Name: להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר! (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: חקור את שיטת התיוג הכפול BLISS לניתוח דינמיקת הליגניפיקציה בצמחים באמצעות כימיה ביו-אורתוגונלית. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של ליגנין חדש בתאי צמחים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנחנו חבים את FRABio הפדרציה מחקר ולמערכת הדמיה TisBio (אונ' Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et במכלולים des Fonctionnelle Biomoléculaires) למתן הסביבה טכני להצטיינות להשיג את זה עבודה.

<ol><li>Grammel, M., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reporters+for+biological+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical reporters for biological discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).</li>
<li>Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemistry in living systems.</a> Nat Chem Biol. 1 (1), 13-21 (2005).</li>
<li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+chemistry%3A+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chemie+%28Int+Ed.+Engl%29%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).</li>
<li>Chang, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chemie+%28Int+Ed.+Engl%29%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (22), 4030-4033 (2009).</li>
<li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+bioorthogonal+dual+strategy%3A+ManNAl+and+SiaNAl+as+distinct+tools+to+unravel+sialic+acid+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways.</a> Chem. Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).</li>
<li>Mbua, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+accumulation+and+recycling+of+glycoproteins+visualized+in+Niemann-Pick+type+C+cells+using+the+chemical+reporter+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Abnormal accumulation and recycling of glycoproteins visualized in Niemann-Pick type C cells using the chemical reporter strategy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (25), 10207-10212 (2013).</li>
<li>Anderson, C. T., Wallace, I. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+click-labeling+with+a+fucose+analog+reveals+pectin+delivery%2C+architecture%2C+and+dynamics+in+Arabidopsis+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Metabolic click-labeling with a fucose analog reveals pectin delivery, architecture, and dynamics in Arabidopsis cell walls.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1329-1334 (2012).</li>
<li>Tobimatsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+click+chemistry+strategy+for+visualization+of+plant+cell+wall+lignification%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A click chemistry strategy for visualization of plant cell wall lignification.</a> Chem. Commun. 50 (82), 12262-12265 (2014).</li>
<li>Bukowski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+clickable+designer+monolignol+for+interrogation+of+lignification+in+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a clickable designer monolignol for interrogation of lignification in plant cell walls.</a> Bioconjugate Chem. 25 (12), 2189-2196 (2014).</li>
<li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+click-compatible+monolignol+probe+to+study+lignin+deposition+in+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A versatile click-compatible monolignol probe to study lignin deposition in plant cell walls.</a> PLOS ONE. 10 (4), e0121334(2015).</li>
<li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+biochemical+and+developmental+dependencies+of+lignification+with+a+click-compatible+monolignol+analog+in+Arabidopsis+thaliana+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Investigating biochemical and developmental dependencies of lignification with a click-compatible monolignol analog in Arabidopsis thaliana stems.</a> Front Plant Sci. 7, (2016).</li>
<li>Zhu, Y., Wu, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+and+imaging+of+N-linked+glycans+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chemie+%28Int+Ed.+Engl%29%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling and imaging of N-linked glycans in Arabidopsis thaliana.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (32), 9301-9305 (2016).</li>
<li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis.</a> Annu Rev Plant Biol. 54, 519-546 (2003).</li>
<li>Weng, J. -K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+evolution+of+lignin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The origin and evolution of lignin biosynthesis.</a> New Phytol. 187 (2), 273-285 (2010).</li>
<li>Mottiar, Y., Vanholme, R., Boerjan, W., Ralph, J., Mansfield, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+lignins%3A+harnessing+the+plasticity+of+lignification%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Designer lignins: harnessing the plasticity of lignification.</a> Curr Opin Biotechnol. 37, 190-200 (2016).</li>
<li>Rinaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paving+the+way+for+lignin+valorisation%3A+recent+advances+in+bioengineering%2C+biorefining+and+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chemie+%28Int+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Paving the way for lignin valorisation: recent advances in bioengineering, biorefining and catalysis.</a> Ange Chemie (Int Ed). 55 (29), 8164-8215 (2016).</li>
<li>Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+glycoengineering+with+N-acyl+side+chain+modified+mannosamines%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chemie+%28Int+Ed.+Engl%29%22%5BJournal%5D)">Metabolic glycoengineering with N-acyl side chain modified mannosamines.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (33), 9482-9512 (2016).</li>
<li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifunctional+unnatural+sialic+acids+for+dual+metabolic+labeling+of+cell-surface+sialylated+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bifunctional unnatural sialic acids for dual metabolic labeling of cell-surface sialylated glycans.</a> J Am Chem Soc. 135 (25), 9244-9247 (2013).</li>
<li>Dumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+wall+imaging+by+metabolic+click-mediated+labelling+of+rhamnogalacturonan+II+using+azido+3-deoxy-+d+-+manno+-oct-2-ulosonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Plant cell wall imaging by metabolic click-mediated labelling of rhamnogalacturonan II using azido 3-deoxy- d - manno -oct-2-ulosonic acid.</a> Plant J. 85 (3), 437-447 (2016).</li>
<li>Niederwieser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+glycan+labeling+of+live+cells+by+a+combination+of+Diels-Alder+and+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Ange+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Two-color glycan labeling of live cells by a combination of Diels-Alder and click chemistry.</a> Ange Chemie Int Ed. 52 (15), 4265-4268 (2013).</li>
