Name: פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: למד לייצר וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase מרוכזים לשימוש ב-CRISPR/Cas9 לעריכת גנים מהירה ויעילה בתאי HEK-293T ובנוירונים פוסט-מיטוטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות המחלקה לנוירוביולוגיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת דיוק ו- Office של דין עבור המדע הבסיסי, אוניברסיטת דיוק. אנו מודים גם חברי הגרעין וקטור ויראלי הדוכס להערות על כתב היד. פלסמיד pLenti CRISPRv2 היה מתנה ג'אנג פנג (במכון). מערכת LV-האריזה כולל את psPAX2 פלסמידים, VSV-G, pMD2.G, pRSV-Rev היה מתנה נחמדה Trono דידייה (EPFL, שווייץ). תמיכה כספית עבור עבודה זו העניקה של דרום קרוליינה מהפקולטה לרפואה באוניברסיטה, להעניק RDF18080-E202 (B.K).

<ol><li>Horvath, P., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas%2C+the+immune+system+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea.</a> Science. 327 (5962), 167-170 (2010).</li>
<li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference%3A+RNA-directed+adaptive+immunity+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea.</a> Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li>
<li>Bellec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+inactivation+by+lentiviral+vector-mediated+RNA+interference+and+CRISPR-Cas9+genome+editing+in+human+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells.</a> Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).</li>
<li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+hepatitis+B+virus+DNA+accumulation+in+chronically+infected+cells+using+a+bacterial+CRISPR%2FCas+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease.</a> Virology. 476, 196-205 (2015).</li>
<li>Roehm, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HSV-1+Replication+by+Gene+Editing+Strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy.</a> Sci Rep. 6, 23146(2016).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR5+gene+disruption+via+lentiviral+vectors+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA+renders+cells+resistant+to+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection.</a> PLoS One. 9 (12), e115987(2014).</li>
<li>Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+gene+transfer+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods for gene transfer to the central nervous system.</a> Adv Genet. 87, 125-197 (2014).</li>
<li>Lebbink, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinational+CRISPR%2FCas9+gene-editing+approach+can+halt+HIV+replication+and+prevent+viral+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape.</a> Sci Rep. 7, 41968(2017).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Mediated+CCR5+Ablation+in+Human+Hematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cells+Confers+HIV-1+Resistance+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo.</a> Mol Ther. , (2017).</li>
<li>Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Disruption+of+VEGF-A+Expression+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Using+CRISPR-Cas9+Endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).</li>
<li>Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Res. 42 (19), e147(2014).</li>
<li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+Cas9+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Schaefer, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+mutations+after+CRISPR-Cas9+editing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo.</a> Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).</li>
<li>Choi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+pre-packed+with+Cas9+protein+for+safer+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing.</a> Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Truong, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intein-mediated+split-Cas9+system+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).</li>
<li>Nelson, C. E., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Delivery+Vehicles+for+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).</li>
<li>Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylation+in+293GPG+packaging+cell+line+improves+the+production+of+self-inactivating+MLV-derived+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors.</a> Virol J. 3, 27(2006).</li>
<li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li>
<li>Hoban, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Genome+Editing+Reagents+to+Hematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).</li>
<li>Bayer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+U3+deletion+causes+increased+in+vivo+expression+from+a+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector.</a> Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).</li>
<li>Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+activation+of+unintegrated+HIV-1+genomes+by+gut-associated+short+chain+fatty+acids+and+its+implications+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).</li>
<li>Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrase-Deficient+Lentiviral+Vector+as+an+All-in-One+Platform+for+Highly+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Gene+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).</li>
<li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notable+reduction+in+illegitimate+integration+mediated+by+a+PPT-deleted%2C+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector.</a> Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).</li>
<li>Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+of+live%2C+attenuated+human+immunodeficiency+virus+type+1+vaccine+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains.</a> J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).</li>
<li>Gomez-Gonzalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatitis+B+virus+X+protein+induces+HIV-1+replication+and+transcription+in+synergy+with+T-cell+activation+signals%3A+functional+roles+of+NF-kappaB%2FNF-AT+and+SP1-binding+sites+in+the+HIV-1+long+terminal+repeat+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+zinc+finger+fusions+targeting+Sp1-binding+sites+and+the+trans-activator-responsive+element+potently+repress+transcription+and+replication+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1.</a> J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).</li>
<li>Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+distinct+alpha+subunits+of+GABAA+receptor+regulates+inhibitory+synaptic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength.</a> J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).</li>
<li>Van Lint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+downstream+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription+start+site+are+important+for+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity.</a> J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).</li>
<li>Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+regulatory+element+is+associated+with+a+nuclease-hypersensitive+site+in+the+pol+gene+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).</li>
<li>Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+residual+promoter+activity+in+gamma-retroviral+self-inactivating+%28SIN%29+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors.</a> Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).</li>
<li>Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf">https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf</a> (2017).</li>
<li>CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf">https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf</a> (2017).</li>
<li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
</ol>

