפעילות התא/מעגל עם אירועים להטלת ביצים, וכן שינויים במצב גינקולוגיות בעלי חיים. למרות אנו משתמשים בגישה זו ללמוד פעילות תולעים בוגרות, עבודה שלא פורסמה מן המעבדה שלנו מציג שגישה זו ניתן להאריך לבעלי ילדותי הרביעית (L4) הזחל גם כן. סביר כי הפעילות של נוירונים אחרים- C. elegans לתפקד בתוך מעגלים נפרדים והתנהגויות צריך להיות נגיש באופן דומה עם טכניקה זו. השני פותח לאחרונה מהיר Ca2 + מחוונים עם שאינם חופפים ספקטרום הפליטה12,13,14,15,16, כלים optogenetic17 , ואת גנטית מקודד אופטי סממנים של מתח הממברנה18, אמור לאפשר לנו לבצע חקירות 'כל-אופטיים' חודר איך שינויים בפעילות מעגל עצבי נוהג הברית התנהגות ברורים.

<table><tbody><tr><td>C. elegans צמיחה, טיפוח והרכבה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli זן חיידקים, OP50</td><td>Caenorhabditis Genetic Center</td><td>OP50</td><td>מזון עבור C. elegans. אורסיל אוקסוטרוף. E. coli B. בטיחות ביולוגית רמה 1</td></tr><tr><td>HSN GCaMP5+mזן תולעת דובדבן</td><td>Caenorhabditis המרכז הגנטי</td><td>LX2004</td><td>טרנסגן משולב באמצעות מקדם nlp-3 להנעת ביטוי GCaMP5 ו-mCherry ב-HSN.&nbsp; גנוטיפ מלא:&nbsp; vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X</td></tr><tr><td>lite-1(ce314), lin-15(n765ts) זן מוטנטי להכנת טרנסגנים</td><td></td><td>LX1832</td><td>זן לשחזור טרנסגנים בעלי עותק גבוה לאחר מיקרו-הזרקה עם pL15EK lin-15(n765ts) פלסמיד הצלה. נושא גם את המוטציה המקושרת lite-1(ce314) המפחיתה את הרגישות לאור כחול. זמין מהמחבר על פי בקשה</td></tr><tr><td>pL15EK lin-15a/b מחבר פלסמיד הצלה גנומי</td><td></td><td>pL15EK</td><td>פלסמיד הצלה לשחזור של בעלי חיים טרנסגניים לאחר הזרקה לזן LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X. זמין מהמחבר על פי בקשה</td></tr><tr><td>pKMC299 מחבר פלסמיד</td><td></td><td>pKMC299</td><td>פלסמיד לביטוי mCherry ב-HSNs מהמקדם nlp-3. Has nlp-3 אזור לא מתורגם 3'</td></tr><tr><td>pKMC300 פלסמיד</td><td>מחבר</td><td>pKMC300</td><td>פלסמיד לביטוי של GCaMP5 ב-HSNs מהמקדם nlp-3. בעל nlp-3 אזור 3' לא מתורגם</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>P8281</td><td>להכנת לוחות NGM</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דיבסיסי</td><td>סיגמא</td><td>P5655</td><td>להכנת לוחות NGM</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי Heptahydrate</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td>להכנת לוחות NGM</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>אלפא Aesar</td><td>12312</td><td>להכנת פלטות NGM</td></tr><tr><td>פפטון</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>211820</td><td>להכנת פלטות NGM</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>אמרסקו</td><td>0241</td><td>להכנת פלטות NGM</td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>אלפא Aesar</td><td>A11470</td><td>להכנת פלטות NGM</td></tr><tr><td>אגר, בקטריולוגי סוג A,</td><td>Ultrapure Affymetrix</td><td>10906</td><td>להכנת פלטות NGM</td></tr><tr><td>צלחות פטרי 60 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25384-164&nbsp;</td><td>להכנת צלחות NGM</td></tr><tr><td>משקפי כיסוי מיקרו 24 x 60 מ"מ, #1.5</td><td>VWR</td><td>48393-251</td><td>זכוכית כיסוי שדרכה מצלמים תולעים</td></tr><tr><td>22 x 22 מ"מ משקפי כיסוי מיקרו, #1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>זכוכית כיסוי המכסה את החלק העליון של גוש האגר</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ עם בסיס אור מועבר</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>מיקרוסקופ ניתוח לתחזוקת מתח תולעת, בימוי והרכבה</td></tr><tr><td>של חוט אירידיום פלטינה, (80:20), 0.2 מ"מ</td><td>ALFA AESAR</td><td>AA39526-BW</td><td>להעברת תולעת</td></tr> <tr><td><חזק>מיקרוסקופ הדמיית סידן</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שולחן אוויר נגד רעידות</td><td>TMC</td><td>63-544</td><td>שולחן מעבדה מיקרו-גרם 30 אינץ' x 48 אינץ' שולחן נגד רעידות עם 4 אינץ' CleanTop M6 על 25 מ"מ</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ תרכובת הפוך</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Axio Observer.Z1 הפוך מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Sideport L80/R100 (3 מיקומים)</td> <td>Zeiss</td><td>425165-0000-000</td><td>כדי להסיט 20% מהפלט למצלמת שדה בהיר (CMOS), 80% למצלמת פלואורסצנטיות (sCMOS)</td></tr><tr><td>הטיה לאחור מנשא תאורה</td><td>Zeiss</td><td>423920-0000-000</td><td>להדמיית אינפרא אדום/התנהגות</td></tr><tr><td>מנורת 12V/100W עם אספן</td><td>Zeiss</td><td>423000-9901-000</td><td>להדמיית אינפרא אדום/התנהגות</td></tr><tr><td>מנורת הלוגן 12V/ 100W</td><td>Zeiss</td><td>380059-1660-000</td><td>להדמיית אינפרא אדום/התנהגות. נוריות אור לבן אינן פולטות אור אינפרא אדום משמעותי, ולכן הן לא יאפשרו הדמיית שדה בהיר לאחר מסנן פס הפס האינפרא אדום</td></tr><tr><td>32 מ"מ מסנן פס פס אינפרא אדום (750-790 ננומטר) למנורת הלוגן</td><td>Zeiss</td><td>447958-9000-000</td><td>BP 750-790; DMR 32 מ"מ, לתאורת אינפרא אדום לשדה בהיר והתנהגות</td></tr><tr><td>צריח מעבה 6 מסננים (LD 0.55 H/DIC/Ph),</td><td>Zeiss</td> ממונע <td>424244-0000-000</td><td>להדמיית אינפרא אדום/התנהגות</td></tr><tr><td>מעבה & תריס</td><td>Zeiss</td><td>423921-0000-000</td><td>להדמיית אינפרא אדום/התנהגות</td></tr><tr><td>עינית משקפת עם צינור פוטו למצלמת CMOS אינפרא אדום</td><td>Zeiss</td><td>425536-0000-000</td><td>להדמיית אינפרא אדום/התנהגות</td></tr><tr><td>עינית 10x, 23 מ"מ</td><td>Zeiss</td><td>444036-9000-000</td><td>ללוקליזציה של תולעת על נתח האגר</td></tr><tr><td>C-Mount מתאם 2/3 אינץ' 0.63x מסיר מגדלת</td><td>Zeiss</td><td>426113-0000-000</td><td>הר עבור מצלמת CMOS אינפרא אדום</td></tr><tr><td>מצלמת CMOS לשדה בהירות והתנהגות אינפרא אדום (חיישן 1 אינץ')</td> <td>FLIR (לשעבר Point Grey Research)</td> מצלמת <td>GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>להדמיית שדה בהיר</td></tr><tr><td>כרטיס בקר מארח USB 3.0</td><td>FLIR (לשעבר Point Grey Research)</td> <td>ACC-01-1202</td><td>Fresco FL1100, 4 יציאות</td></tr><tr><td>8 פינים, כבל GPIO 1 מטר, מחבר עגול Hirose HR25&nbsp;</td><td>FLIR (לשעבר Point Grey Research)</td> כבל <td>ACC-01-3000</td><td>להפעלת TTL. החוט הירוק מתחבר ל-GPIO3 / פין 4 והחוט החום מתחבר לקרקע / פין 5</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901-000</td><td>השילוב הטוב ביותר של הגדלה, צמצם מספרי ומרחק עבודה</td></tr><tr><td>צריח רפלקטור 6 קוביות,</td><td>צייס</td> ממונע <td>424947-0000-000</td><td>להדמיית פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>רכבת אור פלואורסצנטית,</td><td>צייס</td> ממונע <td>423607-0000-000</td><td>להדמיית פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>תריס פלואורסצנטי</td><td>Zeiss</td><td>423625-0000-000</td><td>להדמיית פלואורסצנציה</td></tr><tr><td>GFP ו-mCherry קוביית מסנן עירור ופליטה כפולה (למיקרוסקופ)</td> <td>Zeiss</td><td>489062-9901-000</td><td>סט מסנני FL 62 HE BFP+GFP+HcRed להדמיית פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>מערכת תאורת LED</td><td>Zeiss</td><td>423052-9501-000</td><td>Triggerable Colibri.2 מערכת LED לתאורת פלורסנט</td></tr><tr><td>מודול LED GFP (470 ננומטר)</td><td>Zeiss</td><td>423052-9052-000</td><td>Colibri.2 LED לעירור פלואורסצנטי GFP</td></tr><tr><td>mמודול LED דובדבן (590 ננומטר)</td><td>Zeiss</td><td>423052-9082-000</td><td>Colibri.2 LED לעירור פלואורסצנטי mCherry</td></tr><tr><td>מחוון עצירת איריס לציוד אור מקרי</td><td>Zeiss</td><td>000000-1062-360</td><td>קשתית צמצם שדה להגבלת תאורת LED לשדה הראייה</td></tr> <tr><td>של המצלמהמתאם C-Mount 1 אינץ' 1.0x</td><td>Zeiss</td><td>426114-0000-000</td><td>מתאם למפצל תמונה ומצלמת פלואורסצנטי sCMOS</td></tr><tr><td>מפצל תמונות</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>Gemini W-View, ניתן להשתמש במפצלי תמונה אחרים, אך ייתכן שהם לא יהיו מותאמים לגודל החיישן הגדול של מצלמות sCMOS</td></tr><tr><td>מראה דיכרואית GFP / mCherry (מפצל תמונה)</td><td>Semrock</td><td>Di02-R594-25x36</td><td>פיצול GCaMP5 מ-mCherry ואינפרא אדום מסנן</td></tr><tr><td>פליטת GFP אותות (מפצל תמונה)</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30-25</td><td>לכידת GCaMP5 פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>mדובדבן/מסנן פליטה (מפצל תמונה)</td><td>Semrock</td><td>FF01-647/57-25</td><td>מסנן זה נחוץ כדי לא לכלול את אור האינפרא אדום המשמש להדמיית שדה בהיר</td></tr><tr><td>מצלמת sCMOS לפלואורסצנטיות (חיישן 1 אינץ')</td><td>Hamamatsu</td><td>A12802-01 / C11440-22CU</td><td>אורקה פלאש 4.0 V2. דגמים חדשים יותר מאפשרים הגדרות רכישת