ברמת הגנום RNAi ההקרנה כדי לזהות גורמים מארח לווסת את הטיפול Oncolytic וירוס

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לזהות מטרות מארח שניתן לתמרן כדי לשפר את הטיפול בנגיף אונקוליטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול בנגיפים אונקוליטיים, כגון אילו גורמי מארח ספציפיים ומסלולים תאיים מווסתים את שכפול הנגיף האונקוליטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לזהות מטרות מארח שניתן לתמרן כדי לשפר את הטיפול בנגיף אונקוליטי בצורה מקיפה וחסרת פניות.

ניתן להשתמש בפרוטוקול זה גם כדי לזהות גורמים מארחים המווסתים את שכפול הנגיף באופן כללי. לאחר פיתוח בדיקת סינון בתפוקה גבוהה על פי פרוטוקול הטקסט, הוציאו אצווה של צלחות מיקרוטיטר מהמקפיא והניחו להן להפשיר במשך 20 עד 30 דקות. בינתיים, מלאו שני בקבוקים באתנול 70%, ואז מלאו שני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל ב-PBS ואחד במים מזוקקים.

טבלו את צינורות המתקן הנוזלי לתוך בקבוק של 70% אתנול ולאחר מכן הניחו פיסת נייר דבק סביב הצינור כדי לסמן את הנקודה שמתחתיה הצינור יכול להיחשב סטרילי. השתמש בכ-25 מ"ל של 70% אתנול כדי לטשטש את הצינור. שפכו אתנול נוסף לבקבוק כדי להחליף את הנפח שאבד, ואז הניחו לצינור לשבת באתנול למשך חמש דקות לפחות.

לאחר הכנת מכסה המנוע של תרבית התאים, יש לצנטריפוגה את הצלחות האטומות ולהגדיר על 1026 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. לאחר מכן, הסר את החותמות מהצלחות. לאחר מכן פיפטה את הכמות הנדרשת של מגיב טרנספקציה לתוך הצינורות החרוטיים המכילים את מדלל ריאגנט הטרנספקציה שחומם מראש.

התחל לנסות את התאים על ידי שאיבת המדיום מכל צלחת. השתמש בתשעה מ"ל של PBS כדי לשטוף את התאים, ולאחר מכן פיפטה שלושה מ"ל טריפסין לצלחת. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כחמש דקות.

לאחר מכן, השתמש ב-22 מ"ל של מדיום כדי להשהות מחדש את התאים הזורמים למעלה ולמטה 10 פעמים. שלב את תרחיף התאים מכל צלחת תרבית רקמה לבקבוק סטרילי וערבב את תרחיף התאים על ידי היפוך הבקבוק. לאחר מכן פיפטה אחת מ"ל אליקווט בתרחיף התא לשני צינורות מיקרופוגה נפרדים.

הסר את הדגימה מכל צינור מיקרופוגה וספור את התאים. לאחר מכן חשב את נפח תרחיף התאים הנדרש לצפיפות הנדרשת, והכן מספיק תרחיף תאים מדולל כדי לחלק על פני אצווה אחת של צלחות. בזמן הכנת התאים, רוקנו את צינור מתקן הנוזל מאתנול.

השתמש בכ-25 מ"ל של PBS כדי לטשטש את הצינור, ולאחר מכן רוקן את הצינור. ודא שחלק הצינור שישקע במגיב טרנספקציה, ומאוחר יותר בתרחיף התא, נשמר סטרילי. הפרד צלחות שניתן לעשות בבטחה עם צינור חרוטי אחד של תמיסת ריאגנט טרנספקציה.

פיפטה את פתרונות ריאגנט הטרנספקציה למעלה ולמטה 10 פעמים. לאחר מכן השתמש בתמיסה כדי לטשטש את הצינורות לפני חלוקת 5 מיקרוליטר לבאר. צנטריפוגה את הצלחות ב 1026 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.

לאחר מכן דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך הזמן שנקבע למגיב הטרנספקציה בו נעשה שימוש. במהלך הדגירה, רוקנו את הצינור של תמיסת המגיב הטרנספקציה והניחו אותו בצינור חרוטי מלא של 50 מ"ל המכיל PBS. לאחר מכן השתמש בכ-25 מ"ל PBS כדי לשטוף את הצינור על ידי תחול ולאחר מכן ריקונו.

מערבבים את הבקבוק המכיל את תרחיף התאים, ואז מניחים את הצינור בתרחיף ומכינים את הצינור מספיק כדי לראות שכל קצה מתחלק כראוי. הוצא 30 מיקרוליטר לבאר של מתלה התא על פני כל הלוחות. רוקנו את תרחיף התא מהצינור, ולאחר מכן שטפו את הצינור בכ-25 מ"ל PBS ואחריו כ-50 מ"ל מים מזוקקים.

