שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס
10 בינואר 2018
שיטה זו מתאר את שיבוט, הביטוי, ואת טיהור של Nsa1 רקומביננטי לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, רנטגן זווית קטנה פיזור (SAXS), והוא רלוונטי לניתוח המבני היברידית של חלבונים אחרים שניהם הורו, מגרה תחומים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר חלבון רקומביננטי המורכב מתערובת של תחומים מסודרים ולא מסודרים לניתוח מבני היברידי הן על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן והן על ידי פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה מבנית לגבי הצבת תפקוד ביולוגי כך שהקביעה של כל התמיסות תישאר במבנה החלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה למידול אזורים דינמיים של חלבון או מקרו-מולקולה שלא ניתן לפתור על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בהתחלה ללמוד כיצד להעריך נכון את איכות נתוני ה-SAXS שלהם. כדי להתחיל בהליך, הפוך פלסמיד ביטוי Nsa1 לזן ביטוי E.coli מתאים. תרבו את התאים, גרמו לביטוי Nsa1 וקצרו את התאים.
השעו מחדש את התאים ב-25 מיליליטר של מאגר ליזה, לפני קירור לארבע מעלות צלזיוס, המכיל טבליה אחת של מעכב פרוטאז ללא EDTA. סוניקציה של התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך שבע דקות, עם מחזור של שתי שניות הפעלה, שתי שניות הפסקה. לאחר מכן, צנטריפוגה את הליזאט בכוח הכבידה פי 26, 900 מכוח הכבידה למשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
ודא שהתערובת לא קופאת במהלך הצנטריפוגה. לאחר מכן, יש לאזן עמוד זרימת כבידה המכיל 10 מ"ל של שרף זיקה קובלט משותק עם מאגר ליזה. טען את הליזט המובהר על העמוד ואפשר לו לזרום דרך השרף בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, שטפו את השרף פעמיים עם מנות של 100 מ"ל של מאגר ליזה. הסר את Nsa1 מהעמודה עם 20 מ"ל של מאגר פליטה. יש למרוח כמות של 15 מק"ל של ה-eluere על ג'ל SDS-PAGE של 4 עד 15% כדי לאשר את פליטת החלבון.
לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של תמיסת מלאי פרוטאז TEV של 1 מ"ג/מ"ל לאלוארה. דגרו על האלוארה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להסיר את תג ה-MBP. לאחר מכן, השתמש ביחידת מסנן צנטריפוגלית של 10 קילודלטון כדי לרכז את ה-Nsa1 המפוצל ב-MBP לכ-5 מ"ל, והקפיד לא לרכז יתר על המידה.
טהר את החלבון המרוכז על עמודת סינון ג'ל מאוזנת מראש עם Buffer A.אחד השלבים הקריטיים בהליך זה הוא להבטיח שאתה מסיר את כל האגרגטים במהלך הטיהור. אגרגטים יפריעו להתגבשות ולאיסוף וניתוח נתוני SAXS. נתח דגימות של 15 מק"ל מכל שבר עמודה עם SDS-PAGE כדי לאשר את ההפרדה של MBP מ-Nsa1.
שלב את השברים המכילים Nsa1. השתמש ביחידת מסנן צנטריפוגלי של 10 קילודלטון כדי לרכז את השברים המשולבים לכ-8 מ"ג/מ"ל. מדוד את הספיגה ב-289 ננומטר וחשב את ריכוז החלבון.
המשך מיד לבדיקות סקר והתגבשות פרוטאוליטיות. כדי להתחיל בבדיקה הפרוטאוליטית, הכינו תמיסות מלאי של 1 מ"ג/מ"ל של אלפא-קומוטריפסין, טריפסין, אלסטאז, קפאיין, ספטיליזין ואנדופרוטאינאז GluC. יש לדלל כל תמיסת ציר עם מאגר דילול ל-1:10, 1:100 ו-1:1,000.