תמונה נפרדות בחצאים נפרדים של החיישן, מה שמאפשר רכישת תמונות דו-ערוציות בשילוב עם מפצל תמונה</td></tr><tr><td>ממונע XY Stage</td><td>M&auml; rzh&auml; סריקת משתמש</td><td>IM 130 x 100</td><td>Stage תנועה; רזולוציית XY של שלב זה היא 0.2 ומיקרו; M לכל שלב&nbsp;</td></tr><tr><td>בקר XY Stage עם ג'ויסטיק</td><td>LUDL</td><td>MAC6000, ג'ויסטיק XY</td><td>מעקב ידני אחר תולעים. יש לחבר MAC6000 הבקר למחשב דרך היציאה הטורית (RS-232) המוגדרת ל-115200 באוד</td></tr><tr><td>לוח רכישה דיגיטלי (DAQ)</td><td>Arduino</td><td>Uno</td><td>קבלת טריגרים TTL ממצלמת sCMOS. יש לטעון את ה-Uno בחבילת Firmata הסטנדרטית, ויציאת ה-USB של המחשב מוגדרת ל-57600 באוד</td></tr><tr><td>BNC זכר לכבל BNC זכר - 6 רגל</td><td>Hosa Technology</td><td>מחברי HOBB6</td><td>BNC עבור TTL המפעילים</td></tr><tr><td>כבל קואקסיאלי BNC זכר מצופה זהב ל-SMA זכר (8.8 אינץ')</td> <td>uxcell</td><td>608641773651</td><td>לחיבור יציאות ההדק של מצלמת הקרינה</td></tr><tr><td>BNC מתאם ראש סיבוב</td><td>Hantek</td><td>RRBNCTH21</td><td>מתאם תקע BNC לבננה (4 מ"מ)</td></tr><tr><td>מחבר BNC נקבה לנקבה</td><td>Diageng</td><td>20130530009</td><td>מתאם BNC נקבה לנקבה לחיבור פלט BNC מהמצלמה לתקע בננה</td></tr><tr><td>חוטי מגשר לוח לחם גמישים ללא הלחמה</td><td>Z& T</td><td>GK1212827</td><td>כדי לחבר את יציאות ההדק של BNC ל-Arduiono DAQ.&nbsp; זכר לזכר.</td></tr><tr><td>תחנת עבודה בעלת ביצועים גבוהים</td><td>HP</td><td>Z820</td><td>Windows 7, 64GB RAM, מעבד Dual Xeon, כונן Solid State C: יציאה טורית (RS-232), חריצי PCIe3 מרובים לקישוריות Ethernet, כרטיסי USB 3.0 וכונני Solid State נוספים</td></tr><tr><td>כונן SSD M.2 Samsung</td><td></td><td>MZ-V5P512BW</td><td>הזרמה וניתוח מהירים של נתוני תמונה</td></tr><tr><td>M.2 מתאם כונן SSD M.2; עבור תחנות עבודה</td><td>Lycom</td><td>DT-120</td><td>M.2 ל-PCIe 3.0 מתאם 4 נתיבים</td></tr><tr><td>אחסון מצורף לרשת</td><td>Synology</td><td>DS-2415 +</td> <td>אחסון וניתוח נתוני הדמיה</td></tr><tr><td>כונני דיסק קשיח</td><td>Western Digital</td><td>WD80EFZX</td><td>RED 8 TB, 5400 סל"ד Class SATA 6 Gb/s 128MB מטמון 3.5 אינץ'. אחסון נתוני הדמיה (10 כוננים + יתירות 2 כוננים)</td></tr><tr><td><חזק>תוכנה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>רכישת פלואורסצנטיות</td><td>Hamamatsu</td><td>HCImage DIA</td><td>הקלטה של רצפי תמונות פלואורסצנטיים דו-ערוציים (GCaMP5 ו-mCherry) ב-20 פריימים לשנייה</td></tr><tr><td>רכישת</td><td>Brightfield FLIR (לשעבר Point Grey Research)</td>הקלטת <td>Flycapture</td><td>של רצפי</td></tr> <tr><td>תמונות JPEG בשדה בהירקורא יציאות טורי שלב</td><td>בונסאי</td><td>https://bitbucket.org/horizongir/bonsai</td><td>מקל על מעקב אחר תולעים במהלך התנהגות</td></tr><tr><td>תוכנת בקר LED</td><td>Zeiss</td><td>Micro Toolbox Test 2011</td><td>כדי להגדיר את העוצמה וכניסות ההדק עבור נוריות ה-LED השונות ביחידת Colibri.2</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td><td>סקירה פשוטה של רצפי תמונות ושינויי עיצוב לייבוא לתוכנת Ratiometric Quantitation</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>&nbsp; 2002984-001-000001</td><td>ליצירת תת-קבוצות של נתוני ערכים מופרדים בפסיקים מ-Volocity לניתוח MATLAB</td></tr><tr><td>מציאת שיא</td><td>סקריפט MATLAB</td><td>R2017a</td><td>המשמש לחישובי תכונת שיא יחס</td></tr><tr><td>כימות רציומטרי</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>מקל על חישוב ערוצי תמונה רציומטריים, פילוח תמונה למציאת אובייקטים ומדידת יחס של אובייקטים</td></tr> <tr><td>שנמצאוScripts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY-stage-final.bonsai</td><td>Bonsai</td><td>TTL מופעל על ידי DAQ ומיקום שלב קורא יציאות טוריות</td><td>מתעד את מיקום השלב X ו-Y (במיקרונים) כאשר ה-Arduino המצורף מקבל אות TTL חיובי ממצלמת sCMOS במהלך חשיפת המסגרת. קובץ Script כותב קובץ .csv עם ארבע עמודות: מספר מסגרת, מיקום X (מיקרון), מיקום Y (מיקרון) והזמן שחלף בין פריימים (בדרך כלל ~50 msec בעת הקלטה במהירות של 20 fps).&nbsp; מיקום שלב X ו-Y מהפלט הזה (עמודות 2 ו-3, בהתאמה) מתווספים למיקומים המרכזיים X ו-Y מסקריפט AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB (עמודות 4 ו-5, בהתאמה), כדי לתת את מיקום ה-X וה-Y הסופי של האובייקט הפלואורסצנטי להקלטה.</td></tr></tbody></table>