<li>Späte, A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+potential+of+norbornene-modified+mannosamine+derivatives+for+metabolic+glycoengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Exploring the potential of norbornene-modified mannosamine derivatives for metabolic glycoengineering.</a> Chem Bio Chem. 17 (14), 1374-1383 (2016).</li>
<li>Späte, A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Labeling+of+metabolically+engineered+cell-surface+glycoconjugates+with+a+carbamate-linked+cyclopropene+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Labeling of metabolically engineered cell-surface glycoconjugates with a carbamate-linked cyclopropene reporter.</a> Bioconjugate Chem. 25 (1), 147-154 (2014).</li>
<li>Lion, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLISS%3A+a+bioorthogonal+dual-labeling+strategy+to+unravel+lignification+dynamics+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">BLISS: a bioorthogonal dual-labeling strategy to unravel lignification dynamics in plants.</a> Cell Chem Biol. 24 (3), 326-338 (2017).</li>
<li>del Río, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+guaiacyl-rich+lignins+in+flax+%28Linum+usitatissimum%29+fibers+and+shives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chemist%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives.</a> J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).</li>
<li>Huis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+hypolignification+is+associated+with+extensive+oligolignol+accumulation+in+flax+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems.</a> Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).</li>
<li>Chantreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+lignification+in+the+flax+lignified+bast+fiber1+mutant+stem+is+associated+with+tissue-specific+modifications+in+gene+expression+and+cell+wall+composition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition.</a> The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).</li>
<li>Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/hfsg.2016.70.issue-9/hf-2015-0224/hf-2015-0224.xml">Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora.</a> Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).</li>
<li>Noel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+CMP-sialic+acid+donor+specificity+of+two+human+%CE%B2-d-galactoside+sialyltransferases+%28ST3Gal+I+and+ST6Gal+I%29+selectively+acting+on+O-+and+N-glycosylproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%3A+Eur+J+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human β-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins.</a> Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כאמור, הפרוטוקול אושר כפול תיוג שהוצגו במאמר זה היא אחת הדוגמאות הראשונות SPAAC/CuAAC שילוב ויוו12,23. כל שלב היה ביסודיות ממוטב לאמת ואני זה מאוד חשוב כי הסדר שבו השניים לחץ על כימיה תיוג תגובות ברצף מבוצעות מכובד (קרי, SPAAC, ואחריו CuAAC). הצלב כל-הפקדים הראה כי כל שלב תיוג היא ספציפית כאשר הפרוטוקול אושר יישומית23 : ביצוע השלב SPAAC הראשון מוביל chemoselective מאוד תיוג של HAZ אזיד פונקציות על-ידי cyclooctyne functionalized fluorophore דרך תגובה [3 + 2] cycloaddition עם קינטיקה מהר. ברגע יחידות HAZ מתויגים, השלב CuAAC המחייב הפעלה copper(I) מזורז של GALK alkynes מסוף כדי ליצור קישורים triazole על ידי תגובה עם החללית 545 אזיד-עבור חיל הים יכול להתבצע. לעומת זאת, הסדר ההפוך (קרי, CuAAC, ואחריו SPAAC) לא אמור לשמש כמו זה מוביל ליחידה GALK ו- HAZ קרוס-מצמד, אשר מתחרה עם fluorophore מצדו ומשרה ההפסד הדרמטי של האות . חשוב גם להדגיש את נחיצות השלבים כביסה ביניים כדי למנוע כתמים שאינם ספציפיים.
אנחנו הראו כי השיטה שלנו ניתן להחיל עיצובים ניסוי ביולוגיים שונים. האושר תיוג פרוטוקול הוחל לראשונה על חתכים ביד חופשית של גבעולים זרעי פשתן (כ 150-250 מיקרומטר עבה) היו בעבר לחתוך, מודגרות עם monolignols מוכן-לחץ. למרות העיצוב הזה יש את היתרון של צמצום הכמויות הדרושות של הכתב כימי (כפי הדגירה כרכים מופחתים) ושל הקלת ייצור ושכפול סטטיסטית, זה לא, אם אתה קפדן, מערכת ויוו מסוימים המקרים, אינן משקפות בהכרח בכל ההיבטים של דינמיקה lignification אמיתי-עתיים. בתכנון הניסוי השני, לכן התאמנו הפרוטוקול אושר שיטה שבה השתמשת קודם לכן כדי ללמוד שילוב של monolignols radiolabeled אורן, גינקו27. בגישה זו, השורשים ואת גזע של הצמח מופרדים פיזית, הבסיס של כל גזע מודגרת בפתרון monolignol ב מה עשוי להיות שכונה הגישה "אגרטל פרחים". לאחר שעזב את הגבעולים זמן הרצוי (הדגירה), חתכים הם גזור את הפרוטוקול אושר לבצע. זו אפשרה לנו להראות (i) כי monolignols ששונה מועברים דרך הגבעול חי, משולבים גדל ליגנין פולימרים בתוך קירות התא ואת (ii) כי התבנית לוקליזציה היה בעיקרו של דבר זהה לזו של חתך הרוחב הגישה. זה סוג של ניסוי יש בצורך מבוצע ב צמח חי ואמיתי / תא חי לגשת ומאפשר יותר ניסויים ומחקרים מעמיקים יותר, אך דורשת כמויות יותר כתב כימי. לבסוף, הפרוטוקול אושר שימש גם עם שתילים מפעל פשתן, ייצוג אמיתי חי צמח מודל שבו העיתונאים כימי כנראה נספג דרך השורשים לפני מובלים את הגבעול. בעוד מודל זה יש יתרון ברור של מבוצע ב צמחים חיים, בפועל, זה מוגבל השתילים והוא לא מתאים באמת חוקרים lignification dynamics צמחים בוגרים מסיבות מעשיות (זמן דגירה ארוך, מוגבה כמות של עיתונאים כימי). ובכל זאת, עיצובים ניסוי שלושת אלה הם משלימים, ובכולם יש היתרונות והחסרונות שלהם לגבי ההיבטים המעשיים ומשמעויות ביולוגי בהתאם לסוג השאלה ביולוגי שנענתה.
שפותחה כדי ללמוד את הדינמיקה lignification של פשתן, פרוטוקול שלנו היא מאוד, לא רק מבחינת עיצוב הניסוי הביולוגי, אלא גם מבחינת היישום שלה לשני צמח מינים ורקמות/איברים. למשל, האושר ניתן בקלות להעביר את תודרנית או סוגים של צפצפה נתונות יותר מחקרים עם מוטציות מעלף או דפיקה למטה עבור גנים שונים. בעקרון, מחקרים תיוג כפול עם הגישה שלנו גם ניתן להרחיב את מולקולות אחרות באמצעות שני מבשרי ששונה ברורים של הצמח דופן התא פולימרים - כולל כל שלוש monolignols הראשי או סימנים מקדימים חילוף החומרים שלהם גם כן שונים כמו monosaccharides המהווים המטריקס רב-סוכר. מאז הקמתה, כימיה bioorthogonal אכן בעיקר פותחה כדי לחקור glycans/פוליסכרידים-פחמימה # מיון הפחמימות מטבולית הנדסה (מו)4,5,17,28, אבל באופן מפתיע היו רק מעט מאוד יישומי לשתול ביולוגיה כה7,8,9,10,11,12. מבחינת תאימות של התגובות, המחקר של ליגנין אכן היה תיק מורכב לפתור כמו שני כתבים כימי משולבים באותה רשת לסופרמרקטים הפולימר. האפשרות של Hללא תוויתAZ-GALK קישור היווצרות היה ההיבט להתגבר בשל הקרבה המרחבי של GALK ויחידותAZ Hבתוך 3D מבנה של ליגנין23, מגבלה זה עשויים שלא להופיע אם הכתבים כימי שני אינם כלולים באותו סוג של ביופולימרים או באותו אזור המרחבי של תא נתון כלשהו.
בהיקף רחב יותר המתודולוגיה בליס יכול בעצם להיות מיושם בכל מחקר הדמיה של שני צבעים פלורסצנטיות במודלים חיידקי או בעלי חיים באמצעות שני הכתבים כימיים ברורים הנושאת אזיד תג ותג מסוף אלקין, בהתאמה.

