ברזולוציה גבוהה אמצעי הדמיה של נוירונים על ידי שימוש של זריחה החרגה שיטה והתקנים Microfluidic ייעודי
26 במרץ 2018
אחסון הוא פרמטר חשוב לגבי מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של תאים. אנו מתארים שיטה הדרה פלורסנט ומאפשר מלא-שדה למדידה של במבחנה כמות עצביים עם תת מיקרומטר רזולוציה צירית הנדרש לניתוח של neurites ומבנים דינמי משתמעת בצמיחה עצביים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר מדידת שדה מלאה של נפח עצבי במבחנה עם רזולוציה צירית תת-מיקרומטרית הנדרשת לניתוח נויריטים במבנים דינמיים המשתמעים בצמיחה עצבית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח התאיים לגבי הדינמיקה של שינויי נפח בקנה מידה סובסידלי במהלך אי-צמיחה או ניוון אקסונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת רזולוציה צירית תת-מיקרומטרית בשילוב עם תצפית בהתאמה מלאה וסולם זמן לשעות או ימים.
כדי להתחיל בהליך, יש לשחרר את בלוק ה-PDMS מתחת למכסה המנוע הכימי על ידי שפיכת איזופרופנול עליו. לאחר מכן, הניחו אותו על ספסל הנירוסטה של מכסה המנוע. חותכים סביב פרוסת הסיליקון ומרוקנים את העתק ה-PDMS.
לאחר מכן, חותכים סביב השבב ומשאירים שוליים של שני מילימטר בעזרת אזמל או סכין גילוח. אגרוף את הכניסה על ידי לחיצה חזקה על האגרוף בקוטר 1.5 מילימטר והפעיל אותו על מנת לחתוך ולגלף את חור הכניסה. עשו את אותו הדבר בארבעת האזורים הייעודיים של השבב שבהם יוזרק נוזל.
לאחר מכן, נקו את השבב על ידי הדבקה וקילוף של סרט ההדבקה בצד המיקרו-מובנה. מפזרים איזופרופנול משני הצדדים. לאחר מכן, יבש את השבב עם חנקן בלחץ באמצעות אקדח מכת אוויר.
בהליך זה, הנח כל כיסוי על ציפוי מסתובב הממוקם בסביבת חדר נקי. מרחו טיפה של הפוטו-רזיסט החיובי כדי לכסות כ-75% מכיסוי הכיסוי וציפוי סיבוב ב-4000 סל"ד למשך 30 שניות כדי להגיע לעובי סופי של 0.45 מיקרומטר. הניחו את הכיסויים על פלטה עם טמפרטורת פנים של 115 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
בעזרת קשתיות מסכה יש לחשוף כל כיסוי באורך גל של 435 ננומטר דרך המסכה הייעודית בהתאם לפרמטרים היצרניים. לאחר מכן, הכינו שתי כלי גיבוש זכוכית, האחת מכילה את המפתח ללא דילול, השנייה מכילה מים דה-יונים. טובלים את הכיסויים בזה אחר זה במפתח למשך דקה תוך ערבוב רציף ועדין של התבנית המתגבשת.
לאחר מכן, טבלו את הוופל במים נטולי יונים למשך כחמש שניות. מעבירים את הוופל לנייר סופג ומייבשים אותו בחנקן בלחץ בעזרת אקדח מכת אוויר. הנח גם את שבב ה-PDMS וגם את צלחת הזכוכית שעליה הוא יודבק בתא הפלזמה להפעלת פני השטח.
לאחר מכן, הניחו טיפת מים על מגלשת זכוכית מיקרוסקופ עבה מלבנית והדביקו את הכיסוי על מגלשת הזכוכית על ידי נימיות. תחת מיקרוסקופ, סמן את מיקום פסי הפוטו-התנגדות בחלק האחורי של שקופית הזכוכית. הנח את כיסוי הזכוכית המעוצבת על מחזיק המסכה של קשת היישור של המסכה.
