Name: חלב מגבירה את הצמיחה של Enteroids: מודל לשעבר Vivo של התפשטות תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: למד שיטה לגידול אנטרואידים ממעי עכברים ניאונטליים לחקר השפעת חלב אם על התפשטות תאי מעי. מודל זה מסייע בחקירת מחלות מערכת העיכול כמו אנטרוקוליטיס נמקית בפגים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MG נתמך על ידי מענקים K08DK101608 ו- R03DK111473 חולים מכוני הבריאות הלאומיים, מרץ של מטבעות קרן מענק מס 5-FY17-79, הילדים גילוי מכון וושינגטון אוניברסיטת וילדים בסנט לואיס, המחלקה לרפואת ילדים בבית באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה, סנט לואיס. האירו נתמך על-ידי R01DK104946 (PI: סילברמן), סנט לואיס לילדים ואוניברסיטת גילוי מכון וושינגטון של הילדים החולים.

כל ההליכים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על-ידי גם אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס אכפת חיה מוסדיים, שימוש הוועדה (פרוטוקול 20160187) או טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת פיטסבורג, שימוש הוועדה (פרוטוקול 14103918). המעי הדק העובר האנושי-פחות מ 24 שבועות ההיריון הושג בהתאם להנחיות רכש באוניברסיטת פיטסבורג רקמות אנטומיים לאחר אישור ועדה מוסדית (פרוטוקול PRO14100537) מאוניברסיטת פיטסבורג בריאות מדעי בנק עור דרך מערכת מתווכת הוגנת. חלב אם אנושי בטל מזוהה או חלב מפוסטר התורם הושג עם ויתור על הסכמה מן האוניברסיטה של הועד המוסדי פיטסבורג.
1. קריפטה בידוד והקמת Enteroids עכברים Neonatal או המעי הדק האנושי מוקדמת
<ol><li>הכנה מדיה הערה: המדיה צריך להיות מוכן בשכונה ביום שלפני קריפטה בידוד.<ol>
<li>להכין 1.11 L תרבות המדיה. מתחילים עם 1 ליטר בינוני ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM) עם גלוקוז 4.5 g/L וגלוטמין ולהוסיף 110 מ ל סרום שור עוברית (FBS) (הריכוז הסופי 10%), 11 mL אינסולין סטרילי, פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%), ו- 1.1 mL (סופי בריכוז 0.1%).</li>
		<li>להכין תערובת PBS-אנטיביוטיקה 500 מ"ל. מתחילים עם 500 מ ל 1 x מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) עם 10% FBS ולהוסיף 5 מ"ל גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), 1 מ"ל המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%), ו- 5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%).</li>
		<li>הכנת 30 מ ל תא שיבוש התקשורת #1. להכין תחילה 30 מ ל תרבות המדיה. תוסיף 600 µL 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (הריכוז הסופי 10 מ מ), 300 µL גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), ו- 60 µL המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%).</li>
		<li>הכנת 30 מ ל תא שיבוש התקשורת #2. להכין תחילה 30 מ ל תרבות המדיה. להוסיף 300 EDTA 0.5 M µL (ריכוז סופי 5 מ מ), 300 µL גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), ו- 60 µL המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%).</li>
		<li>להכין 50 מ ל קריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה. למדוד 33.4 מ ל 1 x מתקדם DMEM/F-12 ולהוסיף 10 מ"ל FBS (ריכוז סופי 20%).<ol>
<li>להוסיף 500 µL פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%), 500 µL L-גלוטמין (ריכוז סופי 1%), 500 µL גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), 100 µL המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%), 2.5 µL N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane מ' 1 חומצה sulfonic (HEPES) (ריכוז סופי מ מ 0.05), 500 µL 100 מ מ N-אסטילסיסטיין (ריכוז סופי 1 מ מ), 500 µL 100 x N-2 תוספת 1 מ"ל 50 x תוספת ללא סרום (למשל, B-27) פחות ויטמין A, 500 µL 1 מ מ 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין 1 מ"ל קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה. קודם להכין 1 מ"ל של קריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה. להוסיף 2.5 µL 40 µg/mL Wnt3a (ריכוז סופי 100 ng/mL), 1 µL µg 100/mL הראש (ריכוז סופי 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (ריכוז סופי 500 ng/mL) ו- 0.5 µL 100 µg/mL EGF (ריכוז סופי 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>קריפטה בידוד
	<ol>
<li>המקום solubilized תמצית קרום המרתף (ראה טבלה של חומרים) על הקרח להפשיר לפני תחילתו. הערה: קרום המרתף לשמור על הקרח או שזה פולימריזציה.</li>
		<li>בהתאם בפרוטוקול אכפת לי חיה המוסדית והוועדה לשימוש עבור עכברים גדול מ- 14 ימים של גיל, המתת חסד עכברים עם שתי שיטות של המתת חסד עם השני להיות הליך פיזי כדי להבטיח מוות. הערה: עבור עכברים מתחת לגיל 14 ימים של גיל, עריפת ראש זה הליך רגיל באמצעות מספריים.</li>
		<li>בעזרת מלקחיים ומספריים, עושים חתך אנכי למטה האמצע של הבטן, דרך העור הצפק, עבור לכל אורכה של הבטן. בלו המעי הדק מהקיבה אל המעי עם מספריים ולהסיר את מצע המעי עם מלקחיים. הערה: בת שבוע שני זכר ונקבה C57BL/6J העכבר הגורים, כל גרם במשקל 5.5-7, שימשו לבידוד הקריפטה. ניתן להשתמש בכל גיל או גודל העכבר לבידוד הקריפטה.</li>
		<li>כדי להתכונן המעי הדק שנקטפו זה עתה קריפטה בידוד, מיקום המעי ישר, וחותכים את המעי longitudinally לכל אורכו באמצעות מספריים. הערה: העכבר והמעי האנושי ניתן להכין באופן דומה.</li>
		<li>שרפרף נקי מחוץ המעי ע י ניעור בעדינות המעי הלוך בצלוחית מלא PBS-אנטיביוטיקה תערובת באמצעות מלקחיים.</li>
		<li>להוסיף 30 מ של התא שיבוש התקשורת #1 צינור חרוטי 50 מ. לחתוך את המעי לחתיכות באורך 0.5 ס מ ישירות לתוך הצינור. הגדר את הצינורית בתוך דלי קרח, להתסיס בעדינות על שאכר במהירות הנמוכה ביותר למשך 15 דקות.</li>
		<li>בעוד הרקמות על ניעור, להשיג לוחות 24 או 48-טוב לגדול כוכים אם enteroids כדי לשמש עבור ה-RNA, דנ א או בידוד חלבון. שימוש שקופיות הקאמרית 8-טוב לגדול כוכים אם enteroids כדי לשמש עבור כל הר הדמיה קונפוקלי.</li>
		<li>בשכונה, להוסיף µL 15 של קרום המרתף כל הבאר של צלחת 24 או 48-ובכן. אם משתמש קאמרית שקופיות, להוסיף µL 9 של קרום המרתף לתחתית של כל תא. הערה: להתאים את עוצמת הקול של קרום המרתף בהתאם לגודל צלחת במידת הצורך.</li>
