להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

המטרה הכוללת של מתודולוגיית תיוג כפולה זו היא לצפות באזורי ליגנינג פעילים של רקמות הצמח. בזרימת עבודה זו, אסטרטגיית המדווח הכימי מיושמת באמצעות שני מדווחים כימיים נפרדים בשילוב עוקב של תגובות כימיות קליקים ביו-אורתוגונליות. שיטה זו יכולה לעזור לפענח שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הצמח כגון קביעת אילו גורמים מווסתים את ההיווצרות המרחבית או הזמנית של ליגנין בתוך צמחים וקירות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מכוונת אך ורק לליגנין המיוצר במהלך שילוב מטבולי. זה מבדיל אותו מכל ליגנין קיים בדגימה. אף על פי שפיתחנו במקור את השיטה הזו כדי לחקור דגלי ליגניזציה, אפשר להשתמש בה עם מינים אחרים כמו ארבידופסיס, צפצפה, או למעשה כל צמח אחר שמייצר ליגנין.

כדי להציג את הטכניקה הזו יש לנו את קלמנס סיימון, שהוא דוקטורנט שעובד על הממשק בין כימיה וביולוגיה ומשתמש בטכניקה זו כדי לחקור דינמיקת ליגניזציה. ראשית, הכינו תמיסת דיווח כימית של 300 מיקרוליטר המכילה עשרה מיקרומולר של מדווח G מתויג אלקין. ועשרה מיקרומולר של מדווח H מתויג אזיד ומדיום נוזלי סטרילי 1/2 MS.

מערבל את התמיסה ומעביר אותה לבאר אחת של צלחת 48 בארות עם פיפטת העברה. הכן תמיסת בקרה שלילית של 300 מיקרוליטר המכילה עשרה מיקרומולר של G ועשרה מיקרומולר של H ומדיום סטרילי נוזלי 1/2 MS. מערבל את התמיסה ומעביר אותה לבאר שנייה מאותה צלחת של 48 בארות.

בעזרת סכין גילוח נקי חותכים את הגבעול של צמח פשתן בן חודשיים בעשרה סנטימטרים מעל פני האדמה. הכינו בחריצות 50 חתכים רוחביים ביד חופשית של הגבעול באמצעות סכין הגילוח והניחו אותם מיד בתווך של 1/2 אלפית השנייה. לאחר מכן, בחר חתכים שלמים ושלמים וחלק באופן אקראי עשרה מהם בבאר המלאה בתמיסת המדווח הכימית, תוך הקפדה לא לפגוע ברקמה.

יש לחתוך את חתכי הרוחב בצורה יציבה ונקייה וחתך הרוחב צריך להיות ישר. אתה צריך יד יציבה וסכין גילוח חד כדי לשמור על הרקמות שלמות. מומלץ להתאמן מראש.

לאחר חלוקת עשרה חתכים שלמים בתמיסת הבקרה השלילית, דגרו את הצלחת באור רציף בתא גידול בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות. למחרת, הסר את התמיסה המונוליגנלית בכל באר בעזרת מיקרופיפטה. מוסיפים 500 מיקרוליטר בינוני של 1/2 MS בינוני לכל באר ומערבבים בעדינות במשך עשר דקות.

לאחר מכן, הסר את תמיסת השטיפה בעזרת מיקרופיפטה. הכן מיליליטר אחד של תמיסת ציקלו-תוספת אזיד-אלקין המקודמת על ידי זן. מכיל חמישה מיקרומולר של צבע פלואורסצנטי מתויג ציקלוקטן ומדיום נוזלי סטרילי 1/2 MS.

לאחר מכן, מערבול את הפתרון. לאחר שלבי הכביסה האחרונים של פרוטוקול השילוב המטבולי, הסר את המדיום 1/2 MS והוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת SPAAC לכל באר עם מיקרופיפטה. הגן על צלחת 48 הבארות מפני אור על ידי הנחתה בקופסה.

לאחר מכן, מערבבים בעדינות את הצלחת על שייקר מכני למשך שעה בחושך בטמפרטורת הסביבה. לאחר מכן, יש לשטוף כל באר ארבע פעמים עם 1/2 MS בינוני כפי שתואר קודם לכן, תוך שמירה על הצלחת בחושך. הכן מיליליטר אחד של תמיסת ציקלו-תוספת אלקין אזיד מזורזת נחושת המכילה נתרן אסקורבט, נחושת גופרתית וצבע פלואורסצנטי מתויג אזיד, ומדיום נוזלי סטרילי 1/2 MS.

ואז מערבל את התמיסה. לאחר הסרת המדיום 1/2 MS, הניחו את הצלחת בקופסה והוסיפו 300 מיקרוליטר מתמיסת CuAAC לכל באר בעזרת מיקרופיפטה. מערבבים בעדינות את הצלחת על שייקר מכני למשך שעה בחושך בטמפרטורת הסביבה.

