תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

המטרה הכוללת של בדיקת צבירה זו היא להעריך את הקישור של קולטן Notch עם טרנס-ליגנדים ועיכובו על ידי cis-ligands. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח, כיצד ישפיע גורם גנטי או פרמקולוגי על קשירת קולטן Notch לליגנד שלו, ולשנות את האיתות? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת להעריך את קשירת הטרנס והסיס של קולטן Notch עם הליגנד שלו.

מעניין, מבלי לערב את ההשפעה החופפת של ליגנד אנדוגני. התחל את ההערכה על ידי סיבוב תאים קולטי אותות והשעייתם מחדש במדיום של שניידר. ספור את התאים באופן ידני באמצעות המציטומטר.

צלחת חמש כפול 10 ל-S2 החמישי ותאי S2-Notch יציבים בכל באר של צלחת של שש בארות, במיליליטר אחד לבאר של המדיום של שניידר. לאחר מכן, הוסיפו 7.5 מיקרוגרם של RNA דו-גדילי לכל באר, ודגרו על התאים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. הוסף 0.7 מילימולר של סולפט נחושת כדי לגרום לביטוי של Notch, ודגירה על התאים ב-25 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים.

לאחר הדגירה, ספרו את התאים שולחי האותות באופן ידני באמצעות המציטומטר. וצלחת חמש פעמים 10 עד שישית תאים יציבים בכל באר של צלחת של שש בארות, במיליליטר אחד לבאר של מדיום שניידר בתוספת לאחר מכן הוסיפו 0.7 מילי-מולר של נחושת גופרתית כדי לגרום לביטוי של ליגנדים, ודגרו על התאים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.

קצור את תאי בקרת S2 ו-S2-Notch הדו-גדיליים שטופלו ב-RNA על ידי פיפטינג עדין. וצלחת 2.5 כפול 10 עד חמישית תאים לבאר בצלחת של 24 בארות. הוסף חמש פעמים 10 לתאי העגבנייה היציבים החמישיים S2-Delta או S2-משוננים לנפח כולל של 200 מיקרוליטר של מדיום שניידר בתוסף.

הנח את הצלחת על שייקר מסלולי ב-150 סל"ד. לאחר דקה מערבבים את תכולת כל באר, ומוציאים 20 מיקרוליטר כדי לספור את מספר האגרגטים. במקביל, צלם תמונה מייצגת תחת מיקרוסקופ מורכב הפוך באמצעות הגדלה פי 10.

כדי לדמיין את התאים, כוון את המצלמה על המיקרוסקופ והתחבר לתוכנה כדי להשיג את התמונה. ספור ידנית את האגרגטים באמצעות המציטומטר. הניחו את הצלחת על השייקר.

חזור על רכישת התמונה וספירתה לאחר חמש דקות ו-15 דקות של צבירה. בצע כימות טרנס-קשירה על ידי חישוב מספר האגרגטים למיליליטר בין תאי S2 לתאי עגבנייה S2-Delta או S2-Serrate כבקרת רקע, ומספר האגרגטים למיליליטר בין תאי עגבנייה S2-Notch ו-S2-Delta או S2-משוננים. הכן את התאים קולטי האותות על ידי ציפוי חמש פעמים 10 לתאי S2 החמישי בכל באר של צלחת של שש בארות, במיליליטר אחד לבאר של מדיום שניידר בתוספת

הוסיפו 7.5 מיקרוגרם של RNA דו-גדילי לכל באר, ודגרו על הצלחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, יש לשלב את התאים הדו-גדיליים שטופלו ב-RNA לריכוז DNA כולל של שני מיקרוגרם לבאר באמצעות מגיב טרנספקציה מסחרי. דגרו על תאי S2 שעברו טרנספטציה חולפת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

למחרת, הוסיפו 0.7 מילי-מולרי נחושת גופרתית כדי לגרום לביטוי של Notch והליגנדים, ודגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. הכן תאים שולחי אותות כמתואר בסעיף הקודם. ולבסוף, בצע צבירה בין תאים שולחי אותות ומקבלי אותות, כפי שתואר קודם לכן.

עלייה חדה נצפתה במספר המצרפים בין דקה לחמש דקות. ואז מספר האגרגטים המשיך לגדול עד 30 דקות, בקצב איטי יותר. תמונות המציגות את הצבירה בשלוש נקודות זמן מדגימות שתאי S2-Notch דו-גדיליים שטופלו ב-RNA של EGFP יצרו אגרגטים עם תאי S2-Delta, שמספרם גדל עם הזמן.

לעומת זאת, תאי S2-Notch שטופלו ב-RNA דו-גדילי יצרו אגרגטים מהר יותר, והאגרגטים היו גדולים וגדולים יותר במספרם. מה שמצביע על כך שהפחתת רמות ה-shams שיפרה את הטרנס-קשירה של Notch עם דלתא. העברת כמויות שוות של מבני ביטוי Notch ו-Delta לתאי S2 מפחיתה באופן דרמטי את מספר האגרגטים הנוצרים בין תאים אלה לתאי S2-Delta.

יתר על כן, הפחתת כמות cis-Delta מביאה לעלייה במספר האגרגטים. מה שמצביע על כך שבטווח יחסי Notch/cis-Delta המשמשים במבחנים אלה, cis-Delta יכול לעכב את הקישור בין Notch לטרנס-דלתא באופן תלוי מינון. כימות הצבירה היחסית הראה עיכוב דומה של צבירה בטיפול ב-EGFP ו-shams ב-RNA דו-גדילי

לאחר הכנת כל הריאגנטים, בדיקה זו היא פשוטה וניתנת לביצוע תוך מספר שעות.