פטנטים USC-499-P (1175) הוגשה על-ידי באוניברסיטת דרום קרוליינה ביחס העבודה המתוארת בכתב היד.

IDLVs החלו להסתמן כמו הרכב של ויוו ג'ין-עריכה, במיוחד בהקשר של מחלות גנטיות, בעיקר בשל הסיכון נמוך מוטגנזה מכוונת המשויך וקטורים אלה בהשוואה שילוב פלטפורמות משלוח22 , 28. בחוברת הנוכחית חיפשנו לפרט פרוטוקול המשויך הייצור של המערכת IDLV-CRISPR/Cas9 ה-all-in-one משופרת שפותח לאחרונה שלנו מעבדה28.
שינויים פלטפורמות קיימות בשיטה זו, הצלחנו לייצר IDLV-CRISPR/Cas9 ווקטורים ICLV-CRISPR/Cas9...

ג'ין מדויק עריכה צורות היסוד של התקדמות גדולה ביו המערבות הפיתוח של אסטרטגיות מקוריות כדי להתמודד עם מחלות גנטיות. At בחזית טכנולוגיות לעריכת ג'ין היא השיטה להסתמך על השימוש clustered regularly -אניnterspaced sהורט palindromic repeats (CRISPR) / מערכת Cas9 היה מזוהה תחילה רכיב של חיידקי חסינות מפני הפלישה של החומר הגנטי הנגיפי (נבדקה הפניות1,2). יתרון גדול של מערכת CRISPR/Cas9 על עריכת הגן כלים אחרים, כגון אבץ-אצבע nucleases (ZFNs) ו- nucleases אפקטור activator דמוי שעתוק (TALENs) (נבדקה הפניה3), הוא הפשטות היחסית של פלסמיד עיצוב ו בניית רכיבים CRISPR — תכונה יש מופעל הרחבת גן לעריכת ממעבדות מיוחדים כמה רחב יותר לקהילה מחקר רב. בנוסף, הפשטות של תכנות CRISPR/Cas9 ואת יכולת זיהוי המטרה מרובבת יש נוספת מונעת את הפופולריות שלו כטכנולוגיה חסכוניים, קל לשימוש. בין השיטות השונות לרשות החוקרים למסור לרכיבים אלה לעריכת ג'ין תאים, וקטורים ויראלי נותרו עד כה במערכת הפופולרית והיעילה ביותר.
Lentiviral וקטורים (אותו) הופיעו כמו הרכב של לספק את הרכיבים של CRISPR/Cas9 מערכת ויוו עבור יישומים שונים ומגוונים4,5,6,7. מספר תכונות מפתח להפוך אותו בחירה פופולרית עבור תהליך זה כולל את היכולת שלהם להדביק החלוקה הלא-חלוקת תאים, immunogenicity נמוך, והן רעילות מינימלית הסלולר (נבדקה הפניה8). כתוצאה מכך, LV בתיווך ריפוי גנטי כבר מועסקים בטיפולים של מחלות זיהומיות, כגון HIV-1, HBV ו- HSV-1, כמו גם את התיקון של פגמים הבסיסית האנושית מחלות תורשתיות, כגון סיסטיק פיברוזיס, ניאו-וסקולרית ניוון מקולרי 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Moreover, הזינו אותו ביעילות שונו כדי לבצע ג'ין מולטיפלקס העריכה ברורים לוקוסים גנומית באמצעות מערכת של וקטור יחידה12.
עם זאת, המאפיין הטבועה של אותו לשלב לתוך הגנום המארח יכול להיות מוטגן, לעיתים קרובות מגבילה את השירות שלהם בתור כלי רכב משלוח transgene, במיוחד בהגדרות קליני. יתר על כן, מאז אותו משולבת stably אקספרס transgenes שלהם ברמה גבוהה בר קיימא, מערכת זו היא נועד למסירה של עריכת ג'ין רכיבים כגון CRISPR/Cas9; ביטוי של Cas9-מדריך RNA (gRNA), חלבונים דומים כגון ZFNs, קשורים עם רמות גבוהות של חופש-יעד אפקטים, הכוללים מוטציות לא רצויים13,14,15,16 , 17 פוטנציאלי יכול לשפר את cytotoxicity18. כדי להשיג דיוק לעריכת ג'ין עם תופעות מינימליות את המטרה, לכן לבריאותה של עיצוב מערכות המאפשרות עבור הביטוי ארעית של ג'ין עריכה רכיבים.
בשנים האחרונות פותחו מגוון רחב של פלטפורמות משלוח לבטא transiently CRISPR/Cas9 תאים16,19,20,21 (נבדקה הפניה22). אלה כוללים שיטות המסתמכות על ישירות ידביקו מטוהרים Cas9 יחד עם RNAs המדריך המתאים תאים, אשר הוצגה להיות יעילה יותר ממוקד לעריכת ג'ין לעומת תקנים בתיווך פלסמיד16. מחקרים הראו כי ribonucleoprotein (RNP) מתחמי המורכב מדריך RNA/Cas9 החלקיקים מופעלים במהירות לאחר תיווכה ביקוע DNA במטרות שלהם, רומז כי הביטוי לטווח קצר של רכיבים אלה מספיקה להשיג גנים חזקים עריכה16. . שכעיקרון, שילוב שאינו וקטור ויראלי פלטפורמות כגון adeno-הקשורים וקטורים ויראלי (AAVs) יכול לספק אלטרנטיבה מעשית כדי לספק מכונות לעריכת גנים לתאים. למרבה הצער, AAV capsids בעלי יכולת אריזה נמוך משמעותית מאשר אותו (< 5kb), אשר פוגעת קשות ביכולתם כדי לארוז את ערכת הכלים CRISPR רב רכיבים בתוך וקטור יחידה (נבדקה הפניה8). ראוי לציין כי תוספת של תרכובות היסטון deacetylases (למשל, נתרן butyrate23) לעכב או לעצור את מחזור התא (למשל, קפאין24) הוכחו להגביר את lentiviral titers. למרות התקדמות האחרונות, המערכות ביטוי ארעי פיתחה עד כה הם עדיין מובן חסרונות מספר, כגון יעילות ייצור נמוכה יותר, אשר להוביל titers ויראלי מופחתת ויעילות נמוכה התמרה חושית של וירוסים שנוצר דרך כך ניגש25.