		<li>התפשטה במהירות קרום המרתף עם קצה פיפטה כך קרום המרתף יוצר שכבה דקה בתחתית הבאר. מקם את הצלחת ב 37 ° C בחממה במשך 30 דקות לאפשר קרום המרתף פולימריזציה. הערה: כוכים לא מייחסים אם קרום המרתף לא שכבה דקה או אם קרום המרתף מכיל בועות אוויר.</li>
		<li>לאחר 15 דקות על מטרף, לסנן את הרקמות דרך מסננת 100 מיקרומטר. למחוק את הזרימה.</li>
		<li>להוסיף 30 מ ל תא שיבוש התקשורת #2 צינור חרוטי 50 מ. הסרת רקמת מסננת ומוסיפים הצינור.</li>
		<li>הגדר את הצינורית בתוך דלי קרח, להתסיס בעדינות על שאכר במהירות הנמוכה ביותר למשך 15 דקות.</li>
		<li>לאחר 15 דקות על ניעור, לסנן רקמות דרך מסננת 100 מיקרומטר. תמשיך לזרום דרך בשלב זה, למקרה תשואה נמוכה בשלבים מאוחר יותר. הערה: כל זרימה דרך צינורות חייב להישמר בקירור.</li>
		<li>להוסיף 15 מ"ל DMEM עם גלוקוז 4.5 g/L וגלוטמין צינור חרוטי 50 מ. הסרת רקמת מסננת ומוסיפים הצינור. נמרצות לנער את הצינורית ביד עבור מסנן ס' 10 דרך מסננת 100 מיקרומטר ולאסוף את הזרימה. חזור עד הזרימה מכיל חלקיקים אין.</li>
		<li>בשכונה, לסנן את הזרימה מהשלב הקודם לתוך חדש 50 מ ל חרוט צינור באמצעות מיקרומטר 70 strainers העכבר רקמות או strainers 100 מיקרומטר עבור רקמה אנושית. הערה: יש נוספת strainers בכוננות, שופכים לאט כמו strainers יסתום עם פסולת.</li>
		<li>Centrifuge את הצינור ב- g 200 x עבור 8 דקות 4 ° C ובמקום ישירות בתוך דלי קרח בשכונה. להסיר את תגובת שיקוע בעזרת פיפטה מבלי להפריע בגדר. Resuspend גלולה עם הסכום הרצוי של קריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה. הערה: כוכים מועשר הם השכבה 'חולית' של בגדר. כל טוב דורשת 250 µL של קריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה.</li>
	</ol></li>
	<li>הקמת enteroids
	<ol>
<li>צלחת את התערובת התקשורת התת-קרקעי ישירות על קרום המרתף.</li>
		<li>בדוק כוכים עם מיקרוסקופ כדי להבטיח בתהליך בידוד היה מוצלח. הערה: כדורים של תאים והתאים הם הרצויה. כ-100 כוכים בודדים הם מצופה לכל טוב.</li>
		<li>דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות לאפשר כוכים לדבוק קרום המרתף. הערה: הדגירה הזה הוא עם הקריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה.</li>
		<li>אט-אט להסיר את התקשורת עודף כוכים נכשל לצרף באמצעות פיפטה P-200. הערה: נא לא להפריע קרום המרתף כפי יכול להפוך ניתק את כוכים המצורפת.</li>
		<li>לאט לאט להוסיף 250 µL של קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה כל טוב. הערה: עבור 24-, צלחות 48-ובכן, או חדר שקופיות, 250 µL של קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה מספיקה.</li>
		<li>להחליף את המדיה כל יומיים עם טרי קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה במשך 5 ימים לפני טיפולים כדי לאפשר החזקה אופטימלית וצמיחה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. העכבר השד חלב אוסף
<ol><li>להפריד סכר C57BL/6J מניקות לאחר לידה 7-12 ימים הגורים שלה במשך 6 שעות לפני חליבה.</li>
	<li>עזים ומתנגד הסכר מניקות עם איזופלוריין באמצעות קונוס האף ולפקח זריקה תת עורית של אוקסיטוצין-0.15 IU/ק"ג משקל גוף. להמתין 3 דקות לפני מנסה לחלוב את ההליך.</li>
	<li>לנקות עטינים עם 70% אתנול לפני חליבה הליך ותנו יבש.</li>
	<li>שואבים חלב עטינים של אחד בכל פעם באמצעות משאבת השד אנושי חשמלי עם צינורות סיליקון בגודל שיתאים עטינים של העכבר לתוך צינור אוסף 5 מ. הערה: משאבות לשדיים אופטימלי יש שתי הגדרות, עבור מהירות ועוד אחד בשביל שאיבה. עדיף להתחיל עם ההגדרות הנמוך של כל אחד ולהגדיל שניהם לאט עד החלב מופק. באופן אידיאלי, התשואה הכולל יהיה ~ µL 500 - 1 מ"ל חלב אם העכבר לכל סכר מניקות.</li>
	<li>חלב אם מיד aliquot וחנות ב-80 מעלות צלזיוס. הערה: להימנע ההקפאה/ההפשרה מחזורים.</li>
	<li>לטפל enteroids ביום 5 עם µL 50/מ"ל חלב אם העכבר לכל mL קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. כל הר צביעה של Enteroids
<ol><li>
הכנה של ריאגנטים
	<ol>
<li>להכין PBS 1 x 16 מ"ל לכל 8 בארות.</li>
		<li>להכין 2 מ ל 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS x 1 לכל 8 בארות.</li>
		<li>להכין 2 מ ל 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS לכל 8 בארות.</li>
		<li>להכין 24 mL PBS Tween (PBST הוא 0.1% Tween 20 x 1 ב PBS) לכל 8 בארות.</li>
		<li>להכין 2 מ ל 10% חמור נורמלית בסרום (NDS) ב- 0.1% PBST (10% NDS/PBST) לכל 8 בארות.</li>
		<li>להכין 4 מ ל 1% NDS ב- 0.1% PBST (1% NDS/PBST) לכל 8 בארות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת יום 1
	<ol>
<li>וארוקן את טיפולי ולשטוף enteroids עם PBS. הוסף 250 µL 4% מחברים לכל טוב. מניחים על מסובב עבור h 1-2-4 מעלות צלזיוס. להסיר 4% מחברים עם פיפטה.</li>
		<li>תשטוף 4 פעמים עם µL 250/1 טוב x PBS. מניחים על מסובב 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הערה: זה אפשרי לאחסון צלחת ימים 1-2-4 ° C, במידת הצורך.</li>
		<li>להוסיף 250 µL/טוב 0.1% טריטון X-100. תקופת דגירה של h 1 הסר RT. 0.1% טריטון X-100 עם פיפטה.</li>
		<li>תשטוף 4 פעמים עם µL 250/1 טוב x PBS. מניחים על מסובב למשך 15 דקות ב- RT.</li>
		<li>מוסיפים 250 µL/טוב 10% NDS/PBST. תקופת דגירה של 45 min-הסר RT. 10% NDS/PBST עם פיפטה.</li>
		<li>להוסיף 250 נוגדן ראשוני µL/טוב, מדולל 1/250 ב 1% NDS/PBST, וכן דגירה בין לילה ב 4 º C. הערה: דילול נוגדן האופטימלי משתנה בהתאם ליצרן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת יום 2
	<ol>
<li>רחץ לפחות 5 פעמים במשך 4-5 קמ"ש עם µL 250/PBST טוב. מניחים על מסובב ב 4 ° C בין כל כביסה.</li>
		<li>מוסיפים נוגדן µL/טוב משני 250, מדולל 1/1000 ב 1% NDS/PBST. לעטוף את הצלחת בנייר, דגירה בין לילה ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת יום 3
	<ol>
<li>להוסיף גרעיני µL/טוב 250 כתם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) למשך 15 דקות. הערה: להחזיק את הצלחת בחשכה.</li>
		<li>לשטוף 6 פעמים עם µL 250/PBST טוב. מניחים על מסובב 10 דקות ב 4 ° C בין כל כביסה.</li>
		<li>הר coverslip-הקאמרית שקופיות עם טעינת מדיה.</li>
