להמחיש ליקוציט מתגלגל והצמדות אנגיוטנסין II חדורים עכברים: טכניקות ואת החסרונות

המטרה הכוללת של מיקרוסקופ וידאו תוך-חיוני אפיפלואורסצנטי זה, או פרוטוקול IVM של כלי דם היא לדמיין ולכמת גלגול והידבקות של לויקוציטים בעורקים חלודים ביתר לחץ דם המושרה על ידי אנגיוטנסין II בעכברים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפתולוגיה של תפקוד לקוי של כלי הדם ויתר לחץ דם עורקי כגון מנגנון האינטראקציה בין לויקוציטים ובמיוחד הליזוזומים והתאים החיוביים, ועבודת כלי הדם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לראות את האינטראקציות in vivo בין תאי הדם המסתובבים להבנת כלי הדם.

הכן עכבר זכר לניתוח לאחר שבעה ימים של טיפול אנגיוטנסין שני עם משאבה אוסמטית על פי הטקסט פרוטול. מרחו משחה עיניים על העיניים כדי להגן עליהן במהלך ההליך. הנח את החיה המורדמת בשכיבה גבית על צלחת כירורגית של 39 מעלות צלזיוס והכנס בדיקה רקטלית כדי לשמור על הטמפרטורה.

השתמש במקלון צמר גפן כדי למרוח ולשפשף קרם להסרת שיער לתוך הצוואר עד שהשיער מתחיל לנשור. לאחר מכן, לאחר 2 דקות נוספות, השתמש במרית כדי להסיר את השערות והקרם. לאחר מכן, יש לחטא את העור באמצעות חומר חיטוי אלכוהולי לעור.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, בצע חתך אורכי של 1 עד 1.5 ס"מ בעור הצוואר, 1 ס"מ מקנה הנשימה. לאחר מכן, בצע 2 חתכים בניצב משני קצות החתך הראשון. הסר בזהירות את הרקמה ממש מתחת לעור והסר את פיסת העור המכסה את וריד הצוואר השמאלי ואת קנה הנשימה.

לאחר מכן, השתמש בשני מלקחיים מעוקלים כדי לבודד בזהירות את הבלוטות הקורוזיות התת-לשוניות והתת-לסתות מאזור העניין. תוך הקפדה לא לחתוך או לפגוע בבלוטות, מקם אותן כך שיאפשרו את הגישה הטובה ביותר לווריד הצוואר ולקורידים. לאחר מכן, כדי לבודד את וריד הצוואר, הכנס מלקחיים דקים בין הכלי לרקמה שמסביב, ופתח וסגור לאט את המכשיר כדי לשחרר בעדינות את הווריד מהרקמה.

לאחר שווריד הצוואר נקי לחלוטין, מקם את המלקחיים מתחת לכלי והנח מתחתיו שני תפרים באורך 10 ס"מ 7-0. קושרים שני קשרים כדי לסגור את התפר הפרוקסימלי לראש ועם התפר השני, הכינו קשר אחד, אך אל תסגרו אותו. כעת, עם מלקחיים ביד אחת, החזק את הקטטר המלא במי מלח סטריליים של 37 מעלות צלזיוס, ואז ביד השנייה, השתמש במספריים או במחט מעוקלת בגודל 26 כדי לבצע חתך קטן לתוך הכלי.

הכנס את הקטטר לווריד הצוואר וסגור את הקשר פעמיים. לאחר מכן, סגור את התפר הפרוקסימלי לראש מעל הצנתר כדי להבטיח קיבוע מלא. כדי לבודד ולהכין את העורקים הפגומים, השתמש במלקחיים מעוקלים דקים כדי לנתח את האזור המכסה את קנה הנשימה.

לאחר מכן, ברגע שהקורוזיה נקייה מהרקמות שמסביב, הסר את עצב וגאס מהכלי מבלי לחתוך אותו, על ידי סגירה איטית ופתיחה של המלקחיים הדקים, במידת הצורך, כדי לגייס בעדינות את העצב. לאחר ששני העורקים נקיים לחלוטין, מקם את המלקחיים מתחת לעורק הפגום הראשון, ותוך הקפדה לא למתוח יתר על המידה את הכלי, הנח מחזיק כלי פלסטיק קטן ושחור בגודל 3 מ"מ על 2.5 ס"מ מתחת לכלי. לאחר שמחזיק הכלי נמצא במקומו, ודא שזרימת הדם קיימת.