יש לדלל את תמיסת ה-8 מ"ג/מ"ל של Nsa1 ל-1 מ"ג/מ"ל עם Buffer A.לאחר מכן, עבור כל דילול פרוטאז, יש לשלב 1 מק"ל של דילול הפרוטאז עם 9 מק"ל של מלאי החלבון המדולל. דגרו את התמיסות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, הוסף 10 מק"ל של דגימת SDS-PAGE כפולה כדי לחצץ לכל תמיסה ולחמם את התמיסות ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
הפעל את הפתרונות על ג'ל SDS-PAGE של ארבעה עד 15% כדי לזהות תחומים עמידים לפרוטאז. צור מבני ביטוי חתוכים שאינם כוללים אזורי פרוטאז. מבטאים ומטהרים חלבונים אלה לאופטימיזציה של התגבשות.
לאחר רכישת נתוני SAXS עבור חלבון Nsa1 בטווח ריכוזים, הגדר את נתיב קובץ המעטפת של המסוף לספרייה המכילה את הנתונים. לאחר מכן, הפעל את תוכנת הניתוח. טען את עקומות הפיזור לתוכנת הניתוח.
השתמש בכלי RG אוטומטי כדי לקבוע את רדיוס הסיבוב ואת עוצמת הפיזור קדימה עבור כל עקומה. לאחר מכן, צור עלילות Kratky עבור כל עקומת פיזור כדי לקבוע את מידת הקומפקטיות. השתמש בכלי האוטונום כדי לחשב את פונקציית ההתפלגות הזוגית עבור כל עקומה, תוך שימוש בממד מקסימלי התחלתי של פי 3 מרדיוס הסיבוב.
בצע אופטימיזציה של הממד המקסימלי כדי לקבל עקומת פונקציית התפלגות חלקה וזוגית התואמת את עקומת הפיזור הניסיונית. השווה את הפרמטרים המבניים על פני ריכוזים כדי לוודא היעדר נזקי קרינה או השפעות תלויות ריכוז. זה קריטי להשוות פרמטרים מבניים מרכזיים, כולל רדיוס סיבוב, מסה מולקולרית, פיזור קדימה ופונקציות התפלגות מרחק זוגות על פני סדרת ריכוז.
וזה כדי להבטיח שלא יהיו נזקי קרינה או השפעות ריכוז. לאחר מכן, הפעל את כלי השירות לשיטת אופטימיזציה של אנסמבל באמצעות קובץ מבנה גביש החלבון ההתחלתי, קובץ רצף חלבון היעד וקובץ הנתונים הניסיוני של SAXS. השווה את ערכי החי בריבוע מקובץ מבנה הגביש ההתחלתי לקובץ האנסמבל כדי לקבוע אם מודל האנסמבל מתאים היטב לנתוני הניסוי.
השתמש בתוכנת הדמיה מולקולרית כדי לכסות את מבנה הגביש עם הקונפורמרים שנוצרו. שימו לב למספר הכולל של הקונפורמרים ולחלק התפוסה של כל קונפורמטור התורם לעקומת הפיזור. מחשוף פרוטאוליטי של מסוף הפרוטאז labile C של Nsa1 הביא להיווצרות גבישים אורתורומביים.
ה-Nsa1 המטוהר הטרי יצר גבישים מעוקבים, אך מבנה הגביש עדיין חסר צפיפות אלקטרונים עבור קצה c labile. תחום מדחף הבטא WD-40 של Nsa1 היה פתור היטב בשני המבנים. תחום ה-Nsa1 WD-40 לבדו לא התאים לנתוני ה-SAXS הניסיוניים.
שילוב של מידול גוף קשיח ושחזור אברקטיבי של מסוף C שיפר משמעותית את טוב ההתאמה. מידול אנסמבל סיפק שיפור גדול עוד יותר בהתאמה טובה, וחשף את הדגימה המאשרת של זנב ה-C-terminal בתמיסה. בעוד ש-SAXS היא טכניקה מבנית ברזולוציה נמוכה, היא מחמיאה היטב למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה, כמו קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן.
