Name: ברזולוציה גבוהה אמצעי הדמיה של נוירונים על ידי שימוש של זריחה החרגה שיטה והתקנים Microfluidic ייעודי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למד שיטת הדמיה ברזולוציה גבוהה לנוירונים תוך שימוש בשבב PDMS מיקרופלואידי ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקה זו מאפשרת מדידת נפח תת-מיקרומטרי של נויטריטים ומבנים דינמיים בצמיחה נוירונלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רצתה להכיר ChiLab, חומרים, מיקרוסיסטמס מעבדה - פוליטקניקו di טורינו - DISAT, בדמותו של פרופסור C F Pirri, ד ר מ' Cocuzza, ד ר Marasso L S, על תמיכתם יקר ב תהליך פיתוח, ייצור המכשיר. אנו מודים ויקטור ראסין מ Quantacell לדיונים ותמיכה בעיבוד תמונה. אנו אסירי תודה איזבל Grandjean, מאנון Chartier מהמתקן חיה ובמכון קירי על תמיכתם של עכברים, ואת פבלו וורגאס לנון אנה-מריה (ובמכון קירי) סיפק לנו העכברים GFP LifeAct. אנו מודים על אוליבייה Thouvenin אינסטיטוט Langevin ו Cadart קלוטיד, לריסה Venkova, מתיו פיעל מ ובמכון קירי - UMR 144, על עזרתם בהבנה של הדרה פלורסצנטיות בשיטה. לבסוף, אנו מודים הפלטפורמה הטכנולוגית של אינסטיטוט פייר-ז'יל דה-ז'אן (CNRS הפותר המתמטי 3750) על תמיכתם במיקרו-מלאכותית. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי אירופה מחקר המועצה מתקדם מענק מס 321107 "צ'לו", אוניברסיטת PSL (פרוייקט SwithNeuroTrails), d'Avenir ANR Investissement, ואת IPGG Labex Equipex.

<ol><li>Jun, S., Taheri-Araghi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-size+maintenance%3A+universal+strategy+revealed%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell-size maintenance: universal strategy revealed.</a> Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).</li>
<li>Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+volume+and+mass+measurements+show+that+mammalian+cells+swell+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis.</a> J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).</li>
<li>Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanical+spike+accompanies+the+action+potential+in+Mammalian+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals.</a> Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).</li>
<li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Hypertrophy+in+Asymptomatic+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).</li>
<li>Cheli, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+Deletion+of+the+L-Type+Calcium+Channel+Cav1.+2+in+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+Affects+Postnatal+Myelination+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice.</a> J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).</li>
<li>Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+semi-quantitative+measurements+of+axonal+degeneration+in+tissue+and+primary+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures.</a> J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).</li>
<li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li>
<li>Aguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+dynamics+of+dividing+cells+imaged+by+lattice+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).</li>
<li>Roland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid-induced+actomyosin+contractility+shapes+neuronal+morphology+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li>
<li>Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+impedance+flow+cytometry+enabling+high-throughput+single-cell+electrical+property+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization.</a> Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).</li>
<li>Bottier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+measurement+of+the+height+and+volume+of+migrating+cells+by+a+novel+fluorescence+microscopy+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique.</a> Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).</li>
<li>Cadart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+eXclusion+Measurement+of+volume+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells.</a> Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).</li>
<li>Marasso, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/2053-1591/3/6/065001/pdf">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001(2016).</li>
<li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167931706000670">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li>
<li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Götz, J., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+support+cultures+of+hippocampal+and+substantia+nigra+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).</li>
<li>abcam. Counting cells using a hemocytometer. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2017).</li>
<li>ImageJ. Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/Image_Intensity_Processing">https://imagej.net/Image_Intensity_Processing</a> (2017).</li>
<li>ImageJ. 19. Tools. ImageJ User Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html ">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html </a> (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

אמצעי הדמיה של נוירונים, מהווה אתגר עבור הטכניקה FXm עקב בהרחבות ארוכים ודקים של תאים אלה. פרוטוקול זה מתאר גרסאות של אותו סוג של מכשיר microfluidic המוקדש נוירון הדמיה.
לצד ההיבטים של עיצוב microfluidic, הבחירה של המטרה הבסיסית עבור הדמיה הדרה פלורסצנטיות, מרמז על פשרה בין רוחבי ברזולוציה ובהירות תמונה. הוכח 13 כי נה גבוהה מוביל לעומק של המוקד קטן יותר מאשר הגובה קאמרית איננה מזיקה על הדיוק של מדידת נפח אם דימות בוצע לעבר המוקד ואם שוליים מספיק שנשאר בין קו המתאר של העצם של אני nterest, את גבולות השטח אינטגרציה. עם זאת, השימוש תא גבוהה בהרבה מזו העומק של המוקד פוגע בהירות התמונה עקב פוטון דיפוזיה, אשר מחליק קצוות האובייקטים של ריבית. הזיוף של תא מיקרומטר 3 גבוהה מופחתת טשטוש לרוחב וסיפק תמונות הדרה פלורסנט מוגדרת בצורה יוצאת דופן היטב אפילו באמצעות נה גבוהה (0.8) 40 X מטרות כדי להמחיש סניפים עצביים עם רזולוציה גבוהה לרוחב.
שבב בהרכבת הוא שלב קריטי, במיוחד במקרה של 3 מיקרומטר גבוהה צ'יימברס, אך זהיר מניפולציה כפי שמתואר 4.1.2 ימנע קריסת הגג. פני השטח גבוהה יחס נפח הקשורים ללשכה דק אלה העלה גם את סוגיית יציבות לתוספי ריכוז לאורך זמן. אנחנו בדקנו כי ספיגת לתוספי השטח אחרי לילה אחד של דגירה היה זניח: לאחר החלפת לתוספי על ידי PBS, ההבדל בעוצמה בין העמוד ואת הרקע היה כ 1 לכל 1000 של הניגוד העוצמה הראשונית בין שני אזורים אלה בנוכחות לתוספי. שימו לב כי נוירונים עשויים לדבוק על coverslip התחתון, וגם על הגג PDMS. אפקט זה נעלמת כאשר שימוש בדוגמת coverslips (כלומר כאשר אנו לא דגירה דבק מולקולות בתוך תא PDMS), הציפוי הוא לכן בקפדנות מקומי על החלק התחתון של החדר.
מלבד שלהם מורפולוגיה מאתגר, נוירונים הם די מתאימה כדי FXm בשל העובדה כי אחד המגבלה העיקרית של השיטה, כלומר לתוספי אנדוציטוזה, הוא מוגבל מאוד בתאים אלה. בחרנו 10 kDa ניסוח לדכא בטווח הארוך טווח (בשעות) כל התופעות אנדוציטוזה גלוי.
לסיכום, הפשטות הרעיוני של FXm מאוזנת על ידי קבוצת בעיות ניסיוני אשר נפתרו על ידי פרוטוקול הנוכחי, כגון החספוס PDMS nanometric, גובה קאמרית מיקרומטר, או רקע תיקון לתיקון לא שווה של התקרה PDMS בין העמודים. עם זאת, השימוש תא microfluidic קרוב להגבלת המדיום פלורסנט מניב מספר אילוצים ייחודיים כמו הצורך של עמודי תמיכה, אשר מוריד את השטח יעיל זמין עבור אדהזיה התא, או הצורך לשלול סומא המרכזי תא להתבונן הרחבות עצביים עם הבהירות הגבוהה, אשר מגביל את האזורים של התא נגיש תצפית ברזולוציה גבוהה. אבולוציה אפשרית אחת של שיטה זו יהיה להיפטר ההסגר הפיזי הזה, והוחלף על ידי. אדם אופטי. פיתוח חדש של מיקרוסקופ אור גיליון יכול להיות משולב ביתרון עם FXm בעתיד.