כדי להימנע ממתיחת הכלי, ידו של המפעיל צריכה לנוע מעט ככל האפשר בתנועה אחת של המלקחיים הראשונים כדי לבודד את העורק הפגום ובעזרת מלקחיים שניים כדי ליצור חור מתחת לכלי. כאשר מחזיק הכלי ממוקם כהלכה, הנח את העורק השני מעל המכשיר. אם העכבר אינו ממוקם ישירות מתחת למיקרוסקופ, הנח את הבלוטות בחזרה מעל קנה הנשימה, ומרח מי מלח סטריליים של 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע התייבשות של האזור.

במזרק של 1 מ"ל, הכינו דילול של 1-4 במי מלח סטריליים, של תמיסת מלאי מופשרת של 2 מ"ג למ"ל של תפוז אקרידין. הגן על המזרק מפני אור. כדי לבצע מדידות, מקם את העכבר מתחת למיקרוסקופ פלורסנט מהיר בעל שדה רחב באמצעות מעבה למרחקים ארוכים ואובייקט טבילה במים פי 10 עם מונוכרומטר, מפצל קרן ומצלמת CCD.

רכוש תמונות בזמן אמת על ידי מיקוד המטרה באמצע העורק הפגום במשטח האנדותל. הזרקו לאט 50 מ"ל תפוז אקרידין. לאחר מכן, הגדר את התוכנה להקליט 100 תמונות, עם זמן חשיפה של 120 אלפיות השנייה לתמונה.

הקלט ארבעה סרטונים לכל עורק פגום במיקומים שונים על העורק עבור כל סרטון. אם האות הפלואורסצנטי פוחת, הזריק עוד 50 מ"ל תפוז אקרידין. כדי לבדוק תנאים שונים, הזריק את תפוז האקרידין ישירות לווריד הזנב הצדדי אם לא הוכנס קטטר צוואר, ובצע את אותה רכישת תמונה.

כביקורת, רשום מדידות פרחת מעכברים חיוביים ל-lys-MCRE שלא הוזרקו, חיוביים ל-IRG. כמת את תאי הגלגול וההיצמדות בתצוגת מלבן של 200 מיקרון על 250 מיקרון הממוקמת באמצע הכלי עבור כל סרטון, המוצגת במהירות של 10 תמונות בשנייה. ספרו את תאי הגלגול וההדבקות.

תאי היצמדות מוגדרים כתאים שאינם זזים או מתנתקים מהאנדותל בתוך הסרטון של 10 שניות. כדי לפשט את הכימות, הסר את הערוץ עם הקרינה האדומה, והשתמש רק בפלואורסצנטיות הירוקה כדי לספור תאים מתגלגלים ונדבקים. במחקר זה, נצפו חלודות של עכברים חיוביים ל-lys-mCre, חיוביים ל-IRG שהוחדרו לאנגיוטנסין 2, באמצעות IVM.

כפי שניתן לראות כאן בנקודת ההתחלה, נוכחותו של קטטר צוואר הביאה להידבקות של תאים פלואורסצנטיים חיוביים ל-lys-M. לאחר הזרקת תפוז אקרידין, תאי האנדותל היו גם הם פלואורסצנטיים. לאחר מכן, הפחתת הרקע כדי להגביל את הקרינה הקשורה לאנדותל, גילתה שכל התאים הנצמדים הגרעיניים היו חיוביים ל-lys-M.

בניסוי זה, לאחר שבוע אחד של עירוי אנגיוטנסין 2, אינטראקציות אנדותל לויקוציטים בעורקים חלודים של עכברים חיוביים ל-lys-M Cre-חיוביים ל-IRG, צולמו והודגמו על ידי IVM, עם או בלי הזרקת כתום אקרידין, דרך קטטר צוואר או דרך וריד הזנב. ללא כל קטטר או זריקה, גלגול של תאים חיוביים ל-lys-M גדל משמעותית לאחר עירוי אנגיוטנסין 2, בהשוואה לעכברים שלא טופלו. וגם ההדבקה הוגברה.

הזרקת תפוז אקרידין עם קטטר צוואר הגבירה את ההידבקות והגלגול בעכברים שטופלו באנגיוטנסין 2, במידה רבה יותר בהשוואה לעכברים ללא קטטר. לבסוף, כפי שניתן לראות בפאנלים אלה, הזרקת תפוז אקרידין בווריד הזנב, מובילה להידבקות וגלגול דומים בהשוואה לעכברים שלא קיבלו הזרקה של תפוז אקרידין. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושים דקות אם היא מבוצעת כראוי.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לא לפגוע ברקמות המקיפות את כלי הדם. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחומים קרדיווסקולריים והמוסטטיים לחקור לויקוציטים והידבקות טסיות דם לדופן כלי הדם in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגביל את ההשפעה של הזרקת צבע וניתוח ב-IVM.

אל תשכח שעבודה עם צבעי פלורסנט משולבים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להימנע ממגע עור עם הצבע עם החומר המתאים, כגון כפפות.