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג caenorhabditis elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

זה הפך ליותר ויותר ברורה כי פעילות מעגל עצבי בחיות מתנהגות שונה באופן מהותי מן לראות בבעלי חיים מרדימים או קיבוע. כתבים פלורסנט רגישה מאוד, מקודדים גנטית של Ca2 + מהפכה את ההקלטה של התא, בפעילות הסינפטית שימוש בגישות אופטי לא פולשנית בבעלי חיים להתנהג. בשילוב עם גנטי, טכניקות optogenetic, את המנגנונים המולקולריים זה לווסת את פעילות התא ואת מעגל במהלך הברית ניתן לזהות התנהגות שונה.
כאן נתאר שיטות רציומטרי Ca2 + הדמיה של נוירונים יחיד ב להתנהג בחופשיות Caenorhabditis elegans תולעים. נדגים שיטה הרכבה פשוטה בעדינות שכבות-על תולעים גוברת על אגר רגיל של מדיה צמיחה תולעים נימיות (NGM) לחסום עם coverslip זכוכית, יאפשר לבעלי אפשרות להקליט ברזולוציה גבוהה במהלך תנועה בלתי מוגבלת והתנהגות. בטכניקה זו, אנו משתמשים רגיש Ca2 + לכתב GCaMP5 להקליט את שינויים תאיים Ca2 + בנוירונים תכולה דו-מיניים ספציפיים (HSNs) בה הם נוהגים ההתנהגות להטלת ביצים. בהבעת שיתוף mCherry, Ca2 +-חלבון פלואורסצנטי חסר רגישות, נוכל לאתר את המיקום של HSN בתוך ~ 1 מיקרומטר ונכונה עבור תנודות פלורסצנטיות נגרם על ידי שינויים במוקד או תנועה. הדמיה brightfield בו זמנית, אינפרא אדום מאפשר התנהגות הקלטה ומעקב בבעלי חיים באמצעות שלב ממונע. על ידי שילוב של זרמי נתונים וטכניקות מיקרוסקופית אלו, אפשר להקליט Ca2 + פעילות במעגל להטלת ביצים C. elegans תוך כדי התקדמות בין מצבי התנהגות לא פעיל ופעיל מעל עשרות דקות.