הידע המדויק של תאי האחסון משכה תשומת לב מוגברת בשנים האחרונות, מונע על ידי הנושא של הומאוסטזיס גודל תא מיקרואורגניזמים חד תאיות 1 , באופן כללי יותר תאים mitotic 2. אולם, השאלה של נפח התאים הוא רלוונטי גם עבור תאים mitotic פוסט, שעבורו נוירונים מהווים דוגמה פרדיגמטי.
נפח הוא אכן חתימה חשוב של אירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים סולמות שונים, בזמן נקודות בחיים עצביים, מ ארעית דפורמציה עצב משויך (סולם אלפיות השנייה) פעילות חשמלית 3 בלתי הפיך עצביים נפיחות המתרחשים במהלך השלב ללא תסמינים של ניווניות מחלות (השנים אצל בני אדם) 4. עם זאת, השינוי הגדול ביותר של אמצעי האחסון מתרחשת סרגל זמן ביניים של ימים או שבועות (תלוי האורגניזם נחשב) במהלך צמיחה עצביים. המורפולוגיה מורחבת ומורכבת של נוירונים מעלה בעיות כפולות, ביניהם ברגולציה של גודל התא. קוטר לאורכה עצב הם אכן בחוזקה מוסדר ויוו, עם ערכים ספציפיים לכל סוג עצביים 5,6.
סוגיות אלה, מורכבים כדי לטפל ויוו, ניתן לטפל גם באופן פשוט במבחנה. את השאיפה הזאת, שיטה המוקדש אמצעי מדידה מהר מספיק כדי לעקוב אחר הצמיחה דינמיקה (קרי בקנה מידה זמן של דקות) ועומד בקנה אחד עם תצפיות במשך שעות או ימים נדרש. מספר שיטות פותחו במהלך השנים כדי לספק גישה ישירה או עקיפה נפח סלולר בתוך חוץ גופית. תא שחזור של הדמיה קונאפוקלית הוא אחד מהם, אך לשיטה זו תהיה תיוג ו חוזרות חשיפות לאור תוך כדי הצגת רזולוציה צירית המוגבלת של ננומטר בערך 500 7. הערה מחסרונות האחרון שני אלה הם להתגבר חלקית על ידי שיטה מתוחכמת יותר, לאחרונה בשם סריג מיקרוסקופ אור-גיליון 8. מיקרוסקופ כוח אטומי כבר בשימוש 9 אבל זו שיטה סריקה היא תמצית מייגעת ואיטית. יתר על כן, הקשר גופניות שזה דורש עם התא עלול להפריע המדידה בהתחשב רכות קיצוני של נוירונים 10. יש כבר מועסקים שיטה עקיפה באמצעות אימפדנס או תהודה 11סוגי תאים שונים, אך לא מתאימות עבור מורחבות תאים דבק כמו נוירונים.
באחת השיטות המבטיחים ביותר מבוססת על מדידה של נפח אי-כלילה של תאים בתוך תא סגור מלא של הפלורסנט. שיטת אי-הכללה של קרינה פלואורסצנטית (FXm) היא פשוטה בעקרון שלו כפי שהוא דורש אין תיוג, מתאים הדמיה אופטית מהירה לטווח הארוך של אוכלוסיות תאים עם רזולוציה צירית פוטנציאל אופטי תת. ליתר דיוק, רזולוציית ב- z תלוי עוצמת קרינה פלואורסצנטית המרבית בחדר תרבות (כלומר באזור ללא תאים) מחולק הטווח הדינמי של המצלמה, למרות מספר מקורות רעש להגביל החלטה זו האולטימטיבי. שיטה זו כבר חזק מאוד לעקוב אחר כמות תאים חסיד נודדים 12 או ללמוד שינוי אמצעי במהלך מיטוזה בתרבית של תאים, כפי שמתואר באופן יסודי 13. עם זאת, נוירונים מהווה אתגר מתודולוגיים FXm בהתחשב שלהם השלכה נרחב לתוך תהליכים תת מיקרומטר.
אנו מציגים כאן שיטה המוביל הזיוף של צ'יימברס FXm חלקה כדי לגשת עם ברמת דיוק גבוהה עוצמת הקול וגובה של ענפים עצביים ומבנים דינמי מעורב צמיחה עצביים כמו קונוסים צמיחה.
צ'יימברס צריך לגבהים דומים יותר מהאובייקט למדוד כדי לייעל רזולוציה צירית. לכן, תיכננו התקנים FXm שונים, המאופיינת על ידי תאי המדידה המרכזי שלושה בגבהים שונים. הדק (3 מיקרומטר בגובה) מוקדש neurite מידה: גובה נמוך זה לא כולל סומא, שנשארים בתא ליד 15 מיקרומטר גבוהה ביניים. צ'יימברס מרכזי עבה (10 ו 12 מיקרומטר) גבוהים מספיק כדי לעקוב אחר הגידול התא כולו. המכשיר כולל גם שני מאגרים ממוקם משני צידי החדר המרכזי. הזרקת ארבעה חורים (IH) ובכך מיושמים, הן מוגדרות כדלקמן: כניסת ולשקע לשרת להציג את המתלים הסלולר לתוך השבב, ואילו שני האחרים להאכיל המאגרים.
. יש לנו הראשון coverslips כיול מפוברק למדידות גובה באמצעות מבנים photoresist של הגיאומטריה ידוע... לנו יש ואז צילמו נוירונים גדל ללא תשלום, אך גם מורפולוגית מאולצות נוירונים לתוך micropatterns של הידבקות.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת פלזמלב 100</td><td>מכשירי</td><td></td> אוקספורד <td>לביצוע</td></tr><tr><td>יישור מסכה DRIE MJB4</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td>SU-8 פוטוליתוגרפיה</td></tr><tr><td>NXQ 4006 יישור מסכה</td><td>Neutronix Quintel</td><td></td><td>פוטוליתוגרפיה הקשורה</td></tr><tr><td>למנקה פלזמה</td> DRIE <td>Diener אלקטרוני</td><td>קולט אדים לתרבית תאים Pico PCCE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ADS Laminaire</td><td>Optimale 12</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור 37 & מעלות; C 5% CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 אינקובטור</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>PDMS תנור בין 65 ל-80 מעלות; C</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרופילומטר מכני</td><td>Veeco</td><td>Dektak 6M Stylus Profiler</td><td></td></tr><tr><td>פרופיל אופטי</td><td>Veeco</td><td>Wyko NT9100</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ואקום</td><td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td> <td>230KAR</td><td>קוטר 200 מ"מ</td></tr><tr><td>סוניקטור