דגם פרה העכבר של אוסטאוסרקומה כדי להגדיר את התקשורת חוץ-תאית שלפוחית בתיווך בין גידול בתאי גזע Mesenchymal

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא לפתח מודל עכבר פרה-קליני כדי לחקור את תפקידה של תקשורת בתיווך שלפוחית חוץ-תאית בין תאי גזע גידוליים לתאי גזע מזנכימליים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על מספר שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, כיצד תאי גזע גידוליים ומזנכימליים מתקשרים באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות, והאם זה תומך בהתקדמות הסרטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקור את התפקיד של הסתגלות תאי גזע מזנכימליים על ידי EVs סרטניים, על התקדמות והיווצרות גרורות in vivo.

ההשלכות של הליך זה משתרעות על הטיפול שלנו בסרטן, מכיוון שאנו יכולים להשתמש ב-GSA כדי להפריע לתקשורת EV ולאיתות אנדרוגנים כדי לעכב את התקדמות הסרטן. מלבד מתן תובנות לגבי התקשורת בתיווך EV באוסטאוסרקומה, ניתן ליישם שיטה זו גם על סוגי סרטן רבים אחרים. ואכן, מח עצם שמקורו בתאי הגזע המזנכימליים מגויס בקלות לאתרים נוספים שבהם הם יכולים להתמיין לתאים תומכי סרטן.

התחל בזריעת שמונה צלוחיות בגודל 175 סנטימטר רבוע עם 3 מיליון תאים של 143B כל אחת. תרבית התאים באמצעות מדיום מדולל EV למשך 36 עד 48 שעות. כאשר התאים מתכנסים ב-80 עד 90%, אספו את הסופרנטנטים משמונה הצלוחיות לבידוד EV.

לאחר מכן, השתמשו בצנטריפוגה דיפרנציאלית כדי להסיר את כל התאים ואת פסולת התאים מהסופרנטנט. זה מורכב מצנטריפוגות חוזרות ונשנות בארבע מעלות צלזיוס, עם תאוצה והאטה מקסימלית. אחרי כל שלב של צנטריפוגה, אספו את הסופרנטנט, והשאירו מאחור מיליליטר אחד של הסופרנטנט בצינור הצנטריפוגה.

כעת, טען סופרנטנט שנוקה מראש לתוך צינורות אולטרה-צנטריפוגה ב-38.5 מיליליטר לשפופרת. לאחר מכן, בודדו את הרכבים החשמליים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה ב-70,000 גרם למשך שעה, עם הפסקה איטית ובארבע מעלות צלזיוס. לאחר האולטרה-צנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט והשאיר אחריו כמיליליטר אחד.

לאחר מכן, השעו מחדש את הכדורים המכילים EV בנפח הנותר. אסוף את כל ההשעיות. ולשטוף את המתלים המאוגדים עם PBS.

מלאו את הצינור ל -38.5 מיליליטר. לאחר מכן, חזור על מחזור האולטרה-צנטריפוגה, אך אל תשתמש בהפסקה. הרוטור אמור להפסיק להסתובב לאחר כשעה.

לאחר מכן, הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה, והשאיר 100 עד 200 מיקרוליטר תמיסה. לבסוף, השעו מחדש את גלולת ה-EV, והתאימו את הנפח הסופי ל-200 מיקרוליטר עם PBS. לאחר מכן ניתן לאפיין את ה-EVs על ידי TEM, לתייג אותם בצבעים לניסויי קליטה, או להשתמש בהם כדי לחנך תאי גזע מזנכימליים לניסויים in vivo.

זה חיוני שה-MSCs העיקריים יהיו בצפיפות התאים הנכונה לפני חשיפה ל-EVs סרטניים. התא צריך להיות בסביבות 70% מתכנס כדי להשיג יחס EV תא אופטימלי, וגם כדי למנוע צמיחת יתר במהלך תקופות חינוך. ניסוי זה משתמש בעכברי Athymic Nude-Foxn1nu בוגרים שעברו אקלום.

יום אחד לפני ההליך הכירורגי, יש לספק אקמול דרך מי השתייה. ביום הניתוח, הכינו 143B תאים ב-200,000 למיקרוליטר ב-PBS. 20 דקות לפני הניתוח, יש לספק לבעל החיים בופרנורפין.

רגע לפני ההרדמה, טען מזרק של 10 מיקרוליטר עם תאי 143B המרוכזים. לאחר אישור הרדמה נכונה ומריחת משחת עיניים, מקם את בעל החיים על גבו כשרגליו האחוריות לכיוון המפעיל. לאחר מכן, אבטח מסכת הרדמה לבעל החיים.

לאחר מכן, כופפו את ברך שמאל ונגבו את העור בשלושה פילינגים לסירוגין של 70% אתנול ופובידון יוד, ולאחר מכן מרחו 2% לידוקאין כמשכך כאבים מקומי. כעת, בצע חתך קטן בעור ממש מתחת לברך כדי לחשוף את השוקה. לאחר מכן, בעזרת מקדחה מיקרו-טוויסט של 0.8 מילימטר, צור חור בשוקה, כ-2 מילימטרים מתחת לברך.