בשני העשורים האחרונים, האסטרטגיה כתב כימי התפתחה מתודולוגיה שני שלבים חזק כדי לחקור את הדינמיקה ואת הפונקציות של מולקולות שאינן גנטית מקודד. 1 , 2 , 3 באסטרטגיה אנלוגי סינתטי של biomolecule עניין עם אפנון קטן – כתב כימי – עובר תחילה מטבוליזם האורגניזם החי, ולאחר מכן בדיקה כימית (למשל., fluorophore על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה) קשורה covalently הכתב incorporated ויה bioorthogonal לחץ על כימיה. המכשיר חייב להגיב במהירות, במיוחד עם השינוי כימי הציג בעת היותו אינרטי כדי כל מולקולות נוכח במערכת החיים. במובנים רבים, שיטה זו גוברת על המגבלות של טכניקות נפוצות bioconjugation באמצעות לחץ ספציפי מאוד כימיה ligations ובכך מספק הזדמנות לעקוב מטבוליטים או ובמקרו-מולקולות ביולוגיות כי היו נגישים בעבר חי מערכות4,5,6.
למרות הפופולריות בצמיחה מהירה של שיטה זו עוצמה של תאים חיידקיים ובעלי חיים, דוחות המתאר את השימוש בביולוגית הצמח הם כמה מפתיע, המרחק בין7,8,9,10, 11,12. היינו מעוניינים במיוחד ליישם אסטרטגיה זו בצמחים ללמוד היווצרות של ליגנין, לאחד biopolymers הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ, מרכיב עיקרי של ביומסה lignocellulosic. 13 , 14 ליגנין הוא פולימר בעל תאים פנוליים זה ממלא תפקיד חיוני הגנה מבניים בתחום הפיתוח החיים של צמחים.
הוא בדרך כלל מורכב moieties 4-hydroxyphenylpropanoid שלושה: H (p- hydroxyphenyl), G (guaiacyl) ויחידות S (syringyl) נגזר בהתאמה בין 3 'monolignols' (p- coumaryl, coniferyl ו- sinapyl כהלים) כי הם מסונתז דרך השביל phenylpropanoid בציטופלסמה של התא (איור 1). לאחר להיות מיוצא דופן התא, monolignols הם מחומצן לקיצוניים peroxidases או laccases לאחר מכן הם עוברים צימוד הרדיקלי גרידא כימי תגובות פולימריזציה כדי ליגנין פולימרים, תהליך הנקרא lignification. 15 , 16 למרות lignins חריפה להשפיע על valorization תעשייתי של רבים הצמחי מוצרים, הקהילה המדעית יש עדיין דרך ארוכה ללכת כדי לפענח את המנגנון הסבוך ויסות lignification לו.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg"> איור 1: תהליך lignification בתאי צמח. Monolignols הם biosynthesized של פנילאלנין ב ציטוזול. לאחר להיות מיוצא דופן התא, monolignols הם מחומצן לקיצוניים peroxidases או laccases לאחר מכן הם עוברים צימוד הרדיקלי גרידא כימי תגובות פולימריזציה כדי ליגנין פולימרים, תהליך הנקרא lignification. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
למרות דיווחים על השימוש bioorthogonal תגובות לניתוח glycan רבים,2,3,17 שלהם יישום דוגמאות לסוגים אחרים של מולקולות הן פחות. השימוש bioorthogonal כימיה למטרות bioimaging ליגנין רק לאחרונה היה חלוץ ידי. Tobimatsu et al. 8 ב תודרנית לבנה כדי לספק מידע אודות שילוב של coniferyl המחליפים אלכוהול לתוך הפולימר ליגנין איפה זה יוצר את יחידות G,8,9 ובכך הממחיש את הוכחת את זה כתב כימי אסטרטגיות ישימות בהקשר זה. השימוש CuAAC היה ללמוד גם באמצעות נגזרת אלכוהול שונים coniferyl חודש כמה מאוחר יותר בוקובסקי ואח. 9 . אולם, ליגנין מכיל גם יחידות H ו- S הבנה עמוקה יותר של תהליך lignification דורש יותר ידע איך כל monolignols משולבים הפולימר, מה הגורמים עשויות לשלוט הקומפוזיציה שלה. הפיתוחים החדשים בתחום זה כיום תלויים פיתוח מתודולוגיות יעיל כדי לעקוב אחר כתבים כימיות מרובות בו-זמנית במערכות החיים. אף-על-פי כמה כתבות על glycans הניחו את היסודות בשנים האחרונות18,19,20,21,22, כפול תיוג גישות נשארים אתגר גדול ב bioorthogonal כימיה. אם פרוטוקול לחץ לשחזור תיוג-יחיד הוא קשה לפתח, ואז כפול תיוג גישות הדורשים אופטימיזציה במשולב שני הדדית תואמת bioorthogonal תגובות על שני הכתבים כימיים נפרדים הם אפילו יותר קשה. כמה דוגמאות כי חלוץ היבט זה השתמשו בשילוב של אזיד-אלקין אתקרב זן cycloaddition (SPAAC) ותגובות תגובת דילס-אלדר (DAinv) דרישה אלקטרונית הופכי אלקן-tetrazine ללמוד glycans בתאים בעלי חיים. עם זאת, חשבנו כי bioorthogonality התגובה DAinv לא יכול להיות מובטח ביישום זה בשל המאפיינים המבניים של ליגנין (אשר מורכב של מונומרים אלקטרון-עשיר cinnamyl שהוחלפו מסוג זה יכול להגיב עם אלקטרון עלוב האוויר דינס כגון הגששים tetrazine המשמש בתגובות DAinv), כי זה עלול לייצר שאינם ספציפיים תיוג. בנוסף, התגובהinv DA דורש ידיות כימיים קשים לאכסון גישה, כמו גם להיות מגושם ולא lipophilic ובכך מעלים את האפשרות כי הקצב של התאגדות, תחבורה ו/או לוקליזציה של החומר הכימי כתב ויוו עלולים להיות מושפעים. כפי שקלנו כי ההיבט האחרון היה רלוונטי במיוחד במקרה של גישה כימיה בלחיצה ללמוד lignification, אנחנו בחרה בכיוון שונה ופיתח באמצעות Bioorthogonal מצדו הדמיה רציפים אסטרטגיה (אושר) שילוב של Cycloaddition אזיד-אלקין Strain-Promoted (SPAAC) ו- Cycloaddition אזיד-אלקין קטליזת של נחושת (CuAAC) ויוו. 23
תגובות שני אלו הם אכן שני bioorthogonal הראשי לחץ על תגובות בהן השתמשו עד כה, יותר בפרט כמה דוגמאות של ליגנין הדמיה אשר פורסמו לאחרונה. 8 , 9 אסטרטגיית תיוג כפול שלנו מאפשרת את השימוש של אזיד moiety על monolignol אחד כתב וידיות של אלקין מסוף מצד שני, שני הכימי i) אינרטיים לכיוון מבנים רלוונטי מבחינה ביולוגית, ii) מאוד קטנים בגודלם (איור 2 ). כתוצאה, ההשפעה של אלה שינויים סינתטי על המאפיינים physicochemical של biomolecule שנבחנה ממוזער ובכך להקטין אפשרי אי-התאמות בין סובסטרטים לא טבעיים, הטבעית monolignol מבחינת תחבורה, metabolization המחירים במהלך השלב התאגדות מטבולית. למרות השילוב של SPAAC ו- CuAAC נראה מאוד אינטואיטיבי במבט ראשון, זה לידע שלנו רק הדוגמה השניה של סימון כפול באמצעות אסטרטגיה זו לבין היישום הראשון על מבנים שאינם glycans. 12 , 23
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg"> איור 2: אושר כפול תיוג אסטרטגיה. כתבים כימי HAZ GALK מתויג אנלוגים של monolignols מקורית H ו- G בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. הם משולבים קודם פולימרים ליגנין הגוברת של קירות התא על ידי האכלת אקסוגני (שלב 1). Cyclooctyne - ו אזיד-functionalized הגששים פלורסנט ואז ברצף מאתרים בפני הכתבים incorporated מאת bioorthogonal לחץ על כימיה: התגובה SPAAC (שלב 2) הוא מאוד ספציפי של יחידות HAZ , ואחריו (התגובה CuAAC שלב 3) זה מפורט של GALK יחידות (שלב 3), ובכך לאפשר לוקליזציה ספציפי של שני עיתונאים באופן עצמאי במדגם זהה. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
אנו ראשית המיועד לאמת את monolignol מתויג אזיד כתב HAZ (ממלא מקום של p- coumaryl אלכוהול), קודמן של יחידות ליגנין H ו ואז המציאו את אושר כפול תיוג האסטרטגיה שבה הוא משמש במשולב עם קודם לכן דווח מתויג אלקין GALK,9 (ממלא מקום של אלכוהול coniferyl), קודמן של ליגנין G יחידות. ב פרוטוקול לשחזור זה פיתח ובחן, פשתן, זן צמח חשוב מבחינה כלכלית, שילוב מטבולית כפול של HAZ ו- GALK לתוך ליגנין מושגת קודם לפני רציפים SPAAC/CuAAC תיוג. כאן, מתויג HAZ יחידות תחילה במפורש מסומנות באמצעות מצדו SPAAC של fluorophore cyclooctyne-functionalized, ואחריו בתיווך CuAAC מצדו של בדיקה פלורסנט השני במתויג GALK יחידות. שיטה זו שימש לחקור את הדינמיקה של תהליכים lignification בתוך קירות התא צמח וניתן יישומית ויוו לבלום חתכים, חיים נובע, כמו גם אחרים-שתילים, מינים שונים.