אמבטיה אולטרסאונד</td><td>Labo Moderne</td><td>SHE1000</td><td>נפח האמבטיה: 0.8 ליטר</td></tr><tr><td>פלטה חמה</td><td>סטיוארט SD162</td><td>SD162</td><td></td></tr><tr><td><מסכות חזקות></חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRIE</td><td></td><td></td><td>נתונים משלימים</td></tr><tr><td>מסכת Su8 1</td><td></td><td></td><td>נתונים משלימים</td></tr><tr><td>מסכת Su8 2</td><td></td><td></td><td>נתונים משלימים</td></tr><tr><td>מסכת Su8 3</td><td></td><td></td> נתונים <td>משלימים</td></tr><tr><td>כיול S1805 פסים</td><td></td><td></td><td>נתונים משלימים</td></tr> <tr><td><חזק>ציוד מעבדה קטן</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"מ מנקב חורים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002519 (התייחסות לארה"ב)</td><td></td></tr><tr><td>אזמל או סכין</td><td></td><td></td><td></td>גילוח</tr><tr><td>9 אינץ' מרית שטוחה מנירוסטה עם כפית</td><td>VWR International</td><td>82027-532</td><td>לביטול PDMS</td></tr><tr><td>טיפול בפרוסות שפתיים עליונות</td><td>VWR International</td><td>63042-096</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מעוקלת</td><td>FST</td><td>Dumont #7 מלקחיים - סטנדרטי / Dumoxel</td><td>למניפולציה של כיסויי זכוכית</td></tr> <tr><td><חזקים>מצעים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיליקון פרולוג</td><td>סמיקור בע"</td>מ <td></td><td></td></tr><tr><td>24x24 מ"מ כיסויי זכוכית</td><td>VWR</td><td>631-0127</td><td></td></tr><tr><td><חזק>פוטו-רזיסטים ומפתחים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518 פוזיטיב פוטורסיסט</td><td>מיקרוכימיקלים GmbH</td><td></td><td>לפני תהליך DRIE, עבה 1.8 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>AZ 351B מפתח</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>לפיתוח חיובי AZ 1518 פוטו-רזיסט</td></tr><tr><td>SU-8 2007</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PGMA מפתח</td><td>טכניקה</td><td></td><td>לפיתוח פוטו-רזיסט שלילי SU-8</td></tr><tr><td>Microposit S1805 התנגדות</td><td>כימיה שירותים טכניים</td><td></td><td>פוטו-רזיסט חיובי המשמש להשגת 0.5&micro; m מבנים גבוהים</td></tr><tr><td>MF 26A מפתח</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>לפיתוח חיובי S1805 פוטו-רזיסט</td></tr><tr><td><חזק>חומרים מתכלים למעבדה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr>חד <tr><td>פעמי פיפטת פלסטיק 3 מ"ל</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P100 צלחות פטרי</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>20 מ"ל</td><td>Terumo</td><td>SS+20ES1</td><td></td></tr><tr><td>סקוטש שקוף</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגבונים מרובעים</td><td>VWR</td><td>115-2148</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>DUTSCHER</td><td>90260</td><td>סרט פרפין מפלסטיק</td></tr> <tr><td><חזק>כימיקלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-Methacryloxypropyl) trichlorosilane</td><td>abcr</td><td>AB 109004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS וחומר ריפוי Sylgard 184</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td></td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>פולי-אורניתין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4957 - 50 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>02865</td><td>99.8%</td></tr><tr><td>3-מתקרילוקסיפרופיל-טרימתוקסילן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M6514-25ML</td> <td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Sigma-aldrich</td><td>71251-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 10kW מצומד עם Alexa488</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>Absoprtion ב-488 ננומטר</td></tr><tr><td>Dextran 10kW מצומד עם Alexa647</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22914</td><td>Absoprtion ב-647 ננומטר</td></tr><tr><td><חזק>מדיום תרבית</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21090-022</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט GIBCO 100 מ"מ</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NeuroBasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>נוירובזאלי ללא פנול אדום</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Routine in Matlab לנורמליזציה ברקע</td><td>Quantacell</td><td>צור קשר עם ויקטור רסין: victor.racine@quantacell.com</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>לבחירת החזר השקעה ספציפי עבור ניתוח תמונה</td></tr><tr><td>שגרתי</td><td>ImageJ</td><td></td><td>נתונים משלימים</td></tr><tr><td>שגרה</td><td>Matlab</td><td></td><td>נתונים משלימים</td></tr></tbody></table>

