ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

המטרה הכוללת של פרוטוקול ניסוי זה היא לאפשר לחוקרי PTM חסרי ניסיון לקבוע ביעילות אם חלבון המטרה שלהם שונה באופן אנדוגני על ידי PTM אחד או יותר באמצעות מערכת מקיפה אחת. שיטה זו תשפר את החקירה של שדה השינוי לאחר התרגום על ידי מתן אפשרות לזיהוי PTMs מרכזיים ודיבור צולב פוטנציאלי עבור כל חלבון מטרה באמצעות מערכת אחת ופשוטה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמומחים שאינם PTM יכולים לזהות אם חלבון שונה באופן אנדוגני על ידי PTM אחד או יותר במערכת המודל שלהם.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר חקרנו מנגנוני ויסות עבור מספר מסלולי איתות תאים, וגילינו שהערכות או המערכות הידידותיות למשתמש שלנו לא באמת זמינות לחקר PTMs שאינם פוספו. התחל בהליך זה עם הכנת תאי A431, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כמו כן, הכינו ליזיס פיצוץ במאגרי דילול עם מעכבים.

יוצקים את אמצעי התרבות ומניחים את התאים על קרח. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של מי מלח 1x פוספט. הסר כמה שיותר PBS לפני הוספת מאגר ליזה פיצוץ כדי למקסם את ליזיס התאים.

הוסף 600 מיקרוליטר של מאגר ליזה פיצוץ לכל צלחת של 150 מילימטר. כמות המאגר מבוססת על תפוקת החלבון הצפויה. לאחר מכן, ליזה את התאים באמצעות מגרד תאים.

הליזאט יהפוך לצמיג עקב ליזה גרעינית. השתמש בקצה פיפטה חתוך של מילימטר אחד כדי להעביר את הליזאט הגולמי למסנן פיצוץ שהונח בצינור איסוף של 15 מיליליטר. השתמש בבוכנת המסנן המצורפת כדי לדחוס לחלוטין את מסנן הפיצוץ, ולאסוף את זרימת הליזאט, כולל כל בועות, בצינור של 15 מיליליטר.

מסנן הפיצוץ הפשוט והיעיל מסיר DNA גנומי, במקום לגזור אותו כפי שניתן לראות בשיטות נפוצות אחרות. מדללים את הליזט המובהר עם מאגר דילול פיצוץ לנפח סופי של שלושה מיליליטר לכל צלחת של 150 מילימטר. הכרך הסופי מבוסס על תפוקת החלבון הצפויה.

שלב זה חשוב, מכיוון שהרכב החיץ הסופי ישפיע על חומרת תגובת משקעי האמינו. לאחר מכן, הכינו את מבחן כימות החלבון, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מדוד את הספיגה של דגימת הליזאט ב-600 ננומטר, וחשב את ריכוז החלבון.

הפוך את צינור המגיב מספר פעמים כדי לוודא שהחרוזים תלויים לחלוטין בצינור. עבור כל בדיקת IP, יש לחלק את מתלה החרוזים לצינורות מיקרו צנטריפוגה נפרדים של 1.5 מיליליטר על קרח. כאן, הוסף 20 מיקרוליטר של חרוזי זיקה של יוביקוויטין, 30 מיקרוליטר של חרוזי זיקה לפוספוטירוזין, 40 מיקרוליטר של חרוזי זיקה SUMOylation 2/3, או 50 מיקרוליטר של חרוזי זיקה לאצטילציה לצינורות המיקרו צנטריפוגה הבודדים.

הפוך את צינורות הריאגנטים המכילים חרוזי בקרת IP בכל מקום וחרוזי בקרת IGG מספר פעמים כדי לוודא שהחרוזים מושעים לחלוטין בצינור. לאחר מכן, ציטט את חרוזי הבקרה לכל תגובת בקרה כדי לקבוע קשירה לא ספציפית. כאן, הוסף 20 מיקרוליטר של חרוזי בקרת יוביקוויטין, 30 מיקרו ליטר של חרוזי בקרה פוספוטירוזין, 40 מיקרוליטר של חרוזי בקרה SUMOylation 2/3, או 50 מיקרוליטר של חרוזי בקרת אצטילציה לצינורות מיקרו צנטריפוגות בודדים של 1.5 מיליליטר על קרח.

חסוך 20 מיקרוליטר ליזאט להפעלה כבקרת ליזאט קלט כתם מערבי. מוסיפים חמישה מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 5 לליזאט השמור ומרתיחים בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף ליזאט לכל צינור IP ושלוט בצינור IP.

כאן, נעשה שימוש במיליגרם אחד של ליזאט לכל תגובת IP ובקרה, וכתוצאה מכך בסך הכל שמונה תגובות IP. דגרו את הצינורות על פלטפורמה מסתובבת בקצה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר הדגירה, אספו את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב-3 עד 5, 000 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס.

שאפו כמה שיותר סופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים, ואז שטפו את החרוזים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת פיצוץ למשך חמש דקות על פלטפורמה מסתובבת של ארבע מעלות צלזיוס ואספו את החרוזים על ידי צנטריפוגה כמו קודם. לאחר הצנטריפוגה, שאפו כמה שיותר סופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים וחזרו על שלב הכביסה פעמיים נוספות. לאחר השטיפה והצנטריפוגה הסופית, שאפו את הרוב בסופרנטנט המאגר, ואז הסירו את שאריות הסופרנטנט באמצעות קצה העמסת חלבון עדין.

שיבוש מינימלי של כדור החרוז מקובל. ודא שכל מאגר הכביסה הוסר תוך מזעור ההפרעה לכדור הפעמה על מנת למקסם את ההתאוששות של חלבוני ה-PTM שלך. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר פליטת חרוזים והשהה מחדש את החרוזים על ידי הקשה או החלקה עדינה על צד הצינור.

אל תשתמש בפיפטה בשלב זה. דגרו את החרוזים התלויים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. גזור את קצה קצה פיפטת ההעברה והעביר בעדינות כל מתלה חרוזים לעמוד סיבוב מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר שהוצב בצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה את הדגימה בין תשע ל-10,000 פעמים G מדקה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את דגימת ה-IP, ואז להוסיף שני מיקרוליטרים של 2-מרקפטואתנול לכל דגימה ולערבב היטב. הכניסו את הדגימות לאמבט מים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הדגירה, אסוף את הדגימה על ידי צנטריפוגה ב-10,000 פעמים G למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.

לבסוף, המשך להפעלת SDS PAGE, העברה וניתוח כתמים מערביים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ליזאט תאי A431 שלא טופל וטופל ב-EGF נוסף ליוביקוויטין, פוספוטיזין, SUMO 2/3 וחרוזי זיקה של אצטיל ליזין. נוגדן PD-L1 שימש לניתוח אימונובלוט מערבי כדי לקבוע אם חלבון PD-L1 שונה על ידי ארבעת ה-PTMs הללו בתגובה לגירוי EGF.

תוצאות מייצגות המוצגות כאן מצביעות על כך ששיטה זו מזהה ביעילות שינויים אנדוגניים ב-PTM של PD-L1. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע עד ארבע וחצי שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות PTM אנוגני או הצלבה עבור חלבון המטרה או מסלול האיתות שלך באמצעות מערכת זיהוי PTM מקיפה זו.