<table><tbody><tr><td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ)</td><td></td><td></td><td>מסונתז כמו ב-Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td></tr><tr><td>(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK)</td><td></td><td></td><td>מסונתז כמו באריה et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338</td></tr><tr><td>2% נתרן היפוכלוריט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור זכוכית בגובה 20 ס"מ 250</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מ"ל בקבוק</td><td></td><td></td><td></td>זכוכית שוט</tr><tr><td>48 בארות צלחת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5/6-TAMRA-PEG3-Azide</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-AZ109-1</td><td></td></tr><tr><td>רדיד</td><td></td><td></td><td></td>אלומיניום</tr><tr><td>בד</td><td></td><td></td><td></td>גבינה</tr><tr><td>קומפוסט המכיל אלכוהול מחטני חימר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(<חזק>גרם</חזק>)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>MFCD00002922</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט פנטהידראט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110</td><td>Jena </td><td>Bioscience CLK-A127-1</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q מים</td><td></td><td></td><td></td>טהורים במיוחד</tr><tr><td>Eppendorf 1.5 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr> זרעי פשתן <tr><td>EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(L. usitatissimum L.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלואורומאונט ג'י אנד טרייד; שקופית הרכבה בינונית</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי</td><td></td><td></td><td></td>זכוכית</tr><tr><td>שקופית</td><td></td><td></td><td></td>מיקרוסקופ זכוכית</tr><tr><td>תא גידול</td><td>CLF-צמח אקלים</td><td></td><td>לתרבות צמחים בת שבועיים</td></tr><tr><td>תא גידול</td><td>Angelantoni מדעי</td><td></td> החיים <td>לתרבות צמחים בני חודשיים</td></tr><tr><td>צמח מג'נטה קופסת</td><td></td><td></td> תרבית <td>לתרבית שתילים בת שבועיים</td></tr><tr><td>מתנול</td><td></td><td></td><td>רעיל (SGH02, SGH06, SGH08), עבודה עם כפפות מתחת למכסה המנוע</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>לק <td></td><td></td><td></td><td>לציפורניים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי ניקון</td><td></td><td></td><td></td>A1R</tr><tr><td>שייקר</td><td></td><td></td><td></td>אורביטלי</tr><tr><td>פרפילם</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-אלכוהול קומריל (<חזק>H</חזק>)</td><td>Carbosynth</td><td>FC145653</td><td></td></tr><tr><td>כובע</td><td></td><td></td><td></td>פלסטיק</tr><tr><td>פיפטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק סיר</td><td></td><td></td><td>פלסטיק לתרבית צמחים בני חודשיים</td></tr><tr><td>סכין</td><td></td><td></td><td></td>גילוח</tr><tr><td>גומייה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן אסקורבט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מהדק</td><td></td><td></td><td></td>סטרילי</tr><tr><td>תמיכה</td><td></td><td></td><td></td>אנכית</tr><tr><td>מערבולת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים לנוזל ומוצק &frac12; MS בינוני</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH<תת>2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2.2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO4. H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO< תת>4.5H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoCl2.6H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA.2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO4.7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiamine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פירידוקסין.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה</td><td></td><td></td><td></td>ניקוטינית</tr><tr><td>מיו-אינוזיטול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סכררוז</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES הידראט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

להמחיש lignification dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

ליגנין הוא לאחד biopolymers הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ, מרכיב עיקרי של ביומסה lignocellulosic. זה פולימר בעל תאים פנוליים ממלא תפקיד חיוני הגנה מבניים בתחום הפיתוח החיים של צמחים. למרות מורכבות מנגנוני ויסות lignification תהליכים ויוו חריפה להשפעה של valorization תעשייתי של מוצרים רבים הצמחי, הקהילה המדעית יש עדיין דרך ארוכה ללכת בשביל לפענח אותם. ב- 3 שלבים פשוטים זרימת עבודה, פרוטוקול תיוג כפול שהוצגו במסמך זה מאפשר bioimaging מחקרים של פעיל lignifying אזורי של רקמות הצמח. הצעד הראשון מורכב ב שיתוף מטבולית של שני עיתונאים כימי עצמאית, המחליפים של שני monolignols מקורי כי להצמיח ליגנין H-G-יחידות. לאחר שהשתלבה גדל ליגנין פולימרים, כל כתב אז במיוחד תווית משלו בדיקה פלורסנט באמצעות שילוב רציפים של bioorthogonal SPAAC/CuAAC לחץ על תגובות. בשילוב עם autofluorescence ליגנין, גישה זו מובילה הדור של מפות תלת-צבעי לוקליזציה של ליגנין בתוך קירות התא הצמח על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי פלורסצנטיות, מספק מידע מדויק המרחבי על נוכחות או היעדרות של פעיל מכונות lignification-קנה המידה של צמח רקמות, תאים ושכבות שונות דופן התא.