ברזולוציה גבוהה אמצעי הדמיה של נוירונים על ידי שימוש של זריחה החרגה שיטה והתקנים microfluidic ייעודי

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

אחסון הוא פרמטר חשוב לגבי מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של נוירונים בפרקי זמן שונים. הנוירונים הם תאים די ייחודי ביחס שלהם מורפולוגיות כחוד המורחבת ולגדל כתוצאה מכך מספר אתגרים מתודולוגיים למדידה נפח. במקרה מסוים במבחנה הצמיחה עצביים, המתודולוגיה שבחרת צריך לכלול תת מיקרומטר רזולוציה צירית בשילוב עם שדה מלא התבוננות על פרקי זמן של דקות שעות או ימים. בניגוד לשיטות אחרות כמו תא צורה שחזור באמצעות הדמיה קונאפוקלית, מדידות מבוסס-חשמלית או מיקרוסקופ כוח אטומי, שיטת אי-הכללה של קרינה פלואורסצנטית שפותחו לאחרונה (FXm) יש פוטנציאל להגשים את האתגרים הללו. עם זאת, למרות פשוטים עקרונית שלה מימוש FXm ברזולוציה גבוהה עבור נוירונים דורש התאמות מרובות, מתודולוגיה ייעודי. אנו מציגים כאן שיטה המבוססת על השילוב של הדרה פלורסצנטיות, התקנים נמוכים-חספוס מרובה תאים microfluidic, ולבסוף micropatterning כדי להשיג במבחנה מדידות של אחסון מקומי עצביים. הרזולוציה הגבוהה שמספק המכשיר מותר לנו למדוד נפח מקומי של תהליכים עצביים (neurites), הנפח של כמה מבנים ספציפיים המעורבים צמיחה עצביים, כגון צמיחה קונוסים (Gc).