הסתמך על הסימן שנעשה כדי למרכז אובייקטי הייחוס לאור. כדי להגביר את הניגודיות האופטית, הנח פרוסת סיליקון מתחת לשבב ה-PDMS. פרוסת הסיליקון צריכה להישאר מחוברת היטב על הצ'אק במהלך תהליך היישור.
לאחר מכן, הנח את שבב ה-PDMS על מחזיק המצע הנייד של מיישר המסכה. לאחר מכן, הרם את הצ'אק מספיק כדי לדמיין הן את השבב והן את מערך פסי הפוטו-התנגדות הממוקמים על הכיסוי תוך שמירה על המגע המכני. בצע יישור והשג מגע מכני בין השבב לכיסוי על ידי הרמת הצ'אק עד שפני השטח של עמודי PDMS נוגעים בכיסוי הזכוכית.
לאחר מכן, הורד את הצ'אק. הסר את הכיסוי המחובר לשבב ממחזיק המסכה. לאחר מכן, הכניסו את המכשיר לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר והעבירו הכל לתנור למשך חמש עד עשר דקות כדי להגביר את חוזק ההדבקה.
שלושים דקות לאחר ההדבקה, הניחו קצה פיפטה של עשרה מיקרוליטר מלא בתמיסת PLO בכניסה. לאחר מכן, טען את הנוזל עד ליצירת טיפה מעל. חזור על אותה פעולה בשקע ובמאגרים.
לאחר מכן, הוסף PBS בצלחת הפטרי מסביב לשבב. אוטמים את צלחת הפטרי בסרט פרפין ודוגרים בטמפרטורת החדר עם מינימום חמש שעות. לאחר מכן, לחץ קלות על חרוט קצה של עשרה מיקרוליטר לתוך כל חור הזרקה ושאב את עודפי הנוזל.
לאחר מכן, החלף את PLO כמו גם את ה-PBS המקיף את השבב במדיום התרבית. לאחר מכן, הנח את השבב בחממה המווסתת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עד שתאי העצב זורעים עם זמן דגירה מינימלי של חמש שעות. בהליך זה, צייר את מדיום התרבות מהשבב.
אוספים שניים עד שלושה מיקרוליטרים מתמיסת התאים המושעה הטרייה ומזריקים אותה בכניסה. חזור מיד על אותה פעולה בשקע. הזרקו בערך אותו נפח של מדיום תרבות בכל מאגר.
התבונן במהירות בשבב מתחת למיקרוסקופ כדי לבדוק את צפיפות התאים. סדר הגודל של צפיפות התא האופטימלית מתאים לכחמישה עד עשרה תאים בתוך המשטח המרובע התחום על ידי ארבעה עמודים. חזור על הליך ההזרקה של 0.5 עד 1 מיקרוליטר של תרחיף תאים כדי להגיע לצפיפות התאים הממוקדת.
לצורך הדמיה, החלף את מדיום התרבות במדיום ההדמיה. לאחר מכן, הנח את השבב מתחת למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. רכוש תמונות של תאים מתמונות בודדות למספר תמונות עוקבות במקרה של ניסויי זמן-lapse.
מוצגות כאן התצפיות המייצגות של כיול, פס פוטו-רזיסט ונוירונים. תמונות בהגדלה גבוהה יותר וחתכים של אובייקטים אלה מוצגים מימין. הנויריטים המייצגים ותא מרכזי בגובה שלושה מיקרומטרים מוצגים כאן.
ניתן לחשב את נפח פרוסת הנויריט כפונקציה של רוחב הנויריט. והנה קונוסי הצמיחה המייצגים ותא מרכזי בגובה שלושה מיקרומטרים. התשתיות שלהם יוצאות בבירור מרעש רקע אופטי של כ-20 ננומטר.