הטכניקה פשוטה הרכבה המתוארים כאן (איור 1) גורם שינויים מינימאליים לסביבה תרבות של L4 ו למבוגרים C. elegans תוך מתן אפשרות ברזולוציה גבוהה הקלטה מתנהג חיות דרך coverslip זכוכית (איור 4). סינכרון של מקורות אור LED, בקרי הבמה חשיפות המצלמה מאפשר עבור רכישת נתונים של מספר זרמים-מסגרות לשנייה 20 עד כדי 1 ח' ביניים ההגדלה (20 x) עם מטרות מפתח נומרי גבוהה (0.7-0.8) מספק טוב רזולוציה מרחבית של האזור סינפטית המעגל ההתנהגות להטלת ביצים, אפילו עם 4 x 4 פיקסל binning (מיקרומטר 1.25 לפיקסל). רכישת סימולטני של אותות זריחה GCaMP5 ו- mCherry (איור 4A, B) משמש להפקת ערוץ יחס על ידי פיקסל פיקסל שמפצה על שינויים בבעלי חיים תנועה ונוחות (איור 4D). התחנה הסופית presynaptic של HSN הוא כל כך גדולים כמו גופים תאים עצביים רבים C. elegans, ושינויים HSN Ca presynaptic2 + ניתן בבירור לאבחן. FOV גדול של המצלמה brightfield אינפרא-אדום מאפשר את התולעת לבצע אחריהם מעקב באופן ידני במהלך ההקלטה (איור 4E). עבור כל בעל חיים, שינויים ב- Ca תאיים2 + ישויך עם התנהגויות ניכר הדמיה brightfield כולל שחרור הביצית ושינויים גפיים (איור 4E).
כימות של HSN Ca2 + ומהירות מאשר כי תולעים שינוי ומכניקה שלהם במעבר להתנהגות להטלת ביצים... ישנם הבדלים משמעותיים במהירות תולעת לפני, במהלך, ואחרי המצב הפעיל להטלת ביצים (איור 5א). זה לא נגרם עקב רעש הגלום ההדמיה או מערכת המעקב. התקרבות לתוך האירוע להטלת ביצים, נתבונן חזק בשינוי GCaMP5 קרינה פלואורסצנטית (ΔF/F) לפני האירוע להטלת ביצים, בעוד mCherry הוא יחסית ללא שינוי (איור 5B). שינויים נמדד ביחס GCaMP5:mCherry (ΔR/R) מראים בבירור של HSN Ca2 + ארעי ~ 4 s לפני שחרור הביצית (איור 5B). חופפת התכווצות שרירים vulval, מאט נקי תולעת ומכניקה של מתרחשת כי מסתיים עם ביצה לשחרר. תוצאות קודמות הראו כי שימוש VC הנוירונים מנוע, אשר הם innervated על ידי HSNs, להראות פעילות שיא במהלך התכווצות שרירים חזקים vulval ובמהלך ביצה שחרור 8,10,27. אנחנו גם הראו כי optogenetic ההפעלה של הנוירונים VC כוננים של האטה מיידית של גפיים, רומז כי הנוירונים VC עשוי להיות מופעל על ידי התכווצות שרירים vulval, ובכך מאט גפיים עד קבלת משוב של שחרור הביצית27 .
ההדמיה, תיאר מערכת המעקב מאפשר הדמיה של הארגון המרחבי של ההתנהגות להטלת ביצים (איור 5C). כאמור מוצג, תולעים הזן ריצות מתמשכת של גפיים קדימה רק לפני למצב פעיל32. תולעים מבלים את רוב זמנם שיחור מזון על חיידקים במרכז גוש אגר. לפני הכניסה למצב פעיל, תולעים להרחיק המזון, אשר חופפת המראה של HSN Ca נדירים2 + תופעות מעבר. פעילות HSN המעברים ואז ירי פרץ, עם מספר צפופים HSN Ca2 + תופעות מעבר זה לקיים אירועים להטלת ביצים לתוך. התולעים אז לעיתים קרובות תסתובב לחדש ומכניקה קדימה, מטילים את ביציהם על הדרך חזרה לכיוון נקודת ההתחלה שלהם ליד החיידק OP50. אנחנו יכולים להניח כי שינויים O מקומית2 ו/או ריכוז CO2 עשויה להיות השפעה על איפה התולעים להחליט להטיל ביצים33,34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig1.jpg"> איור 1. C. elegans הרכבה טכניקת דימות ברזולוציה של מעגל פעילות והתנהגות בעלי להטלת ביצים. העליון, ההר האחרון מן הצד. התחתון, ההר הסופי כפי שהוצג דרך קרקעית coverslip גדול. חיצים מציינים OP50 חיידקי מזון, בתולעים המוטנטיות וביצים, דחוקה בין גוש אגר NGM את coverslip גדול 24 מ"מ x 60 מ"מ. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig2.jpg"> איור 2 . Widefield רציומטרי Ca2 + הדמיה והתנהגות הקלטה במיקרוסקופ epifluorescence הפוך. (א) תולעת עמדה והתנהגות לכידת brightfield ויה 20 x (0.8 NA) מטרת התוכנית-עדשה אפוכרומטית באמצעות אור אינפרא-אדום (750-790 ננומטר) (חצים סגולים) הנפלטים מנורת הלוגן דרך גוש NGM. ג'ויסטיק והבמה ממונע בקר משמש כדי לשמור על התולעת בתוך שדה הראייה במהלך ההקלטה. מיקום הבמה (Δx, Δy) נשלחת למחשב על-ידי היציאה הטורית. חלבונים GCaMP5 ו- mCherry לידי ביטוי התולעת מתרגשים באמצעות 470 nm (חיצים כחולים) ו 590 nm (חיצים צהובים) דיודות פולטות אור (LED). הנפלטים GCaMP5 (ירוק חצים) mCherry (חיצים כתומים) זריחה יחד עם אור אינפרא-אדום עובר דרך מראה ודיקרואיק זוהר הלהקה רב (ראה טבלה של חומרים). קרן-הפיצול 80/20 שולח 20% של האור דרך demagnifer 0.63 x עבור לכידה על מצלמת CMOS אינפרא אדום רגיש (חץ סגול). ה-80% הנותרים של האור נשלחת דרך היציאה-הצד של המיקרוסקופ מפצל תמונה שמפריד את GCaMP5, mCherry זריחה על נפרדות חצאים של מצלמת sCMOS בעת הסרת אור אינפרא-אדום brightfield. הנתונים של שתי המצלמות מועברים למחשב באמצעות כבלים, USB3. היציאות ההדק מן המצלמה sCMOS קרינה פלואורסצנטית (כחול) משמשים לשליחת + 5V TTL מפעיל מערכת תאורה LED, המצלמה CMOS אינפרא-אדום brightfield של המכשיר רכישה דיגיטלית (DAQ). טריגר (B) 3 פלט TTL אותות שזיהה את DAQ-pin דיגיטלי #8 ושלח למחשב באמצעות חיבור USB. אלה כניסות דיגיטליות לעורר ' איפה XY' הפקודה טורי של קובץ script תוכנה הבונסאי (XY-שלב-גמר) אשר קורא X ו- Y שלב מיקום עבור כל תמונה זריחה/אינפרא-אדום GCaMP5/mCherry בשבי. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig3.jpg"> איור 3 : פריסה של התסריט תקשורת טורית-שלב בונסאי XY-שלב-גמר- העליון צומת DigitalInput (ורוד) קורא מפעילים TTL מגיע לתוך ה-pin #8 של DAQ. עבור כל חיובי TTL מתח (ירוק), DAQ גורם חותמת זמן (כחול) וכותב מחרוזת 'איפה XY?' (ורוד) הבקר השלב דרך היציאה הטורית (אפור). הצומת SerialStringRead (ורוד) קורא ש-x ו- Y לתאם התגובה של הבקר הבמה. מחרוזת זו הוא מומר מיקרון ואז הפרדתו X ו- Y שלב קואורדינטות. לבסוף נחלים ארבע אלה משולבים באמצעות הצומת zip (כחול), קובץ column.csv 4 כתוב: ספירת מסגרת TTL האותות המתקבלים (צומת טווח, ורוד) את הקואורדינטות X ו- Y, את המרווח בין timepoints עוקבות (בדרך כלל ~ 50 מילישניות כאשר הקלטה ב 20 הרץ). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig4.jpg"> איור 4 : Micrographs הנציגה של HSN פלורסצנטיות, brightfield כל חיה במהלך ההתנהגות להטלת ביצים. (A–D) הדמיה רציומטרי בו זמנית של זריחה GCaMP5 ו- mCherry, HSNs רק לפני שחרור הביצית. טרמיני presynaptic HSN מסומנים עם ראשי חץ. קרינה פלואורסצנטית מיזוג של GCaMP5 ו- mCherry (ג). (ד) GCaMP5:mCherry מאופנן בעוצמה יחס; יחס גבוה (אדום) ציון גבוה תאיים Ca2 + התחנה הסופית presynaptic. (E) Brightfield תמונה של התולעת כולו רק אחרי הביצים שכבתי. ראשי חץ מציינים את החצאים anterior ואת אחורי של הפות שממנו הביצים מוטלות. סולם בר לכל התמונות הוא 50 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56911/56911fig5.jpg"> איור 5 : הקלטה של מהירות2 + וגפיים HSN Ca במהלך ההתנהגות להטלת ביצים. רשמים (A) מהשינויים יחס GCaMP5:mCherry בתגובה תאיים Ca2 + תופעות מעבר (ΔR/R; אדום) יחד עם מהירות תולעת מיידי (מיקרומטר/s; כחול). אירועי כנס מסומנים באמצעות ראשי חץ. (B) עקבות של קרינה פלואורסצנטית HSN GCaMP5 (green; ΔF/F), זריחה mCherry (אדום; ΔF/F), יחס זריחה GCaMP5:mCherry (שחור; ΔR/R) ותולעת מהירות (כחול) סביב ברגע של שחרור הביצית. (ג) הארגון המרחבי של כנס והתנהגויות ומכניקה במהלך ההקלטה כל 10 דקות. המסלול תולעת הושג מן המידע הבמה XY אשר נוספה למיקום centroid HSN המתקבל ההקלטה זריחה mCherry. העיתוי של HSN שנחשולי (עיגולים אדומים), אירועים להטלת ביצים (חץ שחור), ולא את ההתחלה והסוף של ההקלטה (יהלומים ירוק וכחול) מסומנים. סולם בר הוא 1 מ מ. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56911/56911fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הדמיית סידן רציומטרית של ההשפעות של נוירון ספציפי להרמפרודיטה, או פעילות HSN, על התנהגות Caenorhabditis elegans. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח ההתנהגותיים לגבי האופן שבו פעילות מעגלים עצביים מייצרת שינויים בהתנהגות בעלי חיים כאשר בעלי חיים מתחלפים בין מצבי התנהגות. טכניקה זו מאפשרת לרשום שינויים בפעילות הסידן התוך-תאית עם יחס אות לרעש גבוה, תוך מעקב אחר התנהגות ותנועה של בעלי חיים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי פעילות עצבית ב-C.elegans, ניתן ליישם אותה גם על מערכות מודל שקופות אחרות כולל זחלי דרוזופילה ודגי זברה. ידגימו איתי את ההליך, תלמידי Collin's Labs: ריצ'רד קופקוק, פראוואט דאקל וליילה נסאר. כדי להרכיב את בעלי החיים, יש למרוח תחילה מזון חיידקי OP50 מצלחת אגר מדיום גידול נמטודה זרוע לתחתית קוטף תולעת פלטינה והשתמש בפיק כדי להעביר כ-20 L מאוחר ארבע L-X 2, 000 לבעלי חיים המבטאים את מדווח הסידן הרגיש GCaMP5 ו-mCherry ב-HSN ממקדם NL שלוש P על צלחת מדיום גידול נמטודות זרע.אשר את נוכחות הפות המתפתחת תחת מיקרוסקופ סטריאו כנקודה כהה ברורה המוקפת בסהר לבן ודגר על התולעים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 24-40 שעות. בתום הדגירה, יש למרוח OP50 על קטיף חדש ולהעביר שלוש תולעים לצלחת בינונית לגידול נמטודות לא זרועות ולהשאיר חלק קטן של מזון על הצלחת החדשה לתולעים להאכיל במהלך ההדמיה. לאחר מכן, השתמש במרית מעוגלת שטוחה כדי לחתוך נתח בגודל 20 על 20 מילימטר מהצלחת הלא זרועה ולהניח את הנתח, צד התולעת כלפי מטה, על קצה אחד של כיסוי נקי בגודל 24 על 60 מילימטר מספר 1.5.לאחר מכן, החלק בזהירות את נתח האגר למרכז החלקת הכיסוי והנח החלקת כיסוי מספר אחת בגודל 22 על 22 מילימטר על גבי חתיכת האגר כדי להפחית את ההדבקה והאידוי. כדי להגדיר את ההדמיה, הנח את התולעים על הבמה של מיקרוסקופ הפוך ובחר את הסובייקטיבי פי 20. השתמש בחלקי העיניים המשקפת כדי לבחור תולעת להדמיה והחלק את מסנן האינפרא אדום והנח מעל הקבל.פתח תוכנית ניתוח וידאו מתאימה והפעל את סקריפט התקשורת הסופי של שלב XY הסדרתי. לחץ על CsvWriter ובחר תיקיה לשמירת המידע המוקלט על שלב X ו-Y. לאחר מכן, לחץ על ראש החץ הירוק כדי לאתחל את תוכנית הרכישה הדיגיטלית.