איפיון תאים סרטניים באמצעות חוט רפואי עבור לכידת מחזורי תאים סרטניים: בגישה 3D בהתבסס על Immunofluorescence ודגים דנ א
21 בדצמבר 2017
אנו מציגים גישה חדשה כדי לאפיין תאים סרטניים. אנו משלבים immunofluorescence עם ה-DNA פלורסנט -מקומיים-הכלאה כדי להעריך את התאים שנתפסו על ידי חוט רפואי functionalized מסוגל ויוו מעשיר CTCs ישירות מדם החולה.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לשלב צביעה אימונופלואורסצנטית עם הכלאה פלואורסצנטית של DNA באתרה על חוט פונקציונלי תלת מימדי ולזהות אותות אימונופנוטיפ ו-FISH על התמיכה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי בשדה רחב. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אפיון תאי גידול כגון זיהוי מטרות הקשורות לטיפול בתאי סרטן ריאה של תאים לא קטנים במחזור הדם. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא מתן אפשרות לזיהוי בו זמנית של פרמטרים פנוטיפיים כגון חיובי EpCAM ושינויים ציטוזומטיים כגון מצב גן ARC לאיתור CTCs משוערים.
למרות ששיטה זו תוכננה באופן ייחודי לספק תכונות CTC של סרטן אינסולין באתר, ניתן ליישם אותה גם לחקר סרטן אחר כמו סרטן השד. פיתחנו פרוטוקול זה תוך כדי טיפול בחוט לאימונופנוטיפ ישיר וזיהוי CTC. כדי להשיג נתונים נוספים, קישרנו פרוטוקול אימונופנוטיפ עם פרוטוקול הכלאה של פלואורסצנטיות DNA באתר.
הטיפול בחוט אינו קל, בעיקר מכיוון שהקצה הפונקציונלי שביר. הדגמה חזותית תגרום לקוראים לשחזר את השלבים. כדי להתחיל בניסוי, השעו מחדש את כל תכולת בקבוק T75 שנמצא במפגש של 80% בבקבוקון של חמישה מיליליטר באמצעות ארבעה מיליליטר של מדיום שלם.
לאחר מכן, הסר את החוט מאריזת הזכוכית שלו. טבלו את חלק הזהב הפונקציונלי של החוט לתוך הבקבוקון, וודאו שפקק החוט מתאים למים לבקבוקון של חמישה מיליליטר. אטום את החוט בסרט מעבדה.
לאחר מכן, דגרו את החוט במסובב צינור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסיבוב יש לשטוף את החוט שלוש פעמים בתמיסת PBS מתקפלת אחת באמצעות שלושה בקבוקונים נקיים שונים ולהמתין לייבוש החוט. לאחר ייבוש החוט באוויר למשך 10 דקות במכסה המנוע, תקן את התאים על ידי טבילת החוט בתמיסת 100% אצטון בצינור של חמישה מיליליטר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
ודא שאין זכר לאצטון בקצה הפונקציונלי. יבש את החוט באוויר במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצינור של חמישה מיליליטר, שטפו את החוט פעמיים ב- PBS קיפול אחד.
דגרו את החוט במאגר דילול נוגדנים. הכן 150 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים עם דילול של נוגדן ראשוני חד שבטי מצומד עם פלואורוכרום ומאגר דילול נוגדנים המצוין בגיליון הנתונים. לאחר מכן, השתמש בקצה P200 כדי לחלץ את החוט מפקק החוט והכנס בעדינות את החוט דרך החור הגדול יותר של הקצה.
הכנס תחילה את הקצה הלא פונקציונלי ומשוך לאט את החוט דרך החור הקטן יותר עד שחלק הזהב נמצא ממש מעבר לחור הגדול יותר. מוסיפים בעדינות 150 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים לקצה. כדי למנוע את הסיכון להיווצרות בועות, סובב בעדינות את החוט עד שהקצה הפונקציונלי צולל לחלוטין.
אטום את החור של הקצה ועטוף את סרט המעבדה סביב החור. דגרו את החוט אנכית למשך הלילה בחושך בארבע מעלות צלזיוס. ביום השני, חסום את דגירה של הנוגדנים על ידי שטיפת החוט פעמיים ב-PBS כפול
.הכנס מחדש את החוט לפקק החוט שלו. שלוש שעות לפני פרוטוקול DNA-FISH, כוונו את תנור ההכלאה ל-75 מעלות צלזיוס והגדירו את תנור החום היבש ל-37 מעלות צלזיוס. יש לקרר את תמיסת ה-SSC פי 0.4 לארבע מעלות צלזיוס.
שטפו את החוט שלוש פעמים בתמיסת SSC קרה כקרח פי 0.4. יבש את החוט בחושך מתחת לארון מכסה המנוע למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, מערבולת וסובב את הגשושית למשך חמש שניות.