		<li>תמונות עם 40 X מיקרוסקופ קונפוקלי אובייקטיבית ועיבוד באותה מידה בעורך גרפיקה רסטר (ראה טבלה של חומרים).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Patel, R. M., Denning, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+prebiotics%2C+probiotics%2C+and+postbiotics+to+prevent+necrotizing+enterocolitis%3A+what+is+the+current+evidence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?</a> Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).</li>
<li>Caplan, M. S., Jilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pediatr%22%5BJournal%5D)">New concepts in necrotizing enterocolitis.</a> Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).</li>
<li>Henry, M. C., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Necrotizing enterocolitis.</a> Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).</li>
<li>Lin, P. W., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17027734">Necrotising enterocolitis.</a> Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).</li>
<li>Neu, J., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Necrotizing enterocolitis.</a> N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).</li>
<li>Bartick, M., Reinhold, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+of+suboptimal+breastfeeding+in+the+United+States%3A+a+pediatric+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis.</a> Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).</li>
<li>Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+necrotizing+enterocolitis+on+length+of+stay+and+hospital+charges+in+very+low+birth+weight+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants.</a> Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).</li>
<li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li>
<li>Gribar, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+expression+and+signaling+of+TLR4+and+TLR9+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis.</a> J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).</li>
<li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+fluid+inhibits+Toll-like+receptor+4+signaling+in+the+fetal+and+neonatal+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).</li>
<li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk+protects+against+the+development+of+necrotizing+enterocolitis+through+inhibition+of+Toll-like+receptor+4+in+the+intestinal+epithelium+via+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).</li>
<li>Yazji, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TLR4+activation+impairs+intestinal+microcirculatory+perfusion+in+necrotizing+enterocolitis+via+eNOS-NO-nitrite+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).</li>
<li>Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+glutamine+supplemented+parenteral+nutrition+on+the+incidence+of+necrotizing+enterocolitis%2C+nosocomial+sepsis+and+length+of+hospital+stay+in+very+low+birth+weight+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Wieku+Rozwoj%22%5BJournal%5D)">Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants.</a> Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+decreases+lipopolysaccharide-induced+intestinal+inflammation+in+infant+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).</li>
<li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+milk+oligosaccharide+2%27-fucosyllactose+attenuates+the+severity+of+experimental+necrotising+enterocolitis+by+enhancing+mesenteric+perfusion+in+the+neonatal+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine.</a> Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).</li>
<li>Jantscher-Krenn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+milk+oligosaccharide+disialyllacto-N-tetraose+prevents+necrotising+enterocolitis+in+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats.</a> Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).</li>
<li>Akin, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+lactoferrin+to+prevent+nosocomial+sepsis+and+necrotizing+enterocolitis+of+premature+neonates+and+effect+on+T-regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells.</a> Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).</li>
<li>Amin, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+supplementation+prevents+necrotizing+enterocolitis+in+the+premature+infant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant.</a> J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).</li>
<li>Rodgers, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+milk+collection+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of milk collection in the rat.</a> Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).</li>
<li>DePeters, E. J., Hovey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+collecting+milk+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Methods for collecting milk from mice.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).</li>
<li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves%27+muntjac+deer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+Enteroids%3A+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection%2C+Host+Restriction%2C+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids%2FColonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Drummond, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroviruses+infect+human+enteroids+and+induce+antiviral+signaling+in+a+cell+lineage-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין מה לגלות שאין ניגודי אינטרסים.