וקטורים lentiviral חשוכת-Integrase (IDLVs) מייצגים לקידום המשמעותי בפיתוח של ג'ין-מסירה רכב, המשלבים את היכולת אריזה של אותו עם ערך מוסף כמו AAV תחזוקה episomal בתאים. תכונות אלה מסייעות IDLVs במידה רבה לעקוף את הנושאים העיקריים הקשורים עם שילוב של וקטורים, ושהבנק vis ביטוי רציף של פוטנציאל genotoxic רכיבים, המוטגניות בתיווך אינטגרציה. בעבר הוכח כי ניתן לשנות בהצלחה IDLVs כדי לשפר את ג'ין episomal ביטוי26,27. לגבי משלוח בתיווך IDLV CRISPR/Cas9, ייצור נמוך titers וביטוי התחתון של הגנום בעקיצות episome ביחס למערכות lentiviral integrase שולטים מגביל את השירות שלהם פיד ה בונה כלי להעברת לעריכת הגנום בונה מהונדס. לאחרונה להדגים כי הביטוי transgene והן titers ויראלי המשויך IDLV ייצור באופן משמעותי משופר על ידי הכללת מחייב אתרים עבור גורם שעתוק Sp1 בתוך קלטת הביטוי ויראלי28. IDLVs ששונה robustly הנתמכים בתיווך CRISPR גן לעריכת במבחנה (בתאים HEK-293T) והן ויוו (בתוך הנוירונים במוח mitotic פוסט), תוך גרימת מוטציות את המטרה מזערית בהשוואה המתאימה בתיווך ICLV מערכות28. בסך הכל, פיתחנו רומן, ערכת CRISPR קומפקטי, ה-all-in-one נישא על פלטפורמה IDLV, התווה את יתרונות שונים של שימוש כזה משלוח הרכב לעריכה ג'ין משופרת.
כאן, פרוטוקול הייצור של המערכת IDLV-CRISPR/Cas9 הוא כמתואר לעיל, כולל את השלבים השונים הכרוכים הרכבה, היטהרות, ריכוז, וכן טיטור של IDLVs, כמו גם אסטרטגיות כדי לאמת את היעילות לעריכת גנים של וקטורים אלה. פרוטוקול זה בקלות להרחבה כדי לענות על הצרכים של חוקרים שונים והוא נועד ליצור בהצלחה LV וקטורים עם titers בטווח של 1 x 1010 יחידות (טו) transducing / mL. הווקטורים שנוצר באמצעות פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל ביעילות תדביק את מספר סוגי תאים שונים, לרבות קשה-עד-מגלי בתאי גזע עובריים, תאים hematopoietic (תאי-T ו מקרופאגים), ותרבותית, vivo- נוירונים מוזרק. יתר על כן, הפרוטוקול היא באותה מידה מותאם היטב עבור הייצור של וקטורים lentiviral integrase-המוסמכת בכמויות דומות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig1.jpg"> איור 1: אריזה IDLV. (א) סכמטית פראי סוג integrase חלבון (ב') פלסמיד ששונה נבעה psPAX2 (ראה שיטות בנייה פלסמיד לפרטים). נציג agarose ג'ל תמונה של שיבוטים איבחון integrase מוטציה שיבוטים. דגימות די אן איי המוכנים דנ א פלסמיד רגיל בידוד ערכת מיני נותחו על ידי עיכול עם EcoRV ו- SphI. מתעכל כראוי השיבוט (מס ' 5, תיבת אדום מקווקו) נוסף אומתה על ידי רצף ישיר (סנגר) עבור החלפה D64E ב INT. בקלטת האריזה לקויה integrase נקרא pBK43. (ג) תיאור סכמטי של פרוטוקול תקנים ארעי מועסקים ליצירת וקטורים IDLV-CRISPR/Cas9, מציג 293T תאים transfected עם VSV-G, אריזה transgene קלטות (Sp1-CRISPR/Cas9 ה-all-in-one פלסמיד). נגיפים זה באד של קרום התא להכיל את הרנ א באורך מלא של וקטור (הביע מ הקלטת transgene). הדור השני של מערכת IDLV-אריזה שימש, אשר כוללת את חלבוני Tat, הכומר Rev ביטוי נוסף מצורפים מ קלטת נפרדת (RSV-REV-פלסמיד). Abbrev: משמאל לימין-ארוך-מסוף stomatitis vesicular אני חוזר, VSV-G, וירוס גרם חלבון, יזם pCMV-cytomegalovirus; סרקומה ראוז יזם וירוס (RSV); הכנה-(רכיב תשובה Rev). רכיבים אחרים רגולטוריות בקלטת ביטוי כוללות אתרים מחייב Sp1, רכיב Rev תשובה (הכנה), מרמיטה הפטיטיס וירוס Posttranscriptional תקינה רכיב (WPRE), מקדם 1α גורם התארכות הליבה (EFS-NC), האריזה וקטור רכיב ψ (psi), אנושי המקדם Cytomegalovirus (hCMV) ויזם U6 אנושי. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אופטימה XPN-80 אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>אלגרה 25R צנטריפוגה שולחנית</td><td>בקמן קולטר</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>xMark Microplate קורא צלחות ספיגה</td><td>Bio-Rad</td><td>1681150</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>Leica</td><td>DM IRB2</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&mu; יחידת סינון m, צינורות</td><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td></td> תחתונים חרוטיים 430773 <td></td>קורנינג 500 מ"</tr>ל <tr><td></td><td>Seton Scientific</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>מתאמי צינור חרוטי</td><td>Seton Scientific</td><td>PN 4230</td><td></td></tr><tr><td>SW32Ti רוטור דלי מתנדנד</td><td>בקמן קולטר</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל חרוטי צינורות צנטריפוגה</td><td>קורנינג</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות מחייבות גבוהה</td><td>קורנינג</td><td>3366</td><td></td></tr><tr><td>150 מ"מ צלחות תרבית תאים מטופלות TC עם 20 מ"מ</td><td>רשת קורנינג</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחת תרבית מטופלת</td> TC <td></td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; יחידת סינון M, 1 ליטר</td><td>קורנינג</td><td>430513</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep ספין Miniprep ערכת מיני-פרפ (50)</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות תרבית רקמות, 5 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות תרבית רקמות, 10 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות תרבית רקמות, 25 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>המציטומטר עם החלקות כיסוי</td><td>קול-פארמר</td><td>UX-79001-00</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Cell Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי כליה עוברית אנושית 293T (HEK 293T) תאי</td><td></td><td></td> ATCC CRL-3216 <td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, מדיה גבוהה של גלוקוז</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic Calf</td><td>Serum Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית, 100X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S8636-100ML</td><td></td></tr><tr><td>חומצת אמינו לא חיונית (NEAA)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 מדיה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td> <td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>BES (N, N-bis (2-הידרוקסיאתיל)-2-חומצה אמינו-אתנסולפונית)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B9879 - BES</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G1800-100G</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>p24 ELISA reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>monoclantal anti-p24 נוגדנים</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>3537</td><td></td></tr><tr><td>תקני HIV-1</td><td>NIH תוכנית מחקר והתייחסות לאיידס</td><td>SP968F</td><td></td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי-p24 נוגדן</td><td>NIH AIDS מחקר ותוכנית ריאגנטים ייחוס</td><td>SP451T</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב חזרת פרוקסידאז IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12-348</td><td>ריכוז עבודה 1:1500</td></tr><tr><td>סרום עכבר רגיל, סטרילי, 500 מ"ל</td><td>Equitech-Bio</td><td>SM30-0500</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים, סטרילי, 10 מ"ל</td><td>סיגמא</td><td>G9023</td><td>ריכוז עבודה 1:1000</td></tr><tr><td>מצע פרוקסידאז TMB</td><td>KPL</td><td>5120-0076</td><td>ריכוז עבודה 1:10,000</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תגובות</ חזק></td></tr><tr><td><חזק>פלסמידים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>Restriction Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0580S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>SphI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0182S</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים lentiviral חשוכת-integrase עבור crispr/cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

