שיטה פשוטה ומהירה להשיג גידול איכותיים הדנ א של דגימות קליני-פתולוגיים באמצעות מגע ההטבעה ציטולוגיה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשיג DNA גידול באיכות גבוהה מדגימות קליניות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדע הבסיסי והקליני כגון חקר סרטן, אבחון והחלטות טיפול. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שאנו יכולים להשיג DNA של גידול בצורה פשוטה ומהירה יותר מאשר בשיטות קודמות.

כדי להתחיל בפרוטוקול, גע במשטח הגידול של רקמה שהוכנה ונכרתה בעבר על מגלשת זכוכית רגילה מספר פעמים בידיים עטויות כפפות. ודא חזותית שהאזור שנגע בו מכסה יותר מ-80% ממגלשת הזכוכית. לחץ קלות על מגלשת הזכוכית הרגילה כנגד מגלשת פוליאתילן נפתלט או קרום PEN ושפשף אותה בעדינות פעמיים-שלוש בידיים עטויות כפפות.

אשר חזותית שהתאים מועברים ממגלשת הזכוכית הרגילה לשקופית קרום PEN. יבש באוויר את מגלשות הזכוכית והקרום PEN למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הייבוש יש להכתים את שקופית הזכוכית הרגילה לבדיקה ציטולוגית ישירה.

טבלו את שקופיות הזכוכית בתמיסה מקבעת למשך חמש שניות ולאחר מכן צבעו בתמיסת צביעה של Giemsa למשך 15 שניות. העריכו וסקרו את תוכן הגידול והתאית על שקופית הזכוכית הרגילה לחלוטין עם מיקרוסקופ להערכה מהירה. הערכת תאי גידול על סמך מספר קריטריונים.

אם הדגימה מראה תאיות גידול מעל 60% על ידי הערכה מיקרוסקופית מהירה מהסעיף הקודם, חתוך את הסרט הנוגע בגידול של שקופיות קרום PEN למיצוי DNA בעזרת סכין וכפפות. העבירו את הסרט החתוך לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי עם סט סיכות וידיים עטויות כפפות. אחסן את צינור המיקרו-צנטריפוגה המכיל סרט בארבע מעלות צלזיוס עד למיצוי ה-DNA.

פתח את התוכנה ותכנן את מצב ההפעלה והגדר את פרמטר ההפעלה בתוך התוכנה. לחץ על הכרטיסייה תוכנית ובחר תבנית, ולאחר מכן בחר את שיטת ההפעלה המתאימה. בחר את סוג היישום והטכניקה ולחץ על הבא.

בחר את המכשיר, ערכת הכנת הדגימה, סוג ערכת הספרייה, ערכת התבנית, ערכת הרצף, אופן כיול הבסיס, סוג השבב, רצף הבקרה וערכת הברקודים ולחץ על הבא. בחר תוספים ולחץ על הבא. בחר פרויקט ולחץ על הבא.

לאחר מכן בחר קובצי הפניה ו-BED של ברירת המחדל של אזור היעד. הקלידו את שם הדוגמה, בחרו את הברקוד ולחצו על 'תוכנית הפעלה'. לאחר מכן, בצע הכנת תבנית וטעינת שבבים במכשיר אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.

הפשירו את מחסנית המגיב בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות לפני השימוש. לדלל את הספרייה הלא מדוללת במים נטולי גרעינים בהתאם לריכוז הספרייה המחושב בשלב 6.8 וליצור 20 ספריות פיקומולריות. הכן ספרייה מאוגדת לריצוף ואחסן אותה על קרח.

הוסף 25 מיקרוליטר מהספרייה המאוגדת עם פיפטה של 100 מיקרוליטר לתחתית צינור הדגימה. הפעל את החשמל ופתח את מכסה המכשיר האוטומטי. הנח את שבב הרצף, מתאם השבב, מחסנית ההעשרה, מחסנית הקצה, לוחית ה-PCR, אטם מסגרת ה-PCR, צינור השחזור, מחסנית התמיסה ומחסנית הריאגנט למיקום המתאים של המכשיר האוטומטי.