באמצעות פרוטוקול בליס הציג מעורבים תחליפי monolignol סינתטי ו bioorthogonal לחץ על כימיה, ניתן לדמיין את הדינמיקה של תהליך lignification צמחים חיים. בניגוד טכניקות הוקמה ליגנין ויזואליזציה (כגון פתולוגיה מכתים, immunolocalization או autofluorescence), זה "לחיצה כפולה' פרוטוקול באופן בלעדי מטרות של ליגנין המיוצר de novo במהלך שיתוף מטבולית צעד ומבדיל ליגנין שישנו המדגם עם הדמיה הסלולר ערוץ שלוש פעמים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי קרינה פלואורסצנטית (איור 3). H AZ-יחידות מזוהים באמצעות עירור, פליטה אורכי הגל של DBCO-יתד4-5/6-carboxyrhodamine 110 זה במיוחד שלוחצים על גבי אזיד פונקציות של שילב HAZ מולקולות במהלך השלב SPAAC (λex 501 nm /λem 526 ננומטר, הערוץ הירוק), ואילו GALK-יחידות מזוהים באופן דומה בכל אורכי הגל האופיינית של המכשיר azidefluor 545 זה במיוחד שלוחצים על התגים incorporated אלקין מסוף של G ALK במהלך השלב CuAAC (λex 546 nm /λem 565 nm, אדום ערוץ); הערוץ השלישי מקביל ליגנין הקיימת מראש, אשר מזוהה באמצעות autofluorescence מהותי שלה ב 405 ננומטר (ערוץ כחול). גישה זו מובילה הדור של מפות תלת-צבעי לוקליזציה של ליגנין בתוך קירות התא הצמח מספק מידע מדויק המרחבי על נוכחות או היעדרות של מכונות lignification פעיל בין רקמות שונות של איבר (איור 3A ), בין סוגי תאים שונים בתוך הרקמה זהה (איור 3B-C) ובתוך שכבות קיר שונה באותו התא (דמות תלת-ממד). במילים אחרות, מתודולוגיה זו מאפשרת לנו להאיר, במיוחד בתרגום האתרים lignification 'פעיל' (HAZ ו- GALK ערוצים) מאת המבדילים אותם מאזורי איפה ליגנין הוקמה ב שחרור מוקדם שלבי התפתחות הצמח (ערוץ autofluorescence). בנוסף, הרגישות של הטכניקה באופן דרמטי מוגברת בהשוואה autofluorescence, כמויות הרבה יותר קטן של ליגנין טרי מסונתז וניתן זוהה (איור 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg"> איור 3: הדמיה של כתבות כימי. incorporated monolignol עם גבעולי פשתן. (א) מחצית קטע ואלכסוני בעבודת יד של גזע פשתן, תמונה המשוחזרת. צילום מקרוב של השכבות הראשונות להבדיל עצה (B). עזב לוח: ליגנין autofluorescence (כחול, 405 ננומטר), בחלונית האמצעית: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול) ו- HAZ קרינה פלואורסצנטית (ירוק, 526 ננומטר) ערוצי, לוח נכון: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול) ו- GALK קרינה פלואורסצנטית (565 אדום, nm) ערוצים. החץ מצביע על קיר התא שכותרתו הראשון מ cambium הממחישות את רגישות מוגברת של אושר בהשוואה autofluorescence. (ג) Labeling בתא שונים סוגי עצה משנית (D) מקרוב על עצה משני תאים הממחישות את הווריאציות תיוג ברבדים שונים של דופן התא אותו. עזב לוח: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול) ו- HAZ קרינה פלואורסצנטית (526 ירוק, nm) ערוצי, בחלונית האמצעית: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול) ו- GALK קרינה פלואורסצנטית (565 אדום, nm) ערוצי, ימין לוח: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול), HAZ (ירוק) וערוצי פלורסצנטיות GALK (אדום). לוקליזציה שיתוף HAZ ו- GALK מתואר בצהוב. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
כתב כימי אסטרטגיות כגון שיטת באושר המובאים כאן או ההליכים תיוג בודד שפורסמו קודם לכן על ידי. Tobimatsu et al. 8 ולכן מאפשר מחקר עדינה יותר הרבה יותר נגישים בעבר שיטות כגון חיסונית - או פתולוגיה מכתים בעת היותו פשוט מאוד ליישם. למשל, איור 4 ממחישה את עוצמת האות עבור HAZ/GALK תיאגוד סיבים tracheids/כלי (FT) עצה משנית פשתן הוא גבוה מאוד בתוך הקירות התא הראשון כמה מן cambium אבל בהדרגה מקטין ב תאים בוגרים. פרופיל זה היא הפוכה מזו של autofluorescence ומציין שאת lignification המרבי מתמלאת במהירות רבה הרבדים תא 2-3 מטרים הראשון מ cambium. לעומת זאת, תאים ריי (R) מופיעים כדי להמשיך lignification על הרבה בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות שלהם כמו HAZ/GALK ההתאגדות היא הרבה יותר מתמיד בקירות של כל התאים מפני cambium הפקק. . זה לא מפתיע כי סוגי תאים מטרים ו- R להציג lignification בניגוד דינמיקה, כיוון מסוגי התאים בעלי תפקידים ביולוגיים שונים עם הבדלים המשויכת בתוכנית ההתפתחותי שלהם. FTs הינם צינורות מאורכים אכן מבוגרים ולא למות במהירות, תאים ריקים מת עוזב עם קירות עבים מעוצה זו ממלאים תפקידים חיוניים תמיכה מכנית והן תעבורה אנכי של מים ומינרלים, ואילו השורות הצר של R תאים זה להלחין את עצה קרני הם בחיים במצבם בוגרת ופונקציונליים מבלי קירות עבים מעוצה.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg"> איור 4: ספציפי תא monolignol כתב ההתאגדות בשנת עצה פשתן. ברייט-שדה מיקרוסקופיה קונפוקלית נוף (A) של חלק חתך ביד חופשית של גבעול פשתן. ורוד (ריי parenchyma תאים, R) וצהוב (סיבים tracheid תאים, מטרים) חיצים מציינים את המומנט פורש מאזור cambial לעבר הפקק, תיסרק עבור ליגנין autofluorescence-405 ננומטר (B), קרינה פלואורסצנטית HAZ -526 nm (ג) ו- G ALK זריחה-565 nm (D). (E) מבט עצה משנית. השאיר פאנל: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול), HAZ (ירוק), ו- GALK פלואורסצנטי (אדום) ערוצים. לוקליזציה שיתוף HAZ ו- GALK מתואר בצהוב. לוח נכון: איור סכמטי של המבנה עצה משנית בגזע פשתן. V, כלי השיט; מטרים, tracheid סיבים; R, ריי parenchyma התא. דמות זו שונתה מ. אריה ואח 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