וקטורים lentiviral הם הבחירה האידיאלית עבור אספקת רכיבים לעריכת גנים בתאים עקב שטמונה בהם stably transducing רחבה של תאים, מתווכים רמות גבוהות של ביטוי גנים. עם זאת, היכולת שלהם להשתלב הגנום של התא המארח מגבירה את הסיכון המוטגניות insertional ובכך מעלה חששות בטיחות, מגביל את שימושם בהגדרות קליניים. עוד, הביטוי מתמיד של רכיבים לעריכת גנים מועברים על ידי הללו עליות וקטורים אינטגרציה-כשיר lentiviral (ICLVs) ההסתברות של ג'ין מופקר מיקוד. כחלופה, דור חדש של וקטורים lentiviral חשוכת-integrase (IDLVs) פותחה הנותן מענה הרבה חששות אלה. כאן הפרוטוקול הייצור של פלטפורמה IDLV חדשות ומשופרות בתיווך CRISPR גן עריכה של רשימת הצעדים מעורב הטיהור, שמתואר הריכוז של וקטורים כזה שלהם התמרה חושית ואת יעילות לעריכת הגן באמצעות HEK-293T הודגם תאים. פרוטוקול זה הוא שניתן להרחבה בקלות והוא יכול לשמש כדי ליצור IDLVs כייל נוגדנים גבוה כי הם מסוגלים transducing תאים בתוך חוץ גופית ו vivo בתוך. יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לייצור של ICLVs.