בתוכנת הקלטת מצלמת האינפרא-אדום תחת הגדרות, בחר Toggle Camera Control Dialog. לאחר מכן בחר בתפריט מצבי וידאו מותאמים אישית ובחר מצב 1 ופורמט פיקסל גולמי שמונה. תחת מהלך טריגר, הגדר את קו הקלט של ההדק לשלוש, את הקוטביות לגבוהה ואת המצב ל-14.Toggle Enable כדי לעצור את רכישת המסגרת עד לקבלת אות ההדק של המתח ממצלמת הפלואורסצות. כשחלון הצגת התמונות פתוח, לחץ על הקלט ובחר את התיקייה לשמירת רצפי התמונות. בחר Buffered Recording Mode ושמור את התמונות בתבנית JPEG.לאחר מכן, לחץ על התחל הקלטה כדי לאתחל את הרכישה. לאחר מכן, פתח את הכרטיסייה לכידה בתוכנת רכישת פלורסנט והגדר את זמן החשיפה ל-10 אלפיות השנייה, את ה-Binning ל-4 X ואת עומק התמונה ל-16 סיביות. בחר תת-מערך מצלמה ממורכז של 512 פיקסלים רוחב על 256 פיקסלים גובה.התוכנית תחלק אוטומטית את התמונה הרחבה לשניים כדי ליצור את ערוצי הפריחה הנפרדים. לחץ על Show Output Trigger Options והגדר את כל הגורמים המפעילים לחיוביים. ודא שהטריגר הראשון והטריגר שניים מוגדרים לחשיפה וטריגר שלוש מוגדר לניתן לתכנות עם פרק זמן של 25 אלפיות השנייה.לאחר מכן, תחת הכרטיסייה רצף, בחר Time Lapse תחת הגדרות סריקה, הגדר את עיכוב השדה בין 1 ל-50 אלפיות השנייה כדי לאסוף תמונות ב-20 הרץ. בחר שמור במאגר זמני. עבור הדמיית סידן רציומטרית, תחת הכרטיסייה רצף, לחץ על התחל כדי להתחיל להקליט ולעקוב אחר התולעת עם הג'ויסטיק תוך שמירה על התאים והסינפסות של העניין במוקד במרכז שדה הראייה.ברגע תחילת הקלטת התפריחה, נשלחים טריגרים למצלמת השדה הבהיר הממתינה ולבקר הבמה שמתחילים לאסוף תמונות מסונכרנות ומיקום במה. לחצו על הלחצן 'סטטיסטיקה' בחלון 'היסטוגרמה' להצגת סטטיסטיקת פיקסלים לכל ערוץ. כוונן את עוצמת ה-LED כדי להבטיח פיקסל בודד מקסימלי של תפרחת mCherry בקצה הפרה-סינפטי של גדול או שווה ל-8,000 ספירות בערוץ האדום, מה שנותן טווח דינמי של כ-12 סיביות מעל הרקע.אותות מדווח הסידן בקצה הפרה-סינפטי במהלך מנוחה או סידן נמוך צריכים להיות בסביבות 2,500 ספירות בערוץ הירוק. רשום את ההתנהגות עד להגעה למצב פעיל של הטלת ביצה אחת. לאחר מכן, שמור תת-קבוצה של 10 דקות המכילה 6,000 פריימים לפני ו-6,001 פריימים אחרי אירוע הטלת הביצים הראשון.הקפד לשמור על אותה תת-קבוצה של תמונות שדה בהיר של התנהגות תולעת ונקודות זמן של מיקום שלב XY אחרת הסנכרון המדויק של זרמי הנתונים יאבד. עבור פילוח תמונה, ייבא את רצפי התמונות לתוכנית תוכנת קוונטיזציה רציומטרית מתאימה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על סדרת הזמן בכרטיסיית הרצף כדי להגדיר את סדרת הזמן ל-20 פריימים לשנייה ו-1.25 מיקרומטר לפיקסל. תחת תפריט כלים, בחר יחס ולאחר מכן בחר mCherry עבור ערוץ A ו- GCaMP5 עבור ערוץ B ולחץ על חשב כדי להחסיר את הרקע מכל רצף תמונות.בחר החל טבלת חיפוש קשת בערוץ היחס והשתמש בערוץ mCherry כדי ליצור ערוץ יחס מאופנן עוצמה כדי למפות את צבע היחס על הבהירות של ערוץ mCherry . לחץ על יחס כדי ליצור את שני הערוצים. כדי ליצור בפרוטוקול איתור אובייקטים, גרור את הכלי Find Objects using intensity תחת לשונית המדידות לחלונית הפרוטוקול ולחץ על גלגל השיניים כדי להגדיר את החלון של ערכי עוצמת mCherry ולחפש אובייקטים.בחר ערכי עוצמה גדולים או שווים לשתי סטיות תקן מעל הרקע תוך הקפדה על זיהוי גוף התא והקצה הפרה-סינפטי. הוסף מסננים נוספים המכוונים לערוץ mCherry רק לפי הצורך כדי לא לכלול אובייקטים לא רצויים, כגון: ראש, זנב או תפרחת מעיים. לאחר מכן, פתח את תפריט מדידות ובחר הפוך פריט מדידה ובחר את כל נקודות הזמן כדי לבצע פרוטוקול ניתוח קוונטיזציה של תמונה.רכישה בו-זמנית של אותות תפרחת GCaMP5 ו-mCherry משמשת ליצירת ערוץ יחס פיקסל אחר פיקסל המפצה על שינויים בתנועה ובמיקוד של בעלי חיים. עבור כל בעל חיים, שינויים בסידן HSN תוך-תאי פרה-סינפטי יכולים להיות בקורלציה עם התנהגויות הניכרות בהדמיית שדה בהיר כולל שחרור ביציות ושינויים בתנועה. ואכן, ניתן להבחין בהבדלים משמעותיים במהירות התולעת לפני, במהלך ואחרי המצב הפעיל של הטלת הביצים.התקרבות לאירוע הטלת ביצים אחד, מגלה שינוי משמעותי בפריחה של GCaMP5 לפני אירוע הטלת הביצים. בעוד שהפריחה של mCherry נשארת יחסית ללא שינוי. בנוסף, שינויים שנמדדו ביחס GCaMP5:mCherry מראים בבירור חולף סידן HSN כ-4 שניות לפני שחרור הביצית.המשך התכווצות שרירי הפות ניכרת בהאטה ברורה של תנועת התולעים שמסתיימת בשחרור ביציות. יתר על כן, הדמיה ומעקב אחר התולעים כפי שהודגם זה עתה, מאפשרים הדמיה של הארגון המרחבי של התנהגות הטלת הביצים מחיפוש מזון, שינויים חולפים בסידן HSM ופעילות HSN שעוברת לירי פרץ לפני תנועה למקום הטלת הביצים. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעה או שעתיים, אם היא מבוצעת כראוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על מיקוד בתאים המעניינים ובמסופים הפרה-סינפטיים שלהם במהלך שלבי ההדמיה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון הפעלה אופטוגנטית, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו HSN מגיב לגירוי פרה-סינפטי. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את תפקוד מעגל הטלת הביצים ב-C.elegans.לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הדמיית סידן רציומטרית של HSN ב- Caenorhabditis elegans פעיל.