האפיתל במעי מורכב יחוברו הסלולר רבים אחראים למתן מארח הגנה מפני פתוגנים, שמירה על שלמות מחסום המעיים, ואני יכול להפרץ בפתוגנזה של כמה מחלות. בעוד מודלים בעלי חיים יכולים לסכם כמה היבטים של המחלה, הדגם ex-vivo של enteroids נגזר מן המעי הדק בעכברים ובבני אדם מספק פלטפורמה כדי לבדוק את ההשפעות של טיפולים שונים. המשמעות של דגם enteroid מאפשר לחוקרים תרבות, להבדיל מעיים תאי גזע לתוך כל סוגי תאי אפיתל תמים או חולה בבעלי חיים ובבני אדם שאינם זמינים עם שיטות קיימות. מערכת מודל זה יכול לשמש עבור זיהומים עם פתוגנים אנושי ...

דלקת מעי נמקית (NEC) הוא הגורם המוביל למוות ממחלות במערכת העיכול אצל פגים, להשפיע על כמעט 1 ב 10 תינוקות שנולדו לפני 29 שבועות ההיריון1,2,3. חצי של התינוקות עם התקדמות NEC הצורה החמורה ביותר, איפה הישרדות 10-30% רק4,5. בארצות הברית, 2-3 מיליארד USD/שנה משוערת מושקעים בטיפול בתינוקות עם NEC6,7, עדיין לא שיעור ההישרדות ולא טיפול השתנה במשך 30 השנים האחרונות. בפתוגנזה של NEC מאופיין על ידי פגיעה במעיים, ליקויי הרירית המרפא8,9,10,11, עם זאת, המסלולים איתות המובילים החמירה תגובה דלקתית ומנגנונים כדי להפוך את הדלקת נשארים שהיישום מובן.
הממשל של חלב אם אנושי נמצאה להיות האסטרטגיה רק מגן נגד NEC בפגים. אנחנו הראו בעבר כי חלב אם מגן מפני התפתחות NEC באמצעות עיכוב של הקולטן אגרה דמוי קולטן החיסון מולדים 4 (TLR4) של האפיתל במעי באמצעות הקולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) איתות לשביל11. תוספת של חלב האם על נוסחת NEC ניסיוני attenuated את התגובה דלקתית אצל NEC כפי שמתואר על ידי עיכוב של אפופטוזיס enterocyte ושיקום של התפשטות enterocyte באופן הייתה תלויה גדילה עוריות פקטור (EGF) ו- EGFR11. במחקר אחר, זה הוצג כי טונות, רכיב אחר של חלב אם, תורמת טבעה מגן על ידי להתכוונן זלוף מעיים, לעומת פורמולה, אשר לוקה בחסר חנקתי, עשוי לתרום שכיחות מוגברת של NEC ב הנוסחה האכלת תינוקות12,13. תרכובות אחרות נוכח חלב אם הוכחו להיות מעורב ההגנה נגד NEC כוללים oligosaccharides חלב, L-ארגנין, גלוטמין, לקטופרין14,15,16, 17,18,19. רכיבים אלה מועילות של חלב האם לחשוף את נחיצות השימוש במניעה של NEC, אך גם להדגיש את החשיבות של לימוד המנגנון, איתות המסלולים ואפקטים הסלולר מעורבים כמה חלב היא תיווכה את ההגנה נגד NEC .
סדר כדי להמשיך לחקור תכונות ההגנה של חלב אם במודל של עכברים של NEC, פיתחנו שיטה חדשנית, קל לשימוש על ידי העכבר איזה חלב אם יכול להיות מופק של סכר anesthetized באמצעות חשמל בשד האנושי משאבת11,12 . אסטרטגיה זו של רכישת חלב אם העכבר הוא יתרון, לא רק כי הם השד אנושי משאבות זמינות ולא יעילה על הרכש של חלב אם, אלא גם כי שיטה זו מאפשרת ניתוח חלב השד ספציפית. כתוצאה מכך, אנו יכולים להשוות את ההשפעות של חלב אם העכבר עם אלה של חלב אם אנושי ביטוי כמו גם מפוסטר חלב האדם תורם מבנק חלב במודלים תלויי מין. טכניקה זו מאפשרת לצורך המחקר של רכיבי חלב השד ביחס התרומה שלהם כלפי מניעת NEC. חוקרים אחרים פיתחו שיטות שאיבת חלב השד, לעומת זאת, שיטות אלה נמצאים ידנית, מצריכים בדרך כלל אחד או יותר מעבדה חבר21,20,22. כאן מוצגת טכניקת קל זה יכול להיות מנוצל על ידי שינוי משאבה השד חשמלי אנושי לאסוף חלב מן העכבר. טכניקה זו ניתן להחיל גם למינים אחרים.
לחקור בצורה הולמת את איתות המסלולים מעורב עם NEC, דגם מערכות נדרשים להעריך את כל סוגי תאים שונים ידוע להיות מושפע מתהליך המחלה. כאן נדון אחד כזה מערכת מודל - enteroids - ואת הקמתן של העכבר והמעי הדק אנושי. Enteroids מעיים אנושיים (HIEs) לספק בפרט משמעותי ההבטחה, כי הם מציעים חדשני, מגוונת מבחינה גנטית שמחוץ האנושי מודל לסייע בחקר התהליכים הקשורים pathophysiological המתרחשים במערכת העיכול 23. Enteroids יש כבר מצאו להיות תרבותי לטווח ארוך שיכול להיות קפוא עבור שימוש מאוחר יותר23ו בניגוד האנושי Organoids מעיים (HIOs), אשר תרבויות מפותחות מתאי גזע inducible pluripotent, enteroids נוצרות מתאי גזע בתוך כוכים מעיים מבודד24. Enteroids דורשים תחזוקה פחותה, יכול להיות נגוע במהירות25, ניתן ליצור בקלות מאז כוכים מעיים מובדלים יותר מאשר HIOs23. לכן, HIEs מציעים יתרונות רבים על פני שיטות קיימות כי לפיתוח שהפגינו ספציפיים לאזור ההלחנה ופונקציונליים מאפייני האפיתל אנוש במערכת העיכול23. השימוש enteroids הוא בחירה יעילה ביותר כאשר צריך מודל אנושי של המעי, עם הדבקות ספציפיים לאזור מגבלות וחוסר נוחות השימוש. כאן אנחנו מדגימים את הטכניקה של בידוד ושמירה על ראשי נגזר תאי גזע קטן המעי enteroids עכברים, בפגים אנושי.