בנוסף, השימוש של שני הכתבים כימיים ברורים המתאימים כדי H-G-יחידות עם שתי תגובות bioorthogonal בפרוטוקול בליס מאפשר תוצאות כמותיות יותר ואפשר להשיג. מרובב תיוג אסטרטגיות כגון בליס יכולה לספק תובנות נוספות על השליטה של monolignol יחסי התאגדות בתנאים שונים יכול לתרום פענח את התהליך lignification חמקמק. אם האחוזים היחסיים של monolignols H, G ו- S ב- lignins הם אכן משתנה מאוד בהתאם מינים, רקמות, גיל או תנאים סביבתיים של הצמח, המנגנון הסבוך המסדירים ההרכב הזה עדיין לא לגמרי מובנים. הטכנולוגיה תיוג כפול מייצג דרך רבת עוצמה של חוקרים חלק מהפרמטרים המסדירים ההרכב ליגנין. לדוגמה, משתנה את HAZ: GALK יחס עם האושר אפשרה לנו להפגין כי הרכב ליגנין ברקמות עצה משנית היא תלויה ישירות monolignol זמינות בתוך קירות התא, ולא על ירידה לפרטים peroxidase/laccase (איור 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg"> איור 5: השפעת המקננת קטעים גזע פשתן עם יחס שונה באחוזים של HAZ ו- GALK. HAZ: GALK% היחס ניתנת מעל כל עמודה של דמויות. העליון: התמזגה HAZ וערוצי GALK . למטה: היסטוגרמות המציין פלורסצנטיות ממוצע עוצמת HAZ ו- GALK עבור יחס שונה %. ערכים מבוטא ממוצע של עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע ב רמות האפור ± SD. סולם בר = 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה מ אריה ואח 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
פשתן הוא גדל על באסט הסיבים שלה (BF) המשמשים לייצור בדים, ניירות יוקרה או חומרים מרוכבים ידידותיים לסביבה. היבט חשוב של valorization תעשייתי שלהם היא שהם מכילים רמות נמוכות מאוד של ליגנין בקירות התא שלהם, אשר מאופיינים על ידי עבות במיוחד S2/G שכבה משני19,24. האושר ניתן לסמן lignification dynamics ההבדלים בין הרבדים השונים של דופן התא אותו. איור 6A מראה התאגדות כתב HAZ ו- GALK מוגבלים תא ופינות, דופן התא (middle lamella) / ראשי של סיבי באסט כמה אך לא כולם. העדר מוחלט של lignification בשכבה עבה באסט סיבים משני תאים קיר גם כאשר הכתבים כימיים monolignol, exogenously סיפק מגלה כי מדינתם hypolignified נובע היעדר סביבה מולקולרית מתאים בתיווך enzymatically חמצון תיאגוד monolignols לתוך שרשרת הפולימר גדל, שזה לא רק בשל רגולציה תעתיק של גנים ביוסינטזה monolignol כאמור דיווחו25. התבוננות זו גם להרכב גם העובדה הזאת peroxidase פשתן הגנים למעלה-מוסדרים ברקמות גזע החיצוני של המוטציה כימי פשתן lbf1 בעלת סיבים באסט מעוצה26.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg"> איור 6: אושר מדגיש הבדלים ספציפיים התחתי או שכבות דופן התא. החלונית השמאלית (A): בהיר-שדה תמונה של מקטע גזע פשתן. העיגול מציינת צרור סיבי. לוח נכון: תקריב על סיבי באסט. התמזגה HAZ וערוצי GALK (עם ובלי בהיר-שדה) מציג את lignification מוגבלת תא ופינות (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">), דופן התא (middle lamella) / ראשי של כמה סיבי באסט. BF, באסט סיבים; נקוב, parenchyma תא; M, (middle lamella); P, קיר התא הראשי; S1, השכבה הראשונה של דופן התא משני; שכבה S2/G, משני שכבה/ג'לי של דופן התא משני. פרוסה 2D (B), שחזור תלת-ממד של זום קונאפוקלית z-מחסנית של אזור endodermis שורש פשתן. רצועת Casparian (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) רק מציג autofluorescence ולשלב לא HAZ או GALK. Fluorogram המשויך מראה של GALK/HAZ המתאם אנטי: זריחה ירוק גבוהה קשורה אות אדומה נמוכה (cortex) ולהיפך (endodermis). Pericycle (P), Endodermis (ה), Cortex (C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
בסופו של דבר, מתודולוגיה זו שני צבעים יכולים גם לספק מידע רב ערך על 'המדינה lignification' של דופן התא substructures בשלבים התפתחותיים שונים, באיברים צמח שאינו הגבעול. לדוגמה, endodermis של פשתן שורשים מאופיין על ידי קיומה של להקה Casparian חומותיה תא רדיאלי, רוחבי כבר בשלבים המוקדמים של פיתוח. הלהקה של ביופולימרים הידרופוביות, העשוי suberin ו/או ליגנין, מונע מים מומסים בגבול נלקח על ידי שורש מלהיכנס פסיבי דרך אפופלסט ומאלץ אותם לעבור דרך קרום פלזמה דרך מסלול symplastic ובכך לתרום תפיסה סלקטיבית הקיבולות של שורשי צמחים. כאשר מוחל על השורשים פשתן, האסטרטגיה שלנו הראה כי HAZ ו- GALK משולבים בתוך הקירות וקולו של תאים endodermal באותה מידה כמו חלקי הקירות רדיאלי איפה הלהקה Casparian נעדר (איור 6B). עם זאת, העדר מוחלט של התאגדות כתב monolignol בלהקה Casparian עצמו מציין כי הוא בוגר בשלב התפתחותי זה בעוד שאר קירות הם עדיין אתר נוסף ביופולימרים התצהיר. התצוגה 3D המשוחזרת של z-מחסנית מביא בבירור את הלהקה Casparian אור. מעניין, הקירות של כמה תאים בקליפת המוח בצמוד endodermis גם הוכיח יכולת של שילוב HAZ מעדיפים (ובכך המציין את הנוכחות של ליגנין/suberin בקליפת השורש פשתן) אבל לא GALK. ניתוח לוקאליזציה שיתוף הראה אנטי-ומאופיינת HAZ ו- GALK, אשר מציע את קיומו של מכונות מבנה/אנזימטי ספציפי תא קיר באלה שני סוגי תאים סמוכים.
משלימה טבלה 1: הכנת מוצק בינוני ½ MS <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
משלימה בטבלה 2: ההכנה של פתרונות מניות כתב כימיים <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