אימות של נוקאאוט-היעילות של וקטורים IDLV-CRISPR/Cas9 השתמשנו GFP-לבטא 293T תאים כמודל כדי לאמת את היעילות של CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי. GFP + תאים נוצרו על ידי התמרה חושית של תאים HEK-293T עם pLenti-GFP (vBK201a)-MOI של 0.5 (איור 3b, "לא-וירוס" לוח). הקלטת sgRNA-כדי-GFP/Cas9 ה-all-in-one וקטור נארזה לתוך חלקיקים IDLV או ICLV, יעילות ייצור הוערכה על ידי p24 אליסה (ראה לעיל; ו להבין 3a). Titers ...

אנו מתארים את האסטרטגיה הייצור של וקטורים lentiviral חשוכת-integrase (IDLVs) בתור כלי רכב להעברת CRISPR/Cas9 לתאים. עם היכולת לתווך ג'ין מהיר וחזק עריכה בתאים, IDLVs להציג דרך בטוחה יותר, פלטפורמה וקטור יעיל באותה מידה המסירה הגן לעומת integrase-המוסמכת וקטורים.

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לתאר את הייצור והיישומים הפוטנציאליים של וקטורים לנטיביריים אופטימליים חסרי אינטגראז, המסוגלים להעביר טרנסגנים של CRISPR/Cas9 לתאים in vivo ו-in vitro לצורך עריכת גנים מהירה ויעילה. CRISPR/Cas מהווה פלטפורמה יעילה ביותר לעריכה ומניפולציה של גנים. להלן קווי מתאר של פרוטוקול לייצור וקטורים לנטיביריים אופטימליים חסרי אינטגראז בריכוז גבוה למסירה יעילה של כלי עריכת גנים מבוססי CRISPR/Cas.הטכניקה הוכחה כיעילה מאוד בתאי תרבית ובנוירונים פוסט-מיטוטיים. זרעו את תאי ה-HEK-293T יום לפני הטרנספקציה, כך שהצפיפות התאית (confluency) תגיע ל-70 עד 80% למחרת. לפני הטרנספקציה, שאבו את המצע הישן מלוחיות התרבית והוסיפו מצע שהוכן טרי וללא סרום.במבחנה קונית של 15 מיליליטר, הוסיפו את כל ארבעת הפלסמידים כדי להכין תערובת פלסמידים לטרנספקציה של צלחת בקוטר 15 סנטימטרים. לאחר מכן, הוסיפו לתערובת הפלסמידים 312.5 µL של calcium chloride בריכוז 1 M והשלימו את הנפח ל-1.25 milliliters באמצעות מים סטריליים מזוקקים פעמיים. הוסיפו טיפות של תמיסת BES buffered 2X בהדרגה תוך כדי ערבול ב-vortex.לאחר מכן, דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסיפו בטפטוף 2.5 milliliters של תערובת פלסמיד לכל אחת מהצלחות ה-15-centimeter. לאחר מכן, סובבו את הצלחות בעדינות ודגרו ב-37 degrees Celsius עם 5%carbon dioxide למשך שתיים עד שלוש שעות.לאחר שלוש שעות, הוסיפו 2.5 milliliters של 10% serum לכל צלחית והמשיכו לדגירה למשך הלילה. השתמשו בפיפטה לתרביות רקמה של 10-milliliters כדי לשאוב בזהירות את העל-נוזל (supernatant) מהתאים שעברו טרנספקציה ונזרעו בכל צלחית תרבית. לאחר מכן, רכזו את כל העל-נוזל במבחנות צנטריפוגה של 50-milliliters.הנח את המבחנה בתוך צנטריפוגה שולחנית והתחל את הסבוב. לאחר מכן, סנן את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות יחידת סינון בוואקום של 0.45-micrometer. מלא את מבחנות האולטרה-צנטריפוגה הקוניות בריכוזי סוכרוז שונים כדי ליצור שכבות עם מדרג סוכרוז.הוסיפו בזהירות את העלון המכיל את הווירוס למדרג הסוכרוז. כדי לעבד את כל נפח העלון הוויראלי של 100-milliliter, השתמשו בשש מבחנות אולטרסנטריפוגה בכל סבב. לאחר מכן, איזנו את מבחנות האולטרסנטריפוגה עם בופר 1X PBS וסובבו את הדגימות ב-70,000 g למשך שעתיים ב-17 degrees Celsius.במבחנות נקיות, אספו את פראקציות הסוכרוז בריכוז 30% ו-60% והוסיפו באפר 1X PBS קר כדי להתאים את הנפח ל-100 milliliters. ערבבו את הדגימות על ידי פיפוט מעלה ומטה מספר פעמים. לאחר מכן, הוסיפו 20 עד 25 milliliters של התמיסה הנגיפית מעל ארבעה milliliters של 20% סוכרוז בתמיסת 1X PBS כדי להכין את כרית הסוכרוז.התאימו את הנפח באמצעות בופר 1X PBS סטרילי אם השפופרות אינן מלאות עד לפחות 3/4, ואז אתזנו אותן. לאחר מכן, סובבו את הדגימות במשך שעתיים בטמפרטורה של 17 degrees Celsius. לאחר מכן, שפכו את העל-נוזל (supernatant) ונקזו את הנוזל שנותר על ידי היפוך השפופרות על גבי נייר סופג.לאחר שאיבת טיפות הנוזל האחרונות שנותרו, משקע המכיל את הנגיף נראה בקושי ככתם שקוף. לאחר מכן, השביו את המשקע ב-70 microliters של 1X PBS באמצעות פיפוט יסודי של התמיסה. העבירו שוב את התמיסה למבחנה אחרת וערבבו היטב כדי להמיס את המשקע לחלוטין.