תצפיות דולג זמן של נוירונים פועלים לתוך תא בגובה 12 מיקרומטר כדי לעקוב אחר מחזור ההתכווצות וההפעלה מחדש של חרוט הגידול בטווח זמן של כמה עשרות דקות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שתהיה גישה לציוד תחריט יונים עמוק כדי לייצר את בוץ הסיליקון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישר כיסוי זכוכית מובנה עם שבב PDMS.
לאחר שליטה, ניתן ליישם טכניקה זו באופן שחזורי לכימות הנוירולוגיה בתלת מימד. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפרמקולוגיה לחקור את ההשפעה של תרופות שונות בקליבר ממשי כולן בצורת חרוט סגור. אל תשכח שעבודה עם נוירונים ראשוניים דורשת טיפול רב כדי למנוע זיהום והתנפצויות.
היו תמיד עדינים ומהירים בעת החלפת מדיה על מנת להגביל את הזמן שהם מבלים מחוץ לחממה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה חדשנית של הדרה פלואורסצנטית למדידה של נפח נוירונלי in vitro בשדה מלא עם רזולוציה אקסית סוב-מיקרומטרית. הטכניקה חיונית לניתוח של נוריטים ומבנים דינמיים הקשורים לצמיחה נוירונלית, ומאפשרת הבנה מעמיקה של פיזיולוגיה ופתולוגיה תאיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- מחקר נוירולוגי
רקע
- נפח נוירונלי הוא קריטי להבנת מאפיינים תאיים.
- שינויי נפח בקנה מידה סוב-תאי הם חשובים במהלך תהליכים פיזיולוגיים.
- השיטה שואפת לשפר את הרזולוציה בניטור דינמיקה של נוריטים.
- היא נותנת מענה לצורך במדידות נפח ברמת דיוק גבוהה במחקרי נוירונים.
מטרת המחקר
- לאפשר דימוי של נפח נוירונלי בשדה מלא וברזולוציה גבוהה.
- להקל על ניתוח של נוריטים והדינמיקה המבנית שלהם.
- לספק תובנות לגבי תהליכי צמיחה וניוון של נוירונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- במחקר זה נעשה שימוש בשבב מיקרופלואידי מ-PDMS למדידות נפח.
- המודל הביולוגי מתמקד בעיקר בנוירונים בתרבית לצורך תצפית מפורטת.
- במחקר זה לא נעשה שימוש בתהליכי עבודה של מולטי-אומיקה (multiomics).
- השיטה כוללת ייצור והרכבה קפדנית של ההתקן המיקרופלואידי, ולאחריהן דימוי תחת מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה.
- שלבים חשובים כוללים תהליכי ציפוי, הדבקה וזריעת תאים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מספקת רזולוציה אקסיאלית סוב-מיקרומטרית, החיונית לתצפית על מבנים עצביים.
- שינויים דינמיים של נוריטים נוטרו ביעילות לאורך זמן.
- דימות ברזולוציה גבוהה חשף פרטים דקים של קונוסי צמיחה עצביים ושינויים מבניים.
- הגישה מאפשרת חישובי נפח מדויקים של פרוסות נוריטים.
מסקנות
- המחקר מדגים טכניקה חסונה למדידות נפח נוירונלי ברזולוציה גבוהה.
- גישה זו היא מרכזית לקידום הידע על מנגנונים נוירונליים ופלסטיות.
- יש לה השלכות משמעותיות על מחקרים עתידיים בדינמיקה תאית ובנוירוביולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות מדויק של דינמיקת הנפח העצבי הוא קריטי להערכת תרכובות נוירו-אקטיביות בשלבי הגילוי המוקדמים, ובמיוחד להערכת שלמותה של הניוריט והתנהגות תרגיד הצמיחה. שיטת ה-Fluorescence eXclusion (FXm) בשילוב עם תבניטי מיקרופלואידיקה מספקת רזולוציה צירית סוב-מיקרומטרית ודימוי של השדה המלא, מה שמאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית עבור תרכובות המכוונות לפלסטיות מבנית של נוירונים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בזיהוי מובילים על ידי קישור שינויים בנפח תת-תאי לתוצאות תפקודיות במודלים in vitro רלוונטיים למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מדידת שינויים בנפח מקומי של נוריטים וקונוסי צמיחה כמדדים תפקודיים לבריאות נוירונלית.