<table><tbody><tr><td>מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז ו-L-גלוטמין</td><td>לונזה</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (אינסולין)</td><td>Eli Lilly and Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco ( DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x מתקדם DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 מ"מ L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-הידרוקסיאתיל פיפרזין-N-2-אתאן חומצה סולפונית (HEPES)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל-ציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 תוסף</td><td>תזונה Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 תוסף מינוס ויטמין A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x מעכב ROCK Y-27632, דיהידרוכלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי Wnt3a חלבון</td><td>R& D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>עכבר Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי R-Spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס עכברי רקומביננטי (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה מטריג'ל מופחת מטריצת קרום מרתף</td><td>356231</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 מ"מ תרבית תאים צלחת פטרי</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 24 בארות</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>תא 48 בארות צלחת תרבות</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8 בארות Nunc Lab-Tek II מערכת שקופיות קאמרית</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>קורנינג</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; מסננת תאים סטרילית M</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; מסננת תאים סטרילית</td><td>M פישר סיינטיפיק</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x מי מלח חוצץ פוספט (PBS), pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד (PFA)</td> <td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>חמור רגיל סרום (NDS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ זכוכית</td><td>פישר מדעי</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1.5 אינץ 'מחט</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>אוקסיטוצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>משאבת חלב חשמלית כפולה אנושית</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מבחנה תחתונה עגולה</td><td>קורנינג</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>פקקי גומי</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>פריימר Mki67 אנושי F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'טכנולוגיות</td> <td>DNA משולבות</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