ratiometric-calcium-imaging-individual-neurons-behaving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מציג את המושגים מאחורי דימות סידן וכולל פרוטוקול לדוגמה להדמיית הילוך מהיר של תולעים הכלולות בבארות אגרוז יצוקות.

הדמיית סידן: שיטה להמחשת פעילות עצבית ב- C. elegans חי

סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית סידן בתאי עצב בודדים של Caenorhabditis elegans המתנהגים באמצעות חלבוני כתב פלואורסצנטיים מקודדים גנטית. הוא מתאר את השלבים המעורבים בהדמיית תנועת תולעים ומדידת יחסי פלואורסצנטיות של כתב מתאי עצב כדי לקשר בין רמות הסידן התוך-תאיות לפעילות עצבית ושינויים התנהגותיים במהלך הטלת ביצים.

הדמיית סידן בתאי עצב בודדים המווסתת את התנהגות הטלת הביצים ב- Caenorhabditis elegans

מקור: Doser, R., et al. הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי in vivo. J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים הדמיה in vivo של שטף סידן תת-תאי בנוירונים של חוט העצב הגחוני של זני Caenorhabditis elegans טרנסגניים. נעשה שימוש בשני מדדי סידן נפרדים: אינדיקטור ציטופלזמי בזן אחד ואינדיקטור מיטוכונדריאלי באחר. נוירונים נצפים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לנטר שינויים בזמן אמת בעוצמת הקרינה בתוך הציטופלזמה העצבית והמיטוכונדריה, המשקפים שטף סידן במהלך פעילות עצבית ספונטנית.

הדמיית דינמיקת סידן תת-תאית בתאי עצב של Caenorhabditis elegans

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים...

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

הדמיית התנהגות ופעילות עצבית לאורך זמן ארוך ללא קיבוע של החיה היא תנאי מוקדם להבנת התנהגות. ניתן להשתמש בהדמיית תאים מיקרופלואידיים של אגרוז (AMI) כדי לדמות פעילות עצבית והתנהגות עבור כל שלבי החיים של Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

דווח כאן על מערכת להדמיית סידן בדלקת אלגנס המתנהגת באופן חופשי עם רטט מבוקר היטב, שאינו לוקלי. מערכת זו מאפשרת לחוקרים לעורר תנודות לא-לוקליות בעלות תכונות מבוקרות היטב בתזוזה בקנה מידה ננומטרי ולכמת זרמי סידן במהלך תגובות של C. elegans לתנודות.

הדמיית סידן באלגנים של Caenorhabditis המתנהגים בחופשיות עם רטט מבוקר היטב, שאינו מלוטש

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

אנו מתארים שיטות הקלטה בקנה מידה גדול של יחידות בודדות מרובות פוטנציאל בתחום המקומית מתנהג מכרסמים עם בדיקות סיליקון. כונן ייצור, מצורף בדיקה לכונן ואת ההשתלה תהליכי בדיקה באים לידי ביטוי מספיק פרטים עבור שכפול קל.

בקנה מידה גדול הקלטה של ​​הנוירונים על ידי בדיקות מטלטלין סיליקון מתנהג מכרסמים

בפרוטוקול זה, אנו מעדכנים את ההתקדמות האחרונה בתחום ההדמיה...

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

למד הדמיית סידן רציומטרית של פעילות נוירונים HSN ב Caenorhabditis elegans מתנהגים. שיטה זו מאפשרת לחקור את הקשר בין פעילות מעגלים עצביים להתנהגות בעלי חיים.

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

גלה סרטונים נוספים