התוצאה של תהליך ייצור שמתואר בסעיפים 1 ו- 2 מודגם על-ידי התמונות של איור 1A-1B , העקומה של איור 1C. השולחן של איור 1D מציג את הערכים החספוס של שני אזורים נציג אחר של השבב PDMS, דהיינו המרכזי ו 20 מיקרומטר גבוהה הבא ביניים לתא. ירידה ברמת החספוס בפקטור של כ- 7 התקבל באמצעות וופל סי חרוט במקום SU-8 photoresist. לאחר מכן, FXm הוחל לראשונה על פס photoresist של הגיאומטריה ידוע (איור 2 א) בתוך תא גבוהה 10 מיקרומטר. לאחר עיבוד תמונה ועוצמה המרה גובה (ראה גרף איור 2B), פרופילים FXm לבצע חתכים לאורך פס זו (איור 2C) לספק את הפרופילים גובה הרצויה (איור דו-ממדי). איור דו-ממדי מראה השוואה בין פרופילים שהושג באמצעות profilometry מכני ושיטות FXm. פרופילים אלה, כולל ערך edge ומישור, הם דומים מאוד, אימות השיטה. שימו לב כי הפיזור של נתונים FXm אינה מייצגת הרזולוציה האולטימטיבי של השיטה, כמו עוד העריך ב איור 3 ו- 4 איור, אבל התוצאות בעצימות נמוכה מועסק כדי למנוע השפעה אפשרית של חלש מאוד קרינה פלואורסצנטית-אוטומטי של photoresist ערוץ ה-GFP.
לאחר מכן, הבחנו neurites מיקרומטר 3 ו- 10 מיקרומטר צ'יימברס גבוהה (איור 3). סטיית התקן של רעשי הרקע הוא בערך 18 ננומטר לאחר בעוצמה כדי ההמרה גובה ותיקון רקע. ערך זה הוא מעט גבוה יותר מאשר המראה המחוספס הפיזי של משטחים PDMS casted על משטחי סיליקון (12 ננומטר, עיין בטבלה של איור 1D) אבל הרבה יותר נמוך מאשר בצבעוניות נמדדים על PDMS המתקבל SU-8 תבניות. תוצאות אלו לסמן את הערך המוסף של קדוח בארות סיליקון במקום פתיחה חורים לתוך SU-8 photoresist להטיל עמודים. ערך נמוך מאפשרת קליטה גבוהה יחס לרעש ותמונות מאוד ברור האחסון כגון זו המוצגת באיור 3 א. כדוגמה הנתונים ניתן לאחזר תמונות כאלה, חושבו הנפח של 1.6 מיקרומטר (כלומר 10 פיקסלים) רחב neurite פרוסה (ראה גרף איור 3B). שימוש בהערכה הראשונה התאמה לינארית של נתונים אלה נותן ערך גובה neurite אכזרי של בערך 400 nm, שניתן להשוותו למשל הקוטר עצב 500 ננומטר נמצאו ב 10 ימים הגורים ישן בתוך כפיס המוח 5. אנחנו גם משולב FXm עם micropatterns של אדהזיה המורכב באופן סדרתי abutted 2 מיקרומטר ו 6 מיקרומטר פסים רחב של 30 מיקרומטר באורכו. מטרתנו הייתה לחקור את השפעת רוחב neurite על צורתו התלת-ממד. איור 3C מציג ייצוג תלת-ממד הצבע של תמונת כל נוירון שהושג בחדר גבוהה 10 מיקרומטר. Neurites מתפשטים על 2 מיקרומטר, 6 פסים רחב של מיקרומטר, ואילו ממוקם על החמורים של הפס הגדול. גובה פרופילים נמשכו שלושה מקטעים שונים של הצלב. קוהרנטיות עם הגרף שמוצג באיור 3A, פני השטח משולבים על העלייה חתכים עם רוחב neurite (איור תלת-ממד).
אנחנו גם התמקדו צמיחה קונוס (GC) 3D מבנים. איור 4 A-B מציג שני GC פרופילים שונים להשיג חדר 3 גבוהה מיקרומטר, המבליטים את המבנה שלהם משנה מסועף. בנוסף, אנחנו ביצע ניסויים זמן לשגות לעקוב אחר הדינמיקה של הנפח של מחשבי קטלוגים כלליים בתוך תא גבוהה 12 מיקרומטר. איור 4C מציג מחזור של כיווץ שהפעלה של GC נתון בתוך סולם הזמן של כמה עשרות דקות. בזכות השימוש של עכברים GFP-lifeact, צמיחה קונוסים נרשמו נקודתית בהגל פליטה GFP (510 ננומטר) של התרכזות אקטין גבוהה שלהם. פני השטח המזוהים על אורך הגל שימש לשלב מעל הגל פליטה לתוספי-647 nm לחישוב נפח GC. איור 4D מראה סוף סוף את ההפצה של אמצעי אחסון GC נקודות זמן שונות ומיקום על שלושה נוירונים שונים, שבמרכזה ערך של מיקרומטר על 63.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> איור 1: צ'יימברס FXm PDMS. (א) ערכות ארבע השלבים העיקריים שונים של מיקרו-מלאכותית שמוביל כייר הסופי. המיקום של כניסת, אאוטלט, מאגרים מצוינים. גודל ברים: 1 מ. (ב) תמונה של התא PDMS FXm תוך שימוש profilometer אופטי. תמונה זו מציגה את החדר המרכזי המכיל 3 שורות של עמודים גבוהים 10 מיקרומטר לאהלי ביניים 20, 50 ו- 90 מיקרומטר בגובה. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (ג) תצוגת חתך הרוחב של השבב לאורך שני הקווים מקווקו שצוירו ב (B). צהוב/זהב: חתך לאורך העמודים, כחול: חתך בין העמודים. (ד) אומר ערכים החספוס PDMS נמדדים על 50 × 50 אזורים2 מיקרומטר, יצוק על הסיליקון ועל תא 20 מיקרומטר ביניים SU-8 גבוה (ראה חצים עבור המיקום של אזורים אלה). ערכים רעים, התקבלו את המידות של שלושה תחומים שונים. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> איור 2: כיול של השיטה FXm באמצעות פס photoresist כמו של האובייקט עניין. (א) GFP-זריחה התמונה נלקחה בתוך תא גבוהה 10 מיקרומטר מלא לתוספי MW 10,000 קליטת-488 nm ב 1 מ"ג/מ"ל. (ב': רקע, עמוד p:). התבוננות עם יעד נה X 0.8 40 יבש. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (B) כיול ליניארי חוק המתקבל בעוצמת שני צבעוניים המלבנים שמוצג בפרופיל עוצמת קרינה פלואורסצנטית (ג) א שהושג ברמה של קו מקווקו כחול מוצג ב- (א), חוצה את photoresist רשע פס (0.45 מיקרומטר גבוהה חיובי photoresist). (ד) השוואה של הפרופילים המתקבל profilometer מכנית (נקודות שחורות), FXm לאחר עוצמת גובה המרה של נתוני (B) (נקודות כחולות). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> איור 3: הדמיה נפח Neurite. Neurite (א) המשתרעת אל החדר המרכזי של גבוהה מיקרומטר 3 סומא ממוקם בבית הבליעה ביניים הבא 15 מיקרומטר. הדמיה המבוצעת באמצעות לתוספי MW 10,000 קליטת-488 ננומטר, 40 X, נה 0.8 יבש אובייקטיבי. שיבוץ שהושג לאחר השימוש של השגרה הפחתת רקע מדגיש את neurites שני ובחרת כדי להתוות את הגרף בצד הימין. גודל ברים: 30 מיקרומטר. (ב) Neurite נפח פרוסה כפונקציה של neurite רוחב המתקבל הפרופילים 22 (ממוצע ב- 10 פיקסלים, כלומר על 1.6 מיקרומטר "neurite slice") המוצגים ב (א). הקו המלא מייצג התאמה לינארית של מדרון 0.4 מיקרומטר עובר דרך ראשית הצירים. (ג) תמונת צבע שווא של נוירון בדוגמת על פס דבק עשוי רצופים 2 מיקרומטר וגזעי 6 מיקרומטר רחב (המיוצגת בלבן). בתוך תא גבוהה 10 מיקרומטר מלא לתוספי MW 10,000 קליטת-647 נעשו מדידות של נה 40 x ננומטר ושימוש 0.8 יבש אובייקטיבי. (ד) גובה פרופילים התואמים בצבע קווים מקווקווים באיור (ג), שמירה על אותו צבע קוד. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> איור 4: הדמיה חרוט הצמיחה סטטיים ודינמיים. (A-B) צמיחה חרוט גובה פרופילי שהושג בחדר גבוהה מיקרומטר 3 לאחר עוצמת המרה גובה לאורך הקווים הצהובים מוצגות התמונות הקשורות. תצפית מבוצעים על-ידי מילוי עם 10,000 לתוספי MW קליטת-488 ננומטר, 40 X, נה 0.8 יבש אובייקטיבי. (ג) כל נוירון הדמיה בחדר גבוהה 12 מיקרומטר מלא לתוספי MW 10,000 קליטת-647 ננומטר. תצפיות שנעשו בשני ערוצים פלורסנט: GFP לוקליזציה חרוט הצמיחה (מקווקו צהוב), CY5 לחישוב נפח GC של קרינה פלואורסצנטית הדרה. השטח כולל באמצעות קווים מקווקווים הצהוב שימש לחישוב נפח GC. הגרף מציג את הווריאציה של GC האחסון לאורך זמן, מורפולוגיות המשויך ערוצי ה-GFP והן CY5 בנקודות זמן שונות נציג שני. כל הנתונים נרכשו באמצעות נה 40 x 0.8 יבש המטרה בכל הברים בקנה מידה מינימלית 3: 10 מיקרומטר. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שלב</td>
			<td>מסיכת שכבה 1:8 מיקרומטר</td>
			<td>מסיכה 2:30 מיקרומטר שכבה</td>
			<td>מסיכה 3:40 שכבה מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>סוג SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 סל ד</td>
			<td>30 s @ סל ד 3050</td>
			<td>30 s @ 3250 סל ד</td>
		</tr>
<tr>
<td>אופים רך</td>
			<td>3 דקות @ 95 ° C</td>
			<td>2 דקות @ 65 ° C + 6 דקות @ 95 ° C</td>
			<td>3 דקות @ 65 ° C + 7 דקות @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>חשיפה אנרגיה</td>
			<td>mJ 110/ס מ2
</td>
			<td>mJ 155/cm2
</td>
			<td>mJ 170/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>לאפות לאחר חשיפה</td>
			<td>4 דקות @ 95 ° C</td>
			<td>1 דקות 65 ° C + 6 דקות @ 95 ° C</td>
			<td>2 דקות @ 65 ° C + 7 דקות @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>פיתוח</td>
			<td>2 דקות 30 s</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>6 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>(אופציונלי) קשה לאפות</td>
			<td>3-5 דקות 200 ° C</td>
			<td>3-5 דקות 200 ° C</td>
			<td>3-5 דקות 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: צעדים פוטוליתוגרפיה שבוצעה לבנות מכשיר המכיל תא מרכזי של μm 12 גובה. גבהים של התאים ביניים: 20, 50 ו- 90 מיקרומטר.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שלב</td>
			<td>מסיכה 1:10 מיקרומטר שכבה</td>
			<td>מסיכה 2:30 מיקרומטר שכבה</td>
			<td>מסיכה 3:40 שכבה מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>סוג SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500 סל ד</td>
			<td>30 s @ סל ד 3050</td>
			<td>30 s @ 3250 סל ד</td>
		</tr>
<tr>
<td>אופים רך</td>
			<td>3 דקות @ 95 ° C</td>
			<td>2 דקות @ 65 ° C + 6 דקות @ 95 ° C</td>
			<td>3 דקות @ 65 ° C + 7 דקות @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>חשיפה אנרגיה</td>
			<td>mJ 125/cm2
</td>
			<td>mJ 155/cm2
</td>
			<td>mJ 170/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>לאפות לאחר חשיפה</td>
			<td>4 דקות @ 95 ° C</td>
			<td>1 דקות 65 ° C + 6 דקות @ 95 ° C</td>
			<td>2 דקות @ 65 ° C + 7 דקות @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>פיתוח</td>
			<td>2 דקות 30 s</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>6 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>(אופציונלי) קשה לאפות</td>
			<td>3-5 דקות 200 ° C</td>
			<td>3-5 דקות 200 ° C</td>
			<td>3-5 דקות 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2: צעדים פוטוליתוגרפיה שבוצעה לבנות מכשיר המכיל תא מרכזי של 10 μm בגובה. גבהים של התאים ביניים: 20, 50 ו- 90 מיקרומטר.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שלב</td>
			<td>מסיכה 1:12 מיקרומטר שכבה</td>
			<td>מסיכה 2:32 שכבה מיקרומטר</td>
			<td>מסיכה 3:40 שכבה מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>סוג SU-8</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 3250 סל ד</td>
			<td>30 s @ 2500 סל ד</td>
			<td>30 s @ 3250 סל ד</td>
		</tr>
<tr>
<td>אופים רך</td>
			<td>3 דקות @ 95 ° C</td>
			<td>2 דקות @ 65 ° C + 5 דקות @ 95 ° C</td>
			<td>3 דקות @ 65 ° C + 7 דקות @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן החשיפה</td>
			<td>mJ 140/ס מ2
</td>
			<td>mJ 157/cm2
</td>
			<td>mJ 170/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>לאפות לאחר חשיפה</td>
			<td>4 דקות @ 95 ° C</td>
			<td>1 דקות 65 ° C + 5 דקות @ 95 ° C</td>
			<td>2 דקות @ 65 ° C + 7 דקות @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>פיתוח</td>
			<td>3 דקות</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>6 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>(אופציונלי) קשה לאפות</td>
			<td>3-5 דקות 200 ° C</td>
			<td>3-5 דקות 200 ° C</td>
			<td>3-5 דקות 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: צעדים פוטוליתוגרפיה שבוצעה לבנות מכשיר המכיל תא מרכזי של 3 μm בגובה. גבהים של התאים ביניים: 18, 50 ו- 90 מיקרומטר.
נתונים משלימים 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. הצג סכימתי של המסכות נהגה לפברק את המכשיר PDMS (DRIE מסכה, מסכות 1-3). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
נתונים משלים 2: קובץ "masks_neuron_volume_chips.dxf". קבצים אלקטרוניים המאפשר לפברק את המסכה DRIE ומסיכות 1-3. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
נתונים משלים 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". קבצים אלקטרוניים המאפשר לפברק את המסיכה המשמש את פוטוליתוגרפיה של פסים photoresist. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
משלים נתונים 4: קובץ conversion_mattotiff.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
נתונים משלימים 5: קובץ importfilevol.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