הימנע מקידוח בשתי קליפות השוקה. המשך על ידי הזרקה איטית של מיקרוליטר אחד של תאים לתוך החור במשך כחמש שניות. לאחר מכן, סגור את החור עם טיפת דבק רקמות כדי למנוע זרימה חוזרת של המתלה.

השלם את הניתוח על ידי סגירת העור עם תפרים וטיפה אחת של דבק רקמות. אפשר לבעל החיים להתאושש בחימום, וטפל בו באקמול למשך 24 שעות. יומיים לאחר מכן, השתמש במזרק אינסולין 0.5 מילימטר כדי להזריק את ה-MSCs לווריד הזנב.

ניתן לאשר ויזואלית מתן נכון במהלך הזרקת וריד זנב. אם מופיע אזור לבן, או אם אתה נתקל בהתנגדות, אנא הזריק שוב באזור מעל אתר ההזרקה הקודם. לאחר מכן, פעמיים בשבוע, עקוב אחר צמיחת הגידול באמצעות ביולומינסנציה.

הזריקו לעכברים D-luciferin דרך מזרק אינסולין, וכעבור 10 דקות מדדו את שטף הפוטונים שנוצר מתאי הגידול באמצעות מערכת הדמיה. כאשר קוטר הגידול של בעל חיים הופך לגדול מ-15 מילימטרים, או שהירידה במשקל שלו עולה על 15%, המתת חסד של החיה ואיסוף כל הרקמות הרלוונטיות. 10 דקות לפני המתת חסד, יש להזריק D-לוציפרין, כפי שנעשה לפני ההדמיה.

לאחר המתת חסד, אספו את הריאות, הכבד, הטחול והכליות, בעזרת מספריים ופינצטה מעוקרים. שוטפים את הדם מהאיברים באמצעות PBS, ומסדרים אותם על צלחת פטרי להדמיה. באמצעות מערכת הדמיה ביולומינסנציה, תעד את שני צידי האיברים.

לאחר צילום התמונות, תקן מיד את האיברים לניתוח היסטולוגי עתידי. כדי לעבד את מסמכי הצילום, פשוט החל סף ידני וספור את מספר הגושים בכל תמונה. הקפידו להשתמש באותו סף עבור כל תמונה, ולתעד את הרקמות מכל כיוון, במיוחד הריאות.

לאחר הסרת השוקה של העכבר, המשך בהתייבשות והטמעת פרפין. לאחר מכן, השתמש במיקרוטום כדי להכין קטעי פרפין של שישה מיקרון, ואסוף את החלקים על שקופיות זכוכית. לאחר שהמגלשות התייבשו, אחסן אותן למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

למחרת, בצע אחזור אנטיגן בתיווך חום, באמצעות מאגר ציטראט. לאחר מכן, צבעו את הרקמות בנוגדנים נגד GFP ב-1 עד 900, ולאחר מכן עם צביעת נגד DAPI. לבסוף, תעד את קטעי הרקמה המוכתמים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

הטוהר של EVs מבודדים אושר על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. התכשירים הכילו שלפוחיות בקוטר של 40 עד 100 ננומטר. כדי להעריך אם EVs סרטניים מקיימים אינטראקציה עם MSCs, ה-EVs סומנו בצבע קישור ליפופילי פלואורסצנטי ירוק, והודגרו למשך הלילה עם MSCs.

כך אושרה קליטה יעילה של EV על ידי MSCs. תכונה אימונומודולטורית של EVs על MSCs אושרה באמצעות בדיקה אימונולוגית של ציטוקינים מבוססי B מרובים. EVs גידול גרמו לייצור מוגבר של IL-8 ו-IL-6 ב-MSCs, בהשוואה ל-EVs בקרה פיברובלסטים אנושיים.

לאחר מכן, במודל עכברי קסנוגרפט אורתוטופי של אוסטאוסרקומה, הוכח כי עכברים שטופלו ב-MSCs בעלי השכלה חשמלית האיצו את צמיחת הגידול. ארבעה ימים לאחר הזרקה מערכתית של MSCs המבטאים GFP, זוהו תאים המבטאים GFP במח העצם וברקמת הגידול, והדגימו MSC ביות לאתר הגידול. הדמיה מחוץ לגוף של איברים שונים הדגישה את היווצרות קשריות הריאה.

בסופו של דבר, לעכברים שקיבלו MSCs בעלי השכלה חשמלית היו יותר גרורות בריאות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחנך תאי סטרומה עם EVs סרטניים ex vivo, ולחקור את ההשפעות של תאי סטרומה מלומדים in vivo באמצעות מודלים פרה-קליניים של עכברים. לאחר שליטה, ניתן לבצע הליך זה תוך ארבעה שבועות, בתנאי שיש מספיק EVs לסרטן זמינים.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לתכנן מראש ולקבל טיהור ניתן לשחזור של שלפוחיות חוץ-תאיות סרטניות, כמו גם להשתמש בתאי גזע מזנכימליים המתרבים במעבר נמוך.