זרוק 10 מיקרוליטר מהגשושית למיקרו-צינורות זכוכית, ואז כסה אותם בסרט מעבדה. עטפו את המיקרו-צינורות בנייר סופג יבש. מניחים בצינור של 50 מיליליטר וסובבים אותם קצרות.
הנח בזהירות את החוט המיובש לתוך המיקרו-צינור והכנס את פקק החוט. לאחר מכן, אטום את פקק החוט במלט גומי. הכניסו את החוט לתא לח כהה בתנור ההכלאה למשך שמונה דקות בחום של 75 מעלות צלזיוס כדי לקבל דנטורציה מלאה של DNA.
לאחר שמונה דקות, העבירו את החדר הלח לתנור חום יבש בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הנח את צנצנת הצביעה עם תמיסת SSC פי 0.4 לתוך אמבט מים בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס. בדוק את טמפרטורת תמיסת ה-SSC פי 0.4 עד שהיא מגיעה ל-72 פלוס מינוס מעלה צלזיוס.
לאחר מכן, הכינו שתי כוסות זכוכית. אחד עם SSC כפול בתוספת תמיסת טווין של 0.05% והשני עם מים מזוקקים. הסר את החדר הלח לתנור החום היבש.
השתמש בפינצטה כדי להסיר בזהירות את מלט הגומי מפקק החוט, ומשוך את הקצה הלא מצופה של החוט דרך פקק הקצה, והקפיד לא לפגוע בקצה הפונקציונלי. טובלים את החוט בתמיסת SSC פי 0.4 למשך שתי דקות בחום של 72 מעלות צלזיוס. שטפו את החוט בתמיסת SSC כפולה בתוספת 0.05% Tween למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, שטפו את החוט במים מזוקקים בטמפרטורת החדר. יבש את החוט מתחת למכסה האדים למשך 10 דקות בחושך. דגרו את קצה החוט הפונקציונלי עם תמיסת DAPI שהוכנה בעבר בבקבוקון של שני מיליליטר.
שוטפים את החוט פעמיים ב- PBS בקיפול אחד ומייבשים את החוט באוויר. מקם את החוט במחזיק החוט והכנס בזהירות את הקצה הפונקציונלי דרך נקודת הכניסה של המחזיק המיוחד עד שהקצה יתאים לנקודת הצימוד. הנח את המחזיק המיוחד על במת המיקרוסקופ.
כוונן את מיקוד המיקרוסקופ באמצעות עדשה פי 20. ראשית, התמקד בגסות בתמיכה המיוחדת ולאחר מכן התאם היטב על תאים שנראים בהירים בערוץ DAPI. מקד רק את התאים המרכזיים בעדשה ורכוש תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית של 12 סיביות במטרות של 20x ו-40x עם מסננים מתאימים לבדיקות אדומות, ירוקות וכחולות.
לבסוף, הכינו את החוט לאחסון לטווח הארוך על ידי אריזת החוט ליד הקצה הפונקציונלי והכנסו בזהירות את החוט לצינור זכוכית. אחסן את החוט אנכית או אופקית בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. צביעה אימונופלואורסצנטית לא הפריעה לאותות DNA-FISH.
כאשר בדיקת ה-Immuno-DNA-FISH בוצעה על חוט התמיכה התלת-ממדי, צביעת EpCam נראתה בבירור. בדיקת ALK חשפה את מחיקת הגן. קו התאים NCI-H3122 הראה סטטוס חריג של גן LAK בניגוד ל-NCI-H1975 עם ALKG מסוג פראי.
לאחר שליטה, ניתן לבצע פרוטוקול זה בתשע שעות עבודה בסך הכל במשך שלושה ימים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לא לגעת בחלק הפונקציונלי של החוט כדי למנוע נזק. ניתן להשתמש בנוגדנים שונים ובבדיקות FISH בעקבות פרוטוקול זה כדי לענות על שאלות נוספות כגון זיהוי תאים עם סמנים פנוטיפיים אחרים ושינויים ציטוגנטיים אחרים כגון הגברת גנים NAT או HAR2.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות CTCs משוערים בו זמנית באמצעות פרמטרים פנוטיפיים כגון חיובי EpCAM ולזהות שינויים ציטוגנטיים כגון מצב גן ARC. אל תשכח שעבודה עם אצטון ותנור עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון ידית אצטון במכסה המנוע ולבישת כפפות מגן בעת ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשה לאפיון תאי גידול על ידי שילוב אימונופלואורסצנציה עם היברידציה in situ פלואורסצנטית של DNA (FISH). הגישה משתמשת בחוט רפואי מתפקד כדי להעשיר תאי גידול מסתובבים (CTCs) ישירות מדם של חולה, ומסייעת בזיהוי מאפיינים אימונופנוטיפיים וגנטיים מרכזיים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אונקולוגיה
- ביולוגיה של תאים
- שיטות אבחון
רקע
- אפיון תאי גידול מסתובבים חיוני לאבחון וטיפול בסרטן.