לאחר מכן, שטפו את המבחנה עם 50 µL נוספים של בופר 1X PBS קר וערבבו. החזיקו את הדגימות במיקרוצנטריפוגה שולחנית וסובבו במהירות של 10,000 g למשך 30 שניות. לאחר הסבב, העבירו מנות של 10 µL מהעליון (supernatant) לכל מבחנה מיקרופוגית נקייה ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80- °C.צפו פלטת 96 בארות בעלת קישוריות גבוהה (high-binding) ב-100 µL של נוגדן מונוקלונלי anti-p24 בדילול של 1:5,000, בהתאם להנחיות ערכת ה-NIH AIDS vaccine program לבדיקת לכידת אנטיגן HIV-1 p24. דגרו את הפלטה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, שטפו את הפלטה שלוש פעמים עם 200 µL של 0.05% TWEEN-20 ב-PBS קר.כדי למנוע קישור לא ספציפי, חסמו את הפלטה עם 200 µL של 1% bovine serum albumin למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הפלטה שלוש פעמים עם 200 µL של 0.05% TWEEN-20 ב-PBS קר. לאחר מכן, הכינו את דגימות הווקטור המרוכזות והבלתי-מרוכזות לריכוז סופי של 10% על ידי דילול הווקטור במים מזוקקים פעמיים וב-Triton X-100.בשלב הבא, הכינו את תמיסות הסטנדרט של HIV-1 באמצעות דילול סדרתי פי שניים, החל מ-5 ng/mL. לאחר דילול דגימות הווקטור המרוכזות והבלתי-מרוכזות, העבירו אותן בעזרת פיפט לצלחת בשלוש שכפולות (triplicates) והדגרימו בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. למחרת, שטפו את הצלחת, ולאחר מכן הוסיפו 100 µL של נוגדן פוליקלונלי של ארנב נגד p24 לכל באר והדגרימו בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות.לאחר שש שטיפות, דגרו את הפלטה עם נוגדן goat anti-rabbit horseradish peroxidase בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר מספר שטיפות, דגרו את הפלטה עם substrat TMB peroxidase בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הוסיפו חומצה כלורית נורמלית אחת כדי לעצור את התגובה. קראו את הבליעה ב-450 nm באמצעות קורא פלטות (absorbance plate reader).זריעה של התאים בפלטה בעלת שישה בארות. למחרת, כאשר התאים מגיעים ל-90% confluency, בצעו טרנסדוקציה באמצעות נגיף מטוהר בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) קבוע מראש בטווח שבין 1 ל-10.לאחר מכן, דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. עקבו אחר הפלטות כדי לתעד הבדלים באותי ה-GFP במרווחי זמן קבועים למשך יום אחד עד שבעה ימים. חפשו תאים חיוביים ל-GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בסט מסנני GFP עם אורכי גל של עירור ופליטה של 470 ו-525 ננומטרים, בהתאמה.כדי להבדיל בין האוכלוסיות של תאים חיוביים ושליליים ל-GFP, השתמשו בתאים שלא עברו טרנסדוקציה. ג'ל אגרוז נRepresentative המראה את השיבט של האינטגרז המוטטי חיובי. השיבט שעבר עיכול כפול עם אנזימי הגבלה EcoRV ו-SPH1 בתוך המסגרת המקווקוות באדום מייצג את השיבט של האינטגרז המוטטי.השכפול עבר ריצוף נוסף כדי לבדוק את המוטציה של חומצה אספרטית בעמדה 64 לחומצה גלוטמית. מוצג גרף עמודות מייצג עבור בדיקת p24 ELISA, המראה את התריים הוויראליים עבור וקטור לנטיוויראלי CRISPR/Cas9 חסר SP1-integrase (מסומן בעמודה השחורה) ווקטורים לנטיוויראליים CRISPR/Cas9 בעלי יכולת SP1-integration (מסומנים בעמודה הלבנה). גרף העמודות מראה תריים ויראליים חסרי ויכולת אינטגראז בטווח של 10¹⁻. גרף העמודות מייצג את מספר העותקים של חלקיקים ויראליים למיליליטר.תמונות פלואורסצנטיות מייצגות המראות את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של תאים חיוביים ל-GFP תחת טיפול ויראלי. התאים עברו טרנסדוקציה עם וקטורים לנטיביריים בעלי יכולת אינטגרציה של CRISPR או רכיבים ויראליים של וקטור לנטיבירי חסר אינטגראז של CRISPR.נצפתה ירידה חדה באות ה-GFP בריבוי זיהום של אחת וחמש, בהתאמה, לאחר העברה של רכיבי לנטיווירס בעלי יכולת אינטגראז או חסרי אינטגראז, בהשוואה לתאי הבקרה שלא עברו העברה. היתרון המרכזי של טכניקה זו נובע מהיכולת של וקטורים לנטיווירליים חסרי אינטגראז להביא כלי לעריכה גנומית באופן זמני, דבר המשפר משמעותית את הספציפיות והבטיחות שלו. אם הפרוטוקולים בוצעו כראוי, הם אמורים להיסכם תוך שבוע.בעת ביצוע פרוטוקול זה, יש לצפות להפקת וקטורים לנטיוויראליים בריכוז גבוה, בטווח של 10⁹ עד 10¹⁰ גנומים ויראליים ל-mL.