חלב מגבירה את הצמיחה של enteroids: מודל לשעבר vivo של התפשטות תאים

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

אדם קטן enteroids מעיים הם נגזרת של כוכים ומכילים כאשר גדל בגומחת תאי גזע כל סוגי תאים אפיתל. ויכולת ליצור אנושי enteroid ex-vivo תרבות מערכות חשובות פתופסיולוגיה מעיים דגם וכדי ללמוד את התגובות הסלולר מסוים מעורב. בשנים האחרונות, enteroids מן בעכברים ובבני אדם להיות מתורבתים, passaged, שהופקד משם לשימוש עתידי במעבדות מספר ברחבי העולם. הפלטפורמה enteroid יכול לשמש כדי לבדוק את ההשפעות של טיפולים ותרופות שונות ואת מה ההשפעות הן המופעל על סוגי תאים שונים במעי. . הנה, פרוטוקול להקמת העיקרי נגזר תאי גזע קטן המעי enteroids נגזר עכברים neonatal, מוקדמת במעי האדם הינו מסופק. יתר על כן, מערכת תרבות זו enteroid היה מנוצל כדי לבחון את ההשפעה של חלב אם ספציפית. חלב אם העכבר ניתן להשיג ביעילות באמצעות משאבה בשד האנושי שונה, ניתן להשתמש בעכבר ביטוי חלב לניסויים מחקר נוסף. כעת נדגים את ההשפעות של העכבר ביטוי, אנושי, התורם חלב על הגדילה ועל התפשטות enteroids נגזר neonatal עכברים או המעי הדק האנושי מוקדמת.

תחילה חיפשנו לחקור אם הביע האדם חלב או חלב מפוסטר התורם היה השפעה על enteroids במעיים קטן. אכן, חלב אם אנושי, התורם חלב מוגברת הצמיחה של העכבר neonatal (איור 1 א'), enteroids מוקדמת האדם נגזרת (איור 1B).
מאז חלב אם אנושי מוגברת הצמיחה של קטן enteroids מעיים, הבא חקרנו אם חלב אם הייתה השפעה על ההתפשטות של enteroids האנושי מוקדמת. נדגים כי חלב אם אנושי מגביר את התפשטות מו...

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מערכת התרבות enteroid העכבר neonatal או מוקדמת במעי האדם, כמו גם שיטה יעילה כדי לאסוף חלב עכברים.