אחסון הוא פרמטר חשוב לגבי מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של תאים. אנו מתארים שיטה הדרה פלורסנט ומאפשר מלא-שדה למדידה של במבחנה כמות עצביים עם תת מיקרומטר רזולוציה צירית הנדרש לניתוח של neurites ומבנים דינמי משתמעת בצמיחה עצביים.

ברזולוציה גבוהה אמצעי הדמיה של נוירונים על ידי שימוש של זריחה החרגה שיטה והתקנים Microfluidic ייעודי

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר מדידת שדה מלאה של נפח עצבי במבחנה עם רזולוציה צירית תת-מיקרומטרית הנדרשת לניתוח נויריטים במבנים דינמיים המשתמעים בצמיחה עצבית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח התאיים לגבי הדינמיקה של שינויי נפח בקנה מידה סובסידלי במהלך אי-צמיחה או ניוון אקסונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת רזולוציה צירית תת-מיקרומטרית בשילוב עם תצפית בהתאמה מלאה וסולם זמן לשעות או ימים.כדי להתחיל בהליך, יש לשחרר את בלוק ה-PDMS מתחת למכסה המנוע הכימי על ידי שפיכת איזופרופנול עליו. לאחר מכן, הניחו אותו על ספסל הנירוסטה של מכסה המנוע. חותכים סביב פרוסת הסיליקון ומרוקנים את העתק ה-PDMS.לאחר מכן, חותכים סביב השבב ומשאירים שוליים של שני מילימטר בעזרת אזמל או סכין גילוח. אגרוף את הכניסה על ידי לחיצה חזקה על האגרוף בקוטר 1.5 מילימטר והפעיל אותו על מנת לחתוך ולגלף את חור הכניסה. עשו את אותו הדבר בארבעת האזורים הייעודיים של השבב שבהם יוזרק נוזל.לאחר מכן, נקו את השבב על ידי הדבקה וקילוף של סרט ההדבקה בצד המיקרו-מובנה. מפזרים איזופרופנול משני הצדדים. לאחר מכן, יבש את השבב עם חנקן בלחץ באמצעות אקדח מכת אוויר.בהליך זה, הנח כל כיסוי על ציפוי מסתובב הממוקם בסביבת חדר נקי. מרחו טיפה של הפוטו-רזיסט החיובי כדי לכסות כ-75% מכיסוי הכיסוי וציפוי סיבוב ב-4000 סל"ד למשך 30 שניות כדי להגיע לעובי סופי של 0.45 מיקרומטר. הניחו את הכיסויים על פלטה עם טמפרטורת פנים של 115 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.בעזרת קשתיות מסכה יש לחשוף כל כיסוי באורך גל של 435 ננומטר דרך המסכה הייעודית בהתאם לפרמטרים היצרניים. לאחר מכן, הכינו שתי כלי גיבוש זכוכית, האחת מכילה את המפתח ללא דילול, השנייה מכילה מים דה-יונים. טובלים את הכיסויים בזה אחר זה במפתח למשך דקה תוך ערבוב רציף ועדין של התבנית המתגבשת.לאחר מכן, טבלו את הוופל במים נטולי יונים למשך כחמש שניות. מעבירים את הוופל לנייר סופג ומייבשים אותו בחנקן בלחץ בעזרת אקדח מכת אוויר. הנח גם את שבב ה-PDMS וגם את צלחת הזכוכית שעליה הוא יודבק בתא הפלזמה להפעלת פני השטח.לאחר מכן, הניחו טיפת מים על מגלשת זכוכית מיקרוסקופ עבה מלבנית והדביקו את הכיסוי על מגלשת הזכוכית על ידי נימיות. תחת מיקרוסקופ, סמן את מיקום פסי הפוטו-התנגדות בחלק האחורי של שקופית הזכוכית. הנח את כיסוי הזכוכית המעוצבת על מחזיק המסכה של קשת היישור של המסכה.הסתמך על הסימן שנעשה כדי למרכז אובייקטי הייחוס לאור. כדי להגביר את הניגודיות האופטית, הנח פרוסת סיליקון מתחת לשבב ה-PDMS. פרוסת הסיליקון צריכה להישאר מחוברת היטב על הצ'אק במהלך תהליך היישור.לאחר מכן, הנח את שבב ה-PDMS על מחזיק המצע הנייד של מיישר המסכה. לאחר מכן, הרם את הצ'אק מספיק כדי לדמיין הן את השבב והן את מערך פסי הפוטו-התנגדות הממוקמים על הכיסוי תוך שמירה על המגע המכני. בצע יישור והשג מגע מכני בין השבב לכיסוי על ידי הרמת הצ'אק עד שפני השטח של עמודי PDMS נוגעים בכיסוי הזכוכית.לאחר מכן, הורד את הצ'אק. הסר את הכיסוי המחובר לשבב ממחזיק המסכה. לאחר מכן, הכניסו את המכשיר לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר והעבירו הכל לתנור למשך חמש עד עשר דקות כדי להגביר את חוזק ההדבקה.שלושים דקות לאחר ההדבקה, הניחו קצה פיפטה של עשרה מיקרוליטר מלא בתמיסת PLO בכניסה. לאחר מכן, טען את הנוזל עד ליצירת טיפה מעל. חזור על אותה פעולה בשקע ובמאגרים.לאחר מכן, הוסף PBS בצלחת הפטרי מסביב לשבב. אוטמים את צלחת הפטרי בסרט פרפין ודוגרים בטמפרטורת החדר עם מינימום חמש שעות. לאחר מכן, לחץ קלות על חרוט קצה של עשרה מיקרוליטר לתוך כל חור הזרקה ושאב את עודפי הנוזל.לאחר מכן, החלף את PLO כמו גם את ה-PBS המקיף את השבב במדיום התרבית. לאחר מכן, הנח את השבב בחממה המווסתת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עד שתאי העצב זורעים עם זמן דגירה מינימלי של חמש שעות. בהליך זה, צייר את מדיום התרבות מהשבב.אוספים שניים עד שלושה מיקרוליטרים מתמיסת התאים המושעה הטרייה ומזריקים אותה בכניסה. חזור מיד על אותה פעולה בשקע. הזרקו בערך אותו נפח של מדיום תרבות בכל מאגר.התבונן במהירות בשבב מתחת למיקרוסקופ כדי לבדוק את צפיפות התאים. סדר הגודל של צפיפות התא האופטימלית מתאים לכחמישה עד עשרה תאים בתוך המשטח המרובע התחום על ידי ארבעה עמודים. חזור על הליך ההזרקה של 0.5 עד 1 מיקרוליטר של תרחיף תאים כדי להגיע לצפיפות התאים הממוקדת.לצורך הדמיה, החלף את מדיום התרבות במדיום ההדמיה. לאחר מכן, הנח את השבב מתחת למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. רכוש תמונות של תאים מתמונות בודדות למספר תמונות עוקבות במקרה של ניסויי זמן-lapse.מוצגות כאן התצפיות המייצגות של כיול, פס פוטו-רזיסט ונוירונים. תמונות בהגדלה גבוהה יותר וחתכים של אובייקטים אלה מוצגים מימין. הנויריטים המייצגים ותא מרכזי בגובה שלושה מיקרומטרים מוצגים כאן.ניתן לחשב את נפח פרוסת הנויריט כפונקציה של רוחב הנויריט. והנה קונוסי הצמיחה המייצגים ותא מרכזי בגובה שלושה מיקרומטרים. התשתיות שלהם יוצאות בבירור מרעש רקע אופטי של כ-20 ננומטר.תצפיות דולג זמן של נוירונים פועלים לתוך תא בגובה 12 מיקרומטר כדי לעקוב אחר מחזור ההתכווצות וההפעלה מחדש של חרוט הגידול בטווח זמן של כמה עשרות דקות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שתהיה גישה לציוד תחריט יונים עמוק כדי לייצר את בוץ הסיליקון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישר כיסוי זכוכית מובנה עם שבב PDMS.לאחר שליטה, ניתן ליישם טכניקה זו באופן שחזורי לכימות הנוירולוגיה בתלת מימד. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפרמקולוגיה לחקור את ההשפעה של תרופות שונות בקליבר ממשי כולן בצורת חרוט סגור. אל תשכח שעבודה עם נוירונים ראשוניים דורשת טיפול רב כדי למנוע זיהום והתנפצויות.היו תמיד עדינים ומהירים בעת החלפת מדיה על מנת להגביל את הזמן שהם מבלים מחוץ לחממה.