הסר את הצלחת מהשייקר המכני והסר את תמיסת ה-CuAAC מכל באר בעזרת מיקרופיפטה. לאחר מכן, מוסיפים 500 מיקרוליטר של 1/2 MS בינוני ומערבבים את הצלחת על השייקר המכני למשך עשר דקות בחושך. לאחר שטיפה פעמיים נוספות עם מדיום 1/2 MS, הוסף 500 מיקרוליטר של מתנול 7:3 ותמיסת מים לכל באר.

מערבבים את הצלחת על השייקר המכני למשך שעה בחושך. לאחר מכן, הסר את התמיסה מהבארות. לאחר מכן, מוסיפים 500 מיקרוליטר של 1/2 MS בינוני לכל באר ומערבבים בחושך במשך עשר דקות.

לאחר חזרה על כביסה זו ארבע פעמים, שמור את חתכי הרוחב מאוחסנים במדיום של 1/2 אלפיות השנייה, מוגנים מפני אור. הנח חמש טיפות של מדיום הרכבה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית. לאחר מכן, הפקידו בזהירות כל חתך מתויג על ידי מדווח כימי על השקופית.

מרחו לק על שני צדדים מנוגדים של השקופית. מכסים את השקופית בהחלקת כיסוי, תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר. לאחר מכן, הסר עודף אמצעי הרכבה באמצעות מגבת נייר.

לאחר מכן, אטמו את הדגימה עם לק מכל ארבעת הצדדים. לאחר שהלכה לציפורניים מתייבשת, אחסן את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד לתצפית במיקרוסקופ קונפוקלי. לקטעי הצמח יש נטייה להיות פריכים כשהם מתייבשים.

הקפידו לשמור אותם תמיד בתמיסה ולאטום את החלקות הכיסוי עם לק מכל הצדדים. זה מגדיל את חיי המדף של המגלשות המותקנות. הנח את שקופית הדגימה על המיקרוסקופtagה מתחת לעדשת האובייקטיב.

התבונן וסובב את הדגימה כדי לזהות את האזור הרצוי של רקמת הצמח. לאחר מכן, בחר את המישור הפלואורסצנטי ביותר בציר Z. כוונן את ההגבר, ההיסט ועוצמת הלייזר כדי להשיג את התפלגות האות האופטימלית לאורך כל טווח הרמה האפורה עבור כל ערוץ.

לבסוף, רכשו תמונות קונפוקליות באיכות גבוהה. BLISS מספק שלוש מפות לוקליזציה צבעוניות של ליגנין בתוך דפנות תאי הצמח, מכוון אך ורק לליגנין המיוצר בנובו במהלך שילוב מטבולי ומבדיל אותו מהליגנין הקיים קודם לכן בדגימה. הוא מדגיש את אתרי הליגניזציה הפעילים בתוך רקמות שונות של איבר בתוך סוגי תאים שונים של רקמה, או בתוך שכבות דופן או תת-מבנים שונים של תא.

פרופילי השילוב של מדווח G מתויג אלקין ו-H מתויג אזיד מהקמביום לליבה בתוך הקסילם המשני של הפשתן מצביעים על כך שליגניזציה מקסימלית מושגת במהירות בטרכאידים סיביים במהלך ההתפתחות, בעוד שתאי גזע ממשיכים לשלב ליגנין בשלבים מאוחרים הרבה יותר של חייהם. שינוי יחס המדווח הכימי מדגים כי הרכב הליגנין ברקמות קסילם משניות תלוי ישירות בזמינות מונוליגנלית בתוך דפנות התא. ולא על ספציפיות פרוקסידאז או לקאז במהלך פילמור ליגנין.

שילוב מדווח כימי מוגבל לפינות התא ולדופן התא הראשוני של הלמלה האמצעית של חלק מסיבי הבאסט, אך לא כולם. בשורשי פשתן, המדווחים הכימיים משולבים בדפנות התאים האנדודרמליים שבהם הפס הקספרי נעדר. להדמיה טובה יותר של ארכיטקטורת רקמות, ניתן גם ליצור שחזורי מחסנית Z תלת מימדית.

בעקבות חזותי זה, ניתן לבצע גם עיבוד נתונים מקיף. כל אמצעי הזהירות שננקטו, ניתן להשיג תוצאות קבועות על ידי השוואה יחסית, קריאת מדגם בין דגימות שונות. ניתן לעשות זאת בנוסף ללוקליזציה של הובלה פעילה של תחומים שונים.

השיטה הזו היא כלי נפלא עבור ביולוגים של צמחים כמוני, שחוקרים את דופן התא. ברגע ששולטים בו, ניתן לעשות זאת תוך מספר שעות. זה מאוד רגיש וניתן ליישם אותו על מגוון שלם של מערכות מודל ניסיוני שונות במבחנה in vivo.

יישום אסטרטגיית הדיווח הכימי על ליגנין סולל את הדרך לביולוג כימי לחקור את דינמיקת הליגניזציה ולגלות מה שולט בתהליך הפילמור הזה, שבמובנים רבים עדיין מהווה טריטוריה לא ידועה.