בליס, פרוטוקול תיוג כפול ללמוד דינמיקה lignification, פותחה. שימוש monolignol סינתטי כתבים ושילוב רציפים של bioorthogonal SPAAC, CuAAC לחץ תגובות, מתודולוגיה זו סוללת את הדרך כדי ניתוח מעמיק של הגורמים המסדירים את להן של lignins ב הפיסקו.

להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיית תיוג כפולה זו היא לצפות באזורי ליגנינג פעילים של רקמות הצמח. בזרימת עבודה זו, אסטרטגיית המדווח הכימי מיושמת באמצעות שני מדווחים כימיים נפרדים בשילוב עוקב של תגובות כימיות קליקים ביו-אורתוגונליות. שיטה זו יכולה לעזור לפענח שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הצמח כגון קביעת אילו גורמים מווסתים את ההיווצרות המרחבית או הזמנית של ליגנין בתוך צמחים וקירות.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מכוונת אך ורק לליגנין המיוצר במהלך שילוב מטבולי. זה מבדיל אותו מכל ליגנין קיים בדגימה. אף על פי שפיתחנו במקור את השיטה הזו כדי לחקור דגלי ליגניזציה, אפשר להשתמש בה עם מינים אחרים כמו ארבידופסיס, צפצפה, או למעשה כל צמח אחר שמייצר ליגנין.כדי להציג את הטכניקה הזו יש לנו את קלמנס סיימון, שהוא דוקטורנט שעובד על הממשק בין כימיה וביולוגיה ומשתמש בטכניקה זו כדי לחקור דינמיקת ליגניזציה. ראשית, הכינו תמיסת דיווח כימית של 300 מיקרוליטר המכילה עשרה מיקרומולר של מדווח G מתויג אלקין. ועשרה מיקרומולר של מדווח H מתויג אזיד ומדיום נוזלי סטרילי 1/2 MS.מערבל את התמיסה ומעביר אותה לבאר אחת של צלחת 48 בארות עם פיפטת העברה. הכן תמיסת בקרה שלילית של 300 מיקרוליטר המכילה עשרה מיקרומולר של G ועשרה מיקרומולר של H ומדיום סטרילי נוזלי 1/2 MS. מערבל את התמיסה ומעביר אותה לבאר שנייה מאותה צלחת של 48 בארות.בעזרת סכין גילוח נקי חותכים את הגבעול של צמח פשתן בן חודשיים בעשרה סנטימטרים מעל פני האדמה. הכינו בחריצות 50 חתכים רוחביים ביד חופשית של הגבעול באמצעות סכין הגילוח והניחו אותם מיד בתווך של 1/2 אלפית השנייה. לאחר מכן, בחר חתכים שלמים ושלמים וחלק באופן אקראי עשרה מהם בבאר המלאה בתמיסת המדווח הכימית, תוך הקפדה לא לפגוע ברקמה.יש לחתוך את חתכי הרוחב בצורה יציבה ונקייה וחתך הרוחב צריך להיות ישר. אתה צריך יד יציבה וסכין גילוח חד כדי לשמור על הרקמות שלמות. מומלץ להתאמן מראש.לאחר חלוקת עשרה חתכים שלמים בתמיסת הבקרה השלילית, דגרו את הצלחת באור רציף בתא גידול בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות. למחרת, הסר את התמיסה המונוליגנלית בכל באר בעזרת מיקרופיפטה. מוסיפים 500 מיקרוליטר בינוני של 1/2 MS בינוני לכל באר ומערבבים בעדינות במשך עשר דקות.לאחר מכן, הסר את תמיסת השטיפה בעזרת מיקרופיפטה. הכן מיליליטר אחד של תמיסת ציקלו-תוספת אזיד-אלקין המקודמת על ידי זן. מכיל חמישה מיקרומולר של צבע פלואורסצנטי מתויג ציקלוקטן ומדיום נוזלי סטרילי 1/2 MS.לאחר מכן, מערבול את הפתרון. לאחר שלבי הכביסה האחרונים של פרוטוקול השילוב המטבולי, הסר את המדיום 1/2 MS והוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת SPAAC לכל באר עם מיקרופיפטה. הגן על צלחת 48 הבארות מפני אור על ידי הנחתה בקופסה.לאחר מכן, מערבבים בעדינות את הצלחת על שייקר מכני למשך שעה בחושך בטמפרטורת הסביבה. לאחר מכן, יש לשטוף כל באר ארבע פעמים עם 1/2 MS בינוני כפי שתואר קודם לכן, תוך שמירה על הצלחת בחושך. הכן מיליליטר אחד של תמיסת ציקלו-תוספת אלקין אזיד מזורזת נחושת המכילה נתרן אסקורבט, נחושת גופרתית וצבע פלואורסצנטי מתויג אזיד, ומדיום נוזלי סטרילי 1/2 MS.ואז מערבל את התמיסה. לאחר הסרת המדיום 1/2 MS, הניחו את הצלחת בקופסה והוסיפו 300 מיקרוליטר מתמיסת CuAAC לכל באר בעזרת מיקרופיפטה. מערבבים בעדינות את הצלחת על שייקר מכני למשך שעה בחושך בטמפרטורת הסביבה.הסר את הצלחת מהשייקר המכני והסר את תמיסת ה-CuAAC מכל באר בעזרת מיקרופיפטה. לאחר מכן, מוסיפים 500 מיקרוליטר של 1/2 MS בינוני ומערבבים את הצלחת על השייקר המכני למשך עשר דקות בחושך. לאחר שטיפה פעמיים נוספות עם מדיום 1/2 MS, הוסף 500 מיקרוליטר של מתנול 7:3 ותמיסת מים לכל באר.מערבבים את הצלחת על השייקר המכני למשך שעה בחושך. לאחר מכן, הסר את התמיסה מהבארות. לאחר מכן, מוסיפים 500 מיקרוליטר של 1/2 MS בינוני לכל באר ומערבבים בחושך במשך עשר דקות.לאחר חזרה על כביסה זו ארבע פעמים, שמור את חתכי הרוחב מאוחסנים במדיום של 1/2 אלפיות השנייה, מוגנים מפני אור. הנח חמש טיפות של מדיום הרכבה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית. לאחר מכן, הפקידו בזהירות כל חתך מתויג על ידי מדווח כימי על השקופית.מרחו לק על שני צדדים מנוגדים של השקופית. מכסים את השקופית בהחלקת כיסוי, תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר. לאחר מכן, הסר עודף אמצעי הרכבה באמצעות מגבת נייר.לאחר מכן, אטמו את הדגימה עם לק מכל ארבעת הצדדים. לאחר שהלכה לציפורניים מתייבשת, אחסן את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד לתצפית במיקרוסקופ קונפוקלי. לקטעי הצמח יש נטייה להיות פריכים כשהם מתייבשים.הקפידו לשמור אותם תמיד בתמיסה ולאטום את החלקות הכיסוי עם לק מכל הצדדים. זה מגדיל את חיי המדף של המגלשות המותקנות. הנח את שקופית הדגימה על המיקרוסקופtagה מתחת לעדשת האובייקטיב.התבונן וסובב את הדגימה כדי לזהות את האזור הרצוי של רקמת הצמח. לאחר מכן, בחר את המישור הפלואורסצנטי ביותר בציר Z. כוונן את ההגבר, ההיסט ועוצמת הלייזר כדי להשיג את התפלגות האות האופטימלית לאורך כל טווח הרמה האפורה עבור כל ערוץ.לבסוף, רכשו תמונות קונפוקליות באיכות גבוהה. BLISS מספק שלוש מפות לוקליזציה צבעוניות של ליגנין בתוך דפנות תאי הצמח, מכוון אך ורק לליגנין המיוצר בנובו במהלך שילוב מטבולי ומבדיל אותו מהליגנין הקיים קודם לכן בדגימה. הוא מדגיש את אתרי הליגניזציה הפעילים בתוך רקמות שונות של איבר בתוך סוגי תאים שונים של רקמה, או בתוך שכבות דופן או תת-מבנים שונים של תא.פרופילי השילוב של מדווח G מתויג אלקין ו-H מתויג אזיד מהקמביום לליבה בתוך הקסילם המשני של הפשתן מצביעים על כך שליגניזציה מקסימלית מושגת במהירות בטרכאידים סיביים במהלך ההתפתחות, בעוד שתאי גזע ממשיכים לשלב ליגנין בשלבים מאוחרים הרבה יותר של חייהם. שינוי יחס המדווח הכימי מדגים כי הרכב הליגנין ברקמות קסילם משניות תלוי ישירות בזמינות מונוליגנלית בתוך דפנות התא. ולא על ספציפיות פרוקסידאז או לקאז במהלך פילמור ליגנין.שילוב מדווח כימי מוגבל לפינות התא ולדופן התא הראשוני של הלמלה האמצעית של חלק מסיבי הבאסט, אך לא כולם. בשורשי פשתן, המדווחים הכימיים משולבים בדפנות התאים האנדודרמליים שבהם הפס הקספרי נעדר. להדמיה טובה יותר של ארכיטקטורת רקמות, ניתן גם ליצור שחזורי מחסנית Z תלת מימדית.בעקבות חזותי זה, ניתן לבצע גם עיבוד נתונים מקיף. כל אמצעי הזהירות שננקטו, ניתן להשיג תוצאות קבועות על ידי השוואה יחסית, קריאת מדגם בין דגימות שונות. ניתן לעשות זאת בנוסף ללוקליזציה של הובלה פעילה של תחומים שונים.השיטה הזו היא כלי נפלא עבור ביולוגים של צמחים כמוני, שחוקרים את דופן התא. ברגע ששולטים בו, ניתן לעשות זאת תוך מספר שעות. זה מאוד רגיש וניתן ליישם אותו על מגוון שלם של מערכות מודל ניסיוני שונות במבחנה in vivo.יישום אסטרטגיית הדיווח הכימי על ליגנין סולל את הדרך לביולוג כימי לחקור את דינמיקת הליגניזציה ולגלות מה שולט בתהליך הפילמור הזה, שבמובנים רבים עדיין מהווה טריטוריה לא ידועה.