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הדמיה תא חי היא של כלי מסוים כאשר לומדים את הדינמיקה של סחר אברון. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בנוירונים בתרבית שימוש רחב בתחום מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גמיש ניתן להתאים האברונים תמונה אחרים כגון המיטוכונדריה, endosomes, ואת peroxisomes.

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה תאים תמונה שכותרתו fluorescently למחצה עבה פרוסות המוח. על ידי תיקון, חיתוך, ואת אופטית ניקוי רקמת המוח אנו מתארים כיצד הדמיה epifluorescent או confocal רגיל יכול לשמש כדי לחזות תאים בודדים ורשתות נוירונים בתוך רקמת העצבים ללא פגע.

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

תחבורה מדרדר של צבע פלואורסצנטי מתייגת תת אוכלוסייה של תאי עצב המבוססים על הקרנת אנטומי. אקסונים שכותרתו יכול להיות ממוקדים מבחינה...

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

טכניקת הדמיה למעקב אחר שינויים אפשריים בממברנה עם רזולוצית המשנה מיקרומטר מרחבית ותת זמנית האלפית השנייה מתוארת. הטכניקה, המבוססת על ליזר עירור של צבעי מתח רגישים, מאפשרת מדידות של אותות באקסונים וטחונות האקסון, סניפי מסוף דנדריטיים, וקוצים הדנדריטים בודדים.

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

סרטון זה מדגים כיצד שלפוחיות עצביות מסומנות בחלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים כדי לדמיין את תנועתן. ראשית, פלסמיד המקודד לחלבון פלואורסצנטי מודגר עם סוכן טרנספקציה ולאחר מכן מוכנס לתרבית של נוירונים. לאחר מכן, תמונות של הנוירונים נרכשות ומנותחות כדי לעקוב אחר תנועת השלפוחיות.

הדמיה של תנועתיות שלפוחית בתאי עצב באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

אנו מתארים כיצד ליישם מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (PALM) מבוסס מחקרים של שלפוחית ​​בנוירונים קבוע, בתרבית. רכיבי מפתח של הפרוטוקול שלנו כוללים שלפוחית ​​תיוג עם מפלצות photoconvertible, איסוף תמונות גולמיות נדגמו בדלילות עם מערכת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, ועיבוד התמונות גולמיות כדי לייצר תמונה ברזולוציה סופר.

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

כאן אנו מציגים פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה דימות ברזולוציה, שחזור תלת מימדי של העכבר נוירו-וסקולריים יחידה, מחסום הדם - מוח באמצעות סעיפים לתרשים המוח. שיטה זו מאפשרת הפריט החזותי, ניתוח של כימות של organelles תאיים-BBB.

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis

פרוטוקול זה מתאר את השימוש שבבי פלסטיק תרבות, ממדר אותם נוירונים מאתר העיקרי. . הצ'יפס הזה preassembled, ידידותי למשתמש, תואם עם רזולוציה גבוהה, לחיות, קרינה פלואורסצנטית והדימות. פרוטוקול זה מתאר את אופן צלחת החולדה הנוירונים בהיפוקמפוס בתוך הצ'יפס הזה ולבצע בידוד fluidic, axotomy ו- immunostaining.

שימוש של שבבי Microfluidic פלסטיק מראש ממדר נוירונים מאתר העיקרי

הפרוטוקול מספק שיטה מפורטת של הדמיה עצבית בפרוסת המוח באמצעות שיטת ניקוי רקמות, ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות מוח, הבהרת רקמות, טיפול בפרוסות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית של מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות.

שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים

בשילוב עם לוחית ראש ועיצוב אופטי התואם למיקרוסקופים של פוטון בודד ושני פוטונים, עדשת המיקרופריזמה מציגה יתרון משמעותי במדידת תגובות עצביות בטור אנכי בתנאים מגוונים, כולל ניסויים מבוקרים היטב במצבים קבועים בראש או משימות התנהגותיות טבעיות בבעלי חיים הנעים בחופשיות.

הדמיה ארוכת טווח של אוכלוסיות עצביות מזוהות באמצעות מיקרופריזמות בבעלי חיים הנעים בחופשיות ומקובעים לראש

למד שיטת הדמיה ברזולוציה גבוהה לנוירונים תוך שימוש בשבב PDMS מיקרופלואידי ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקה זו מאפשרת מדידת נפח תת-מיקרומטרי של נויטריטים ומבנים דינמיים בצמיחה נוירונלית.

ברזולוציה גבוהה אמצעי הדמיה של נוירונים על ידי שימוש של זריחה החרגה שיטה והתקנים Microfluidic ייעודי

גלה סרטונים נוספים