- שיטות נוכחיות לעיתים קרובות חסרות את היכולת להעריך בו זמנית מספר פרמטרים.
- מחקר זה נועד לשפר את זיהוי ותחליל של CTCs בסרטן ריאות שאינו קטן-תאים.
- הפרוטוקול יכול גם להתאים לסוגי סרטן אחרים, כגון סרטן השד.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול המשלב אימונופלואורסצנציה ו-DNA-FISH לאפיון CTC.
- לזהות מטרות הקשורות לטיפול ב-CTCs.
- לשפר את ההבנה של ביולוגיה של תאי גידול באמצעות ניתוח בו זמני של מאפיינים פנוטיפיים וגנטיים.
שיטות ששימשו
- חוט מתפקד ללכידת CTCs מדגימות דם.
- צביעת אימונופלואורסצנציה להערכת האימונופנוטיפ.
- DNA-FISH לניתוח שינויים גנטיים.
- מיקרוסקופיה להדמיה ואיסוף נתונים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של CTCs עם מאפיינים אימונופנוטיפיים ספציפיים.
- גילוי שינויים גנטיים הקשורים למאפייני הגידול.
- הוכחת היתכנות השיטה עבור סוגי סרטן שונים.
- הפרוטוקול מאפשר שחזור וקלות שימוש בתנאי מעבדה.
מסקנות
- השיטה המשולבת של אימונופלואורסצנציה ו-DNA-FISH יעילה לאפיון CTC.
- גישה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביולוגיה של הגידול ומטרות טיפול.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לסוגי ממאירות אחרים מעבר לסרטן ריאות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method addresses the critical challenge of rare circulating tumor cell (CTC) detection by enabling high-volume blood sampling and simultaneous phenotypic and genetic analysis. By integrating immunofluorescence and DNA FISH on a 3D functionalized wire, it provides a scalable approach for CTC enrichment and characterization directly from peripheral blood. The workflow supports early discovery efforts by delivering multiplexed data on cell surface markers and chromosomal alterations, informing target validation and patient stratification strategies in oncology drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic targets through simultaneous detection of EpCAM positivity and ALK gene translocation in captured CTCs.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by correlating phenotypic markers with cytogenetic alterations in a single workflow.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing multiplexed data on putative CTCs for hypothesis-driven target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by capturing CTCs from large blood volumes (1.5–3 L) via 30-minute wire incubation.
- Reproducibility: Standardizes CTC isolation and immuno-DNA FISH processing on a 3D support, enabling consistent phenotypic and genetic readouts.
- Quantitative Output: Generates measurable immunofluorescence and FISH signals detectable via conventional widefield fluorescence microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated feasibility in NSCLC cell lines (NCI-H3122 and NCI-H1975) for EpCAM and ALK status, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking CTC phenotype to genotype in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in CTC characterization by co-localizing protein expression and gene status on individual cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, offering a reusable capability for CTC analysis across oncology indications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling simultaneous phenotypic and genetic profiling of rare CTC populations.
- Screening: Delivers assay-ready CTC samples with standardized isolation and staining protocols for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts (EpCAM intensity, ALK FISH signals) that allow comparative analysis across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through disease-relevant CTC characterization in NSCLC models.
- Enterprise Reuse: Functions as a platform technology adaptable to multiple cancer types (e.g., breast cancer) and diverse antibody/FISH probe combinations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CTC biomarker studies by reducing mechanistic ambiguity through correlated phenotyping and genotyping.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability via a wire-based system compatible with conventional microscopy and standard reagents.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering multiparametric CTC data that inform target specificity and patient selection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on CTC phenotype-genotype concordance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, DNA FISH, and delicate handling of functionalized wire tips to prevent damage.
- Depends on access to a conventional widefield fluorescence microscope with appropriate filter sets for DAPI, FITC, and Cy3/Cy5 equivalents.
- Necessitates cross-team standardization of wire preparation, incubation, and imaging protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to different cancer types or alternative phenotypic/genetic markers.
- Includes practical limitations such as the fragility of the wire’s functionalized tip and the need for hazardous material precautions (acetone, ovens).
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:34
Immuno-DNA FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) on Wire
2:35
Fixation, Permeabilization, and Immunofluorescence
4:25
3D DNA FISH Day 2
6:08
3D DNA FISH Day 3
7:51
3D Microscope Observation and Analysis
9:01
Results: No Interference Bewteen Immunofluorescence and DNA FISH Signals
9:38
Conclusion