חלב מגבירה את הצמיחה של Enteroids: מודל לשעבר Vivo של התפשטות תאים

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתרבית מעיים מיניאטוריים, הנקראים אנטרואידים, במעבדה. אנטרואידים מטופלים בחלב אם עכברים המופק במעבדה כדי להבהיר את השפעות חלב אם על התפשטות במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות למחלות שונות במערכת העיכול, כגון דלקת מעיים נמקית, הפוגעת בפגים.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנטרואידים דורשים תחזוקה מועטה, ניתן להקים אותם במהירות ומציגים רבות מהתכונות הפונקציונליות של אפיתל מערכת העיכול. טכניקה זו של הקמת אנטרואידים היא מודל יעיל ביותר של המעי הדק האנושי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה על המעי הדק, ניתן ליישם אותה גם על מערכות איברים אחרות באזורים אחרים של מערכת העיכול.כדי להתחיל, יש להפשיר תמצית קרום בסיס מסיס על קרח. לאחר מכן, השתמש במספריים ובמלקחיים כדי לבצע חתך אנכי לאורך כל קו האמצע של הבטן של עכבר שהורדם. בעזרת מלקחיים כורתים את המעי הדק ומסירים את המזנטריה.כדי להכין את המעי הדק לבידוד קריפטה ויצירת אנטרואיד, מקם את המעי ישר והשתמש במספריים כדי לחתוך לאורך לכל אורכו. הסר כל צואה על ידי ניעור עדין של המעי בעזרת מלקחיים בצלחת פטרי מלאה בתערובת אנטיביוטיקה PBS. לאחר מכן, הוסף 30 מיליליטר של מדיית שיבוש תאים מספר אחת לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.הכניסו קטעי מעי של חצי סנטימטר לתוך הצינור והכניסו את הצינור לדלי קרח על שייקר. במכסה המנוע, הוסף 9 מיקרוליטר של קרום מרתף לתחתית כל באר בשקופית תא של שמונה בארות. מורחים במהירות את הממברנה עם קצה פיפטה ומאפשרים לקרום המרתף להתפלמר בחממה.חשוב לפזר במהירות את קרום המרתף כך שתיצור שכבה דקה בתחתית הבאר. הקריפטות לא יתחברו אם יש בועות אוויר או אם קרום המרתף עבה מדי. לאחר ערבוב הצינור החרוטי, השתמש במסננת של 100 מיקרומטר כדי לסנן את רקמת הממברנה ולהשליך את הזרימה.הוסף 30 מיליליטר של חומר הפרעה לתאים מספר שתיים לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר, ולאחר מכן, הוסף את רקמת המעי לצינור. לאחר ערבוב הצינור למשך 15 דקות, סנן את הרקמה דרך מסננת של 100 מיקרומטר. שמור על הזרימה משלב זה.הוסף 15 מיליליטר TMEM עם 4.5 גרם לליטר גלוקוז ו-L-גלוטמין לצינור חרוטי חדש. הסר רקמה ממסננת 100 מיקרומטר והוסף אותה לצינור החרוטי החדש. לאחר מכן, נער ידנית את הצינור למשך 10 שניות וסנן דרך מסננת של 100 מיקרומטר.במכסה המנוע, השתמש במסננת של 70 מיקרומטר כדי לסנן את הרקמה לצינור חרוטי חדש. לאחר צנטריפוגה של הצינור למשך 8 דקות, הניחו אותו בדלי קרח במכסה המנוע. השתמש בפיפטה כדי להסיר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור שנוצר.השעו מחדש את הגלולה עם כמות מתאימה של אמצעי תרבית קריפטה ללא גורמי גדילה. לאחר הדגירה של מגלשת החדר למשך 30 דקות, צלחו את תערובת הקריפטה ישירות על קרום המרתף ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות בזמן שהקריפטות נדבקות. לאחר תקופת הדגירה, השתמש בפיפטה P200 כדי להסיר בזהירות כל מדיה וקריפטות לא מחוברות.צעד קריטי נוסף הוא להקפיד להסיר לאט את המדיה ואת הקריפטות העודפות שלא הצליחו להתחבר באמצעות פיפטה P200. אל תפריע לקרום המרתף, מכיוון שהקריפטות המצורפות עלולות להיעקר. הוסף לאט לאט 250 מיקרוליטר של אמצעי תרבית קריפטה עם גורמי גדילה לכל באר.להרדים סכר הנקה עם איזופלורן המועבר דרך חרוט האף ולתת את המינון המתאים של אוקסיטוצין תת עורי. נקו פטמות עם 70% אתנול והניחו להן להתייבש לפני תחילת הליך החליבה. באמצעות משאבת חלב אנושית חשמלית המצוידת בצינורות סיליקון בגודל המתאים לעכברים וצינור של 5 מיליליטר, הוציאו חלב מהפטמות אחת בכל פעם.לבסוף, יש להוציא את החלב מיד ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. טפל באנטרואידים ביום החמישי בחלב אם עכבר מאוחסן למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ביום הראשון של הצביעה, השתמש ב-PBS כדי להסיר טיפולים ניסיוניים ולשטוף את האנטרואידים.הוסף 250 מיקרוליטר של 4% PFA לכל באר והנח את השקופית על מסובב למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השתמש בפיפטה כדי להסיר את ה-PFA ולאחר מכן שטוף בעדינות כל באר ארבע פעמים עם 250 מיקרוליטר PBS. הנח את שקופית החדר על מסובב למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.הוסף 250 מיקרוליטר של 0.1% טריטון X-100 לכל באר ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הסר את הטריטון X-100 בעזרת פיפטה ושטוף ארבע פעמים עם 250 מיקרוליטר PBS בכל באר. הנח את השקופית על מסובב למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.מוסיפים 250 מיקרוליטר של 10% NDS/PBST לכל באר ומדגרים במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הסר את ה-NDS/PBST בעזרת פיפטה. לבסוף, הוסיפו 250 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל לכל באר ודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.ביום השני של הצביעה, יש לשטוף כל באר לפחות חמש פעמים עם 250 מיקרוליטר PBST ולהניח את השקופית על מסובב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בין כל שטיפה. הוסף 250 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל ב-1% NDS/PBST לכל באר. עוטפים את השקופית בנייר כסף ודוגרים למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס.ביום האחרון של הצביעה, הוסף 250 מיקרוליטר של DAPI מוכתם גרעיני לכל באר והניח לו לשבת במשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו כל באר שש פעמים עם 250 מיקרוליטר PBST. הנח את השקופית על מסובב למשך 10 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס בין כל שטיפה.לבסוף, הכן את השקופית להדמיה מיקרוסקופית על ידי הרכבת החלקת כיסוי על מגלשת התא עם אמצעי הרכבה ואפשר לה להתייבש במשך 24 שעות. במחקר זה, אנטרואידים במעי הדק שמקורם בעכברים יילודים טופלו בחלב אם שנאסף מעכברים מניקות. כפי שמוצג באיור זה, חלב אם עכבר הגביר את התפשטות האנטרואידים של העכברים.כדי לחקור את ההשפעות הספציפיות למין של חלב אם, חלב אם אנושי וחלב אם תורם מפוסטר יושמו גם על האנטרואידים של העכברים. כפי שמוצג באיור זה, חלב אם מתורם אנושי ומפוסטר הגביר את התפשטות האנטרואידים של העכברים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על הקריפטה על הקרח במהלך שלבי הבידוד.בצע לאט ובעדינות את כל השיטות לאחר שהאנטרואידים נמצאים בתרבית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טיפולים בתאי חיסון, מיקרוביוטה או תרופות שונות על מנת לענות על שאלות נוספות כדי לסכם טוב יותר את המיקרו-סביבה של המעי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבית, לטפל ולבצע אימונופלואורסצנציה על האנטרואידים.בנוסף, אתה אמור להיות מסוגל לחלץ ביעילות חלב אם מעכבר מניק. אל תשכח שעבודה עם רקמות אנושיות ונוזלי גוף עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש ללבוש ציוד מגן אישי בזמן ביצוע הליכים אלה.

breast-milk-enhances-growth-enteroids-an-ex-vivo-model-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

אנו מתארים שיטה להקמת אנטרואידים אנושיים מקריפטות מעי דק וקולונואידים מקריפטות המעי הגס שנאספו הן מרקמות כירורגיות והן מביופסיות. במאמר מתודולוגי זה, אנו מציגים את אופני התרבות החיוניים לצמיחה ותחזוקה מוצלחת של אנטרואידים וקולונואידים אנושיים.