a-protocol-for-production-integrase-deficient-lentiviral-vectors-for

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) מערכת מספקת כלי מבטיח עבור הנדסה גנטית, ופותחת לו את האפשרות של שילוב יישוב של transgenes. אנו מתארים קצה בתיווך הומולוגיה להצטרף (HMEJ)-המבוססת על אסטרטגיה עבור DNA יעיל ממוקד אינטגרציה ויוו , ממוקד ג'ין טיפולים באמצעות CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

תיאר הם פרוטוקולים עבור עריכת הגנום יעיל מאוד של גזע המטפאות מורקיים ומחולל קדמון (HSPC) על ידי מערכת CRISPR/Cas9 כדי לפתח במהירות מערכות מודל העכבר עם המטפאות ספציפיים שינויים גנים.

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

כאן, אנו מתארים כלי לעריכת גנום המבוסס על ייצוב זמני ומותנה של מקובצים באופן קבוע בין-חללים קצרים פלינדרומיים חוזרים- (CRISPR-) חלבון הקשורים 9 (Cas9) תחת המולקולה הקטנה, Shield-1. השיטה יכולה לשמש לתאים בתרבית ומודלים של בעלי חיים.

ערכת כלים חדשה להערכת פונקציות גנים באמצעות ייצוב מותנה של Cas9

הפרוטוקול מתאר כיצד ליצור מיובלסטים נוק-אאוט באמצעות CRISPR/Cas9, החל מתכנון של רנ"א מנחים ועד לשיבוט תאי ואפיון של שיבוטים נוק-אאוט.

פיתוח קווי תאי שריר נוק-אאוט באמצעות עריכת גנים של קריספר/Cas9 בתיווך נגיף לנטי

ככל שפרוטוקולים הקשורים לקריספר הופכים שימושיים ונגישים יותר ויותר, סיבוכים ומכשולים עדיין יכולים להיווצר בתנאי ניסוי ספציפיים. פרוטוקול זה מתאר את היצירה של קו תאים אנושיים נוקאאוט של סרין/תראונין-חלבון קינאז 1 (RIPK1/RIP1) באמצעות CRISPR/Cas9 ומדגיש אתגרים פוטנציאליים בהם נתקלים במהלך תהליך זה.

יצירת קו תאים RIP1 Knockout U937 באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

טכניקת גנוטיפ המתוארת כאן, אשר זוגות תגובת השרשרת של פולימראז פלורסנט (PCR) כדי נימי ג'ל אלקטרופורזה, מאפשרת גנוטיפ תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. זה עוקף מגבלות בפני טכניקות גנוטיפ אחרות הוא יותר חסכוני מאשר שיטות סידור.

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

למד לייצר וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase מרוכזים לשימוש ב-CRISPR/Cas9 לעריכת גנים מהירה ויעילה בתאי HEK-293T ובנוירונים פוסט-מיטוטיים.

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

גלה סרטונים נוספים