הניחו לצלחות לשבת בטמפרטורת החדר למשך 45 עד 60 דקות מרגע זריעת התאים. לאחר מכן דגרו את הצלחות באינקובטור ללא הפרעה למשך הרצוי של השתקת הגנים. כדי לחסוך זמן, יום לפני הדבקת התאים, הכניסו פיפטה לבקבוקים סטריליים את הכמות המדויקת של המדיום הנדרש כדי להדביק כל אצווה של צלחות, כולל מדיום לבארות לא נגועות.

מחממים את המדיום ב-37 מעלות צלזיוס, ואז ממלאים שני בקבוקים באתנול 70%, שני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל עם PBS ואחד במים מזוקקים. עקר את הצינור עם 70% אתנול כפי שהודגם קודם לכן. בזמן שהצינור יושב באתנול, תחילה מערבולת את הנגיף ולאחר מכן פיפטה את הנפח המדויק של הנגיף הנדרש לבקבוק המדיום הזיהומי.

לאחר מכן שטפו את הצינור באמצעות 25 מ"ל PBS כדי לטשטש אותו, ולאחר מכן רוקנו אותו. לאחר הוצאת הצלחות מהחממה, הניחו אותן במכסה המנוע של תרבית הרקמות. השתמש במדיום כדי לטשטש את הצינור, ולאחר מכן הוציא 40 מיקרוליטר של מדיום לבארות הבקרה הלא נגועות.

רוקן את הצינור של מדיום, והשתמש ב-25 מ"ל PBS כדי לשטוף אותו. לאחר ערבוב הנגיף, הכניסו את הצינור לבקבוק המכיל את הנגיף, חלקו 40 מיקרוליטר של נגיף על פני הצלחות. צנטריפוגה את הצלחות ב -400 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

דגרו את הצלחות למשך הזמן שנקבע בעבר. יום לפני הקיבוע, הכינו בקבוק של תמיסת קיבוע ועמידה המכילה ארבעה אחוז פורמלדהיד ו-PBS לכל אצווה של צלחות, אך השמיט את כתם הוכסט. אחסן את התמיסה בארון הדליק הרחק מאור.

למחרת, השתמש ב-70% אתנול ו-PBS כדי לשטוף את הצינורית כפי שהודגם קודם לכן. מחלקים 30 מיקרוליטר מהתמיסה על פני כל הצלחות, ואז מניחים את הצלחות בחממה למשך 30 דקות. לאחר הדגירה יש למרוח את האטמים על הצלחות ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס מוגנים מפני אור.

בצע הדמיה וניתוח על פי פרוטוקול הטקסט. מוצגים כאן 786 תאי O מוכתמים ב-Hoechst 33342 לאחר דגירה של 72 שעות עם מדלל ריאגנט טרנספקציה בלבד. מגיב טרנספקציה ומדלל, siRNA לא ממוקד, ועם siRNA המכוון ל-PLK1.

תרשים ההישרדות הנראה כאן מצביע על כך ש-22% מהתאים שהועברו עם PLK1 siRNA שרדו, ו-94% מהתאים שהועברו עם siRNA לא ממוקד שרדו. גרף זה מתאר את תוצאות מהלך זמן החיים של 786 תאי O הנגועים בנגיף החיסון האונקוליטי המבטאים GFP משופר ב-MOIs שונים. תמונות מייצגות של תאים הנגועים ב-MOI של 0.05 לאורך מסלול זמן חי מוצגות כאן.

תקופת דגירה של 21 שעות תאפשר זיהוי של עליות וירידות בהתפשטות מכיוון שנקודת הזמן נמצאת בטווח ליניארי. בעקבות מסכי RNAi ברחבי הגנום על פני שלושה קווי תאי גידול, זוהו 1008 פגיעות המשותפות לפחות לשניים מתוך שלושה קווי תאים סרטניים בשיטת MAD. 10 פגיעות במסלולי UPR ו-ERAD נבחרו לאימות משני באמצעות siRNA עם רצפי יעד שונים.

בעת חלוקת ריאגנטים, זה קריטי שתהיה לך את אצווה הצלחות הנכונה, בחרת את הנפח הנכון לחלוקה, ושהצינור מולא במגיב הנכון ותמיד שקוע במלואו במגיב. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מסך RNAi בעל תפוקה גבוהה כדי לזהות מטרות מארח שניתן לתמרן כדי לשפר את הטיפול בנגיף אונקוליטי, או לזהות גורמים מארחים המווסתים את שכפול הנגיף באופן כללי.