visualizing-lignification-dynamics-plants-with-click-chemistry-dual

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

השיטה מבוססת על מיקרוסקופיה ראמאן confocal מוצג שמקנה ללא תווית להדמיה של ליגנין בדפנות תא הצמח והשוואת lignification ברקמות, מדגמים שונים או מין.

ללא תווית באתרו הדמיה של Lignification בתוך קירות התא הצמח

בסרטון זה אנו מתארים את טכניקת הצביעה של ויזנר להכתמת הליגנין הקיים בתאי צמח מיוחדים. טכניקת צביעה זו מסייעת לדמיין את דפנות התא המיושרות בגבעולי Arabidopsis thaliana ומסייעת לכמת את הליגניפיקציה בדפנות התא של סוגים שונים של תאים.

צביעת ויזנר להדמיית ליגנין: טכניקה להכתמת משקעי ליגנין הנמצאים בגבעולים של Arabidopsis thaliana

הרכב דופן התא של הצמח משתנה בין סוגי הרקמות ויכול לכלול ליגנין, תאית, המיצלולוז ופקטין. טכניקות צביעה שונות פותחו כדי להמחיש הבדלים ברמת סוג התא. מאמר זה הוא אוסף של טכניקות צביעת דופן תאים נפוצות.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

פרוטוקול זה נועד להציג שיטה כללית לדמיין ליגנין, תאית, hemicellulose בקירות תא הצמח באמצעות הדמיה ראמאן ניתוח רב משתני.

שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים

פרוטוקול זה מציג כיצד לחיות התמונה ולנתח את meristems apical לירות מכל מיני צמחים שונים באמצעות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

פרוטוקול זה מתאר התקנה מקורית המשלבת מדידות ספקטרליות ולאורך החיים כדי להעריך förster תהודה העברת אנרגיה (לדאוג) בין מבוססי rhodamine בבדיקות פלורסנט ליגנין פולימר ישירות בסעיפים צמח עבה.

מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה אופטימלית לתצפית היסטולוגית של גלים המושרים על ידי פלזמודיופורה brassicae. מקטעי ויברטומים של היפוקוטיל מנוקים לפני הדמיה פלואורסצנטית כדי לחקור את המעורבות של גורמי שעתוק ופיטוהורמונים במהלך התקדמות המחלה. פרוטוקול זה מתגבר על מגבלות הטמעת הרגם, ומאפשר הדמיה של חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים.

שילוב של מיקרוסקופיית ניקוי ופלואורסצנציה להדמיית שינויים בביטוי גנים ותגובות פיזיולוגיות לפלסמודיופורה brassicae

כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של הדינמיקה התלת-ממדית של דופן התא ברקמת טחב חי, המאפשר הדמיה של ניתוק דפנות התא במוטנטים מסוג ggb ועיבוי דפוסי דופן התא בסוג הבר במהלך ההתפתחות לאורך תקופה ארוכה.

הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens

כאן, אנו מציעים פרוטוקול פשוט המשלב הנדסת אוליגוסכריד מטבולית, כימיית קליקים ומיקרוסקופ הרחבה המאפשר הדמיה ביולוגית של N-גליקופרוטאינים תוך-תאיים עם רזולוציה משופרת באמצעות ציוד מיקרוסקופיה שגרתי.

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

קונפורמציה בחלבון ודינמיקה הן מפתח להבנת הקשר בין מבנה חלבון ותפקודו. חילופי מימן יחד עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה הוא שיטה תכליתית כדי ללמוד את הדינמיקה קונפורמציה של חלבונים כמו גם באפיון אינטראקציות החלבון ליגנד וחלבונים, כוללים ממשקי מגע ואפקטי allosteric.

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

חקור את שיטת התיוג הכפול BLISS לניתוח דינמיקת הליגניפיקציה בצמחים באמצעות כימיה ביו-אורתוגונלית. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של ליגנין חדש בתאי צמחים שונים.

להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

גלה סרטונים נוספים