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

Enteroids מתגלים כמודל הרומן במחקר של מחלות אנושיות. הפרוטוקול מתאר כיצד לדמות מודל enteroid של האדם enterocolitis נפאסיאטיס באמצעות טיפול ליפופוליסכריד (LPS) enteroids שנוצר מרקמות neonatal. Enteroids שנאספו להדגים שינויים דלקתיים דומה לאלה לראות enterocolitis נפאסיאטיס אנושי.

הרומן האנושי אפיתל Enteroid דגם של דלקת מעי נמקית

אורגנואידים פיתח מבלוטות החלב של העכבר היו לקרינה מאופיין להעריך תכונות אפיתל ואינטראקציות עם תאים חיסוניים. ניתן להשתמש באורגנואידים הניתנים לקרינה כדי להעריך טוב יותר את האינטראקציות של תאי התא שעלולות להוביל לגיוס תאי גידול ברקמה נורמלית שניתן לקרינה.

צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקות מעבר היניקה-to-הגמילה בתוך מבחנה באמצעות העכבר מאוחר מעיים של המעי העוברי תרבותי במשך 30 ימים.

באמצעות אורגנואידים של המעי העוברי

הפרוטוקול המוצג משתמש cy, לנסות לכמת את מספר התאים מתרבים ומתים בתוך העכבר התרבותי enteroids. שיטה זו שימושית להערכת ההשפעות של טיפול תרופתי בשגשוג והישרדות של אורגנואיד.

קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids

בלוטת החלב היא מבנה מחודד, המורכב מיואפיתל חיצוני ותאי אפיתל הפנים הפנימיים. המוצג הוא פרוטוקול להכין אורגנואידים. באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית שיטה יעילה זו מאפשרת לחוקרים לטפל באופן נפרד בשני סוגי תאים אלה כדי לחקור שאלות הנוגעות לתפקידם בצורת בלוטת החלב ובתפקוד.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

המטרה של פרוטוקול זה היא ישירות bioprint תאי אפיתל השד כמו כדוריות רב תאיות על רשתות אנדותל שנוצרו מראש כדי ליצור במהירות מודלים 3D השד אנדותל שיתוף תרבות אשר ניתן להשתמש בהם עבור מחקרים הקרנת סמים.

הדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידי שד רב-תאיים תלת-תאיים ברשתות אנדותל

הצלבה בין תאי אפיתל חלביים לתאי אנדותל תורמת חשובה להתקדמות סרטן השד, לצמיחת הגידול ולגרורות. במחקר זה, כדוריות נעשו מתאי סרטן השד יחד עם תאי אנדותל כלי דם ו/או לימפתיים ולהדגים את ישימותם כמערכת במבחנה לחקר סרטן השד.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

פרוטוקול זה מתאר מודל אנטרוקוליטיס נמקית (NEC)-בצלחת המשתמש באנטרוואידים של המעי הדק עם קוטביות הפוכה, ומאפשר גישה למשטח האפיקלי. אנו מספקים פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה אפיתליאלית הקשורה ל- NEC ושיטה לקביעת הכדאיות של אנטרואידים אפיקליים הנתונים לפרוטוקול NEC-in-a-dish.

במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית

פרוטוקול זה מפרט את התבססותם של אנטרואידים, מודל מעיים תלת-ממדי, מרקמת המעי העוברית. הדמיה אימונופלואורסצנטית של סמנים ביולוגיים אפיתליאליים שימשה לאפיון מודלים. חשיפה אפית של ליפופוליסכרידים, אנדוטוקסין חיידקי, באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה המושרה חדירות אפיתל באופן תלוי מינון שנמדד על ידי דליפה של דקסטרן פלואורסצנטי.

בדיקת חדירות אפיתל באנטרוידים שמקורם ברקמות עובריות

המחקר הנוכחי מדווח על פרוטוקול קל יותר, חוסך זמן וחסכוני לבידוד וגידול יעיל של תאי אפיתל חלב אנושיים ראשוניים (HMECs) מכמויות קטנות של רקמת חלב. פרוטוקול זה מתאים לייצור מהיר של HMECs ראשוניים הן ליישומים מעבדתיים והן ליישומים קליניים.

בידוד ותרבית של תאי אפיתל ראשוניים של חלב אנושי

למד שיטה לגידול אנטרואידים ממעי עכברים ניאונטליים לחקר השפעת חלב אם על התפשטות תאי מעי. מודל זה מסייע בחקירת מחלות מערכת העיכול כמו אנטרוקוליטיס נמקית בפגים.

חלב מגבירה את הצמיחה של Enteroids: מודל לשעבר Vivo של התפשטות תאים

גלה סרטונים נוספים