גע בהגדרה, הפעל וצעד אחר צעד על המסך. סגור את המכסה וגע בבדיקת התחל במסך. לאחר תהליך סריקת הסיפון, גע בהבא.

בדוק את תכולת התצוגה, סוג הערכה, מזהה השבב, מזהה המדגם, סוג השבב, התוכניות. הגדר את השעה וגע באישור. לאחר סיום טעינת השבבים, גע בהבא ופתח את המכסה. פרק את שבב הרצף ממתאם השבב בידיים עטויות כפפות.

מניחים את השבב במיכל השבב, עוטפים אותו בפרפילם ומאחסנים את השבב בארבע מעלות צלזיוס עד לתגובת הרצף. לאחר מכן הסר את מחסנית ההעשרה, לוחית ה-PCR, אטם מסגרת ה-PCR, צינור השחזור, מחסנית התמיסה ומחסנית הריאגנט מהמיקום המתאים של המכשיר האוטומטי בידיים עטויות כפפות. העבר מחסנית קצה ריקה למצב קצה הפסולת של המכשיר האוטומטי בידיים כפפות.

גע בהבא וסגור את הכיסוי. לאחר מכן גע בהתחל ונקה את המכשיר האוטומטי עם קרניים אולטרה סגולות למשך ארבע דקות. ממיסים טבלית נתרן כלוריט ב -1,000 מיליליטר מים טהורים במיוחד ומסננים את התמיסה בעזרת פילטר 0.22 מיקרון.

לאחר שמכשיר הריצוף התחמם, גע בנקי והבא על המסך של מכשיר הרצף. נקה את מכשיר הריצוף עם 250 מיליליטר של תמיסת נתרן כלוריט מעוקרת בפילטר, ולאחר מכן 250 מיליליטר מים טהורים במיוחד. לאחר מכן גע באתחול ובחר את ערכת הרצף המתאימה על המסך.

התקן שולח אפור עם ידיים עטויות כפפות. אתחל את מכשיר הרצף עם תמיסת הכביסה, תמיסת התאמת ה-pH ותמיסת תקן ה-pH. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של נוקלאוטידים DATP, DGTP, DCTP ו-DTTP בצינורות של 50 מיליליטר עם פיפטה של 100 מיקרוליטר.

התקינו שולח אפור במיקום המתאים עם ידיים עטויות כפפות. טען את צינור ה-50 מיליליטר והברג אותו על מכשיר הרצף. בחר הבא במסך כדי להתחיל את שלב האתחול.

לאחר השלמת שלב האתחול, גע בהפעלה על המסך ובחר את מכשיר הכנת הספרייה המתאים. סרוק את הברקוד הדו-ממדי של השבב. הכנס את שבב הרצף למיקום המתאים.

סגור את מהדק השבב ואת דלת המכשיר וגע בבדיקת השבבים, הבא ואישור על המסך כדי להתחיל את ריצת הרצף. לאחר תגובת הרצף, העבר את הנתונים ובצע צינור ניתוח נתונים בשרת הרצף. כמויות ה-DNA המוחלטות וערך ה-RQ, אינדיקטור לרמת הפירוק של ה-DNA הגנומי, מראים כי תפוקת DNA גבוהה יותר מושגת באמצעות דגימות ה-TIC בהשוואה לדגימות FFPE.

בנוסף, ערכי ה-RQ מה-DNA של TIC היו גבוהים משמעותית בהשוואה לזה של ה-DNA FFPE על פני סוגי גידולים שונים. APC Q1367* זוהה הן ב-FFPE והן ב-TIC DNA שחולץ מאתר אחד ו-APC S1356*KRAS G12D, ו-TP53 M237i זוהו הן ב-FFPE והן ב-TIC DNA שחולץ מאתר 2, 3 ו-4, מה שמרמז על כך שהמוטציות הסומטיות הזהות זוהו בדגימות DNA מזווגות של FFPE ו-TIC שהוכנו מאותו אתר גידול. יש לציין כי אותן מוטציות סומטיות התגלו בין סרטן המעי הגס הראשוני לשתי דגימות סרטן כבד גרורתי, מה שמרמז על כך ששיבוטי הגידול מאתר 2 שלחו גרורות לכבד.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחקר המולקולרי והרפואי לזהות סרטן גנטי.