- ערך תפעולי: מספק נתונים מורפולוגיים כמותיים וניתנים לשחזור להפחתת סיכונים במטרות המעורבות במסלולי ניוון או התחדשות של נוריטים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר קריאות נפחיות סטנדרטיות ברזולוציה גבוהה המתאימות למזעור בדיקות ולסריקת תרכובות בפורמטים של מיקרופלואידיקה.
- ערך תפעולי: תומך במוכנות הבדיקה באמצעות מדידות נפח מדויקות וללא סימון (label-free), המפחיתות את השונות בהערכות התגובה של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מדדים מבניים רלוונטיים למחלה, המגשרים בין ממצאים in vitro למודלים פרה-קליניים של פגיעה עצבית או ניוון עצבי.
- ערך תפעולי: מאפשר מעקב ארוך טווח של דינמיקת נוריטים, ובכך תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון בקווי פיתוח פרה-קליניים.
שילוב בקו תהליך ובזרימת עבודה
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת נקודות קצה מבניות כמותיות, המהוות בסיס לאופטימיזציה של תרכובות מובילות (lead optimization) ולהמשכיות פרה-קלינית, במיוחד עבור תרכובות המשפיעות על מורפולוגיה נוירונלית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות בנוגע לשלמות נוריטים ולדינמיקה של תאי צמיחה באמצעות מדידה נפחית ישירה של מבנים תת-תאיים.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות דימות נפחי של השטח כולו, ברזולוציה סוב-מיקרומטרית ובאופן הניתן לשחזור, לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק פלטי נפח כמותיים המאפשרים השוואה של שינויים מבניים המושרים על ידי תרכובות בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תצפיות בשלבי הגילוי המוקדמים לרלוונטיות פרה-קלינית על ידי כימות של סמנים מבניים של צמיחה וניוון נוירונליים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימות מיקרופלואידית שניתנת לשימוש חוזר וניתנת ליישום במגוון מודלים נוירונליים ומחלקות של תרכובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתגובות מבניות נוירונליות להפרעה פרמקולוגית.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות ייצור התקני מיקרופלואידיקה ותהליכי דימוג תואמי אפיפלורסצנציה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי אספקת ביומארקרים מוקדמים, מבוססי מורפולוגיה, ליעילות תרכובות ולנוירוטוקסיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם סיכון, המבוסס על השפעות מאומתות על נפח נויריטים ודינמיקה של קוני גדילה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור מיקרופלואידי, פוטוליתוגרפיה וטכניקות של קישור פני השטח להרכבת המכשיר.
- תלוי בגישה למכשירים ליישור מסכות (mask aligners), מערכות לטיפול בפלסמה וציוד לטיפול מדויק בנוזלים לצורך הכנת השבב.
- מחייב סטנדרטיזציה של צפיפות זריעת התאים ושל פרוטוקולי הדימוג בין הצוותים כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור סוגים שונים של תת-סוגי נוירונים או מודלים של מחלות, באמצעות התאמות בגיאומטריה המיקרופלואידית ובתבניות פני השטח.
- מוגבל בשל הצורך בגישה לחדר נקי ייעודי ובמיומנות טכנית בטיפול ב-PDMS ובאינטגרציה מיקרופלואידית, דבר שעלול להשפיע על פריסה רחבה.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Fabrication of PDMS Chip
1:51
Fabrication of Patterned Coverslips
3:13
Chip Assembling and Final Implementation
6:03
Neuron Culture and Imaging
7:14
Results: Calibration of Fluorescence eXclusion Method Using a Photoresist Stripe as the Object of Interest and Neuronal Structures Volume Imaging
8:17
Conclusion