אז אתה יכול למדל אזורים גמישים ולא מסודרים. על ידי איסוף וניתוח נתוני SAXS של מקרומולקולה, אתה יכול להתחיל להבין את השינוי המאשר שהתרחש לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפתור את המבנה של חלבון המורכב מאזורים מסודרים ולא מסודרים הן על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן והן על ידי SAXS.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
שיטה זו מתארת את השבוב, הביטוי והטיהור של Nsa1 רקומביננטי לצורך קביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני X ופיזור קרני X בזווית קטנה (SAXS). היא ישימה לניתוח מבני היברידי של חלבונים המכילים דומיינים מסודרים ובלתי מסודרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה מבנית
- הנדסת חלבונים
- קריסטלוגרפיית קרני רנטגן
רקע
- המחקר מתמקד בניתוח מבני היברידי של חלבונים.
- הבנת המבנה של חלבונים בעלי אזורים דינמיים היא קריטית.
- לקריסטלוגרפיה של קרני X יש מגבלות בפתרון אזורים לא מסודרים.
- פיזור קרני X בזווית קטנה (SAXS) מספק נתונים משלימים.
מטרת המחקר
- הפקת חלבון רקומביננטי לצורך אנליזה מבנית.
- מידול של אזורים דינמיים בחלבונים שקשה להסיקם.
- שיפור ההבנה של תפקוד חלבונים באמצעות תובנות מבניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספורמציה של פלסמיד ביטוי של Nsa1 לתוך E. coli.
- גידול של תאים שעברו טרנספורמציה.
- השראה של ביטוי Nsa1.
- קציר תאים לצורך טיהור חלבונים.
תוצאות עיקריות
- שיבוט וביטוי מוצלחים של Nsa1 רקומביננטי.
- טיהור חלבון המתאים לאנליזה מבנית.
- הדגמה של SAXS ככלי למחקר של אזורים לא מסודרים.
- תובנות לגבי הדינמיקה המבנית של חלבונים היברידיים.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה חסונה לחקר מבנים חלבוניים מורכבים.
- שילוב של קריסטלוגרפיית קרני X ו-SAXS משפר את ההבנה המבנית.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול חלבונים אחרים בעלי מאפיינים דומים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטות מבניות היברידיות המשלבות קריסטלוגרפיה של קרני X ו-SAXS מאפשרות לצווני ביו-פארמה לפענח ארכיטקטורות של חלבונים באורכם המלא, כולל אזורים לא סדורים (disordered regions) הקריטיים לתיקוף המטרה. גישה זו מפחיתה עמימות מכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת נתונים ניסויים על דומיינים גמישים המשפיעים על קישור ותפקוד. הביטחון המבני המתקבל תומך בהפחתת סיכונים של היפותזות טיפוליות ומסייע לאסטרטגיות זיהוי מובילים (lead identification) עבור מטרות בעלות חוסר סדר מובנה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הפרדה של דומיינים מובנים ובלתי מובנים של חלבוני מטרה.
- ערך תפעולי: מספק תיקוף ניסויי של ארגון וגמישות הדומיינים, ובכך מפחית את ההסתמכות על תחזיות חישוביות בלבד.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים במטרה על ידי חשיפת מצבים קונפורמציוניים שעשויים להשפיע על היכולת לטיפול תרופתי (druggability) ועל הנגישות לאתר קישור.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר מודלים מבניים מועמדים שניתן להשתמש בהם לתכנון בדיקות עבור יעדים בעלי אזורים דינמיים.
- ערך תפעולי: מייצר נתונים ביופיזיקליים הדירים (למשל, רדיוס גירציה, התפלגות זוגית) המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות על פני ריכוזים שונים.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשר הכנה של דגימות חלבון מאופיינות היטב לצורכי קמפיינים של סריקה (screening) בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: מגשר בין תובנות מבניות משלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קלני על ידי הגדרת ההתנהגות במצב תמיסתי של מטרות באורכן המלא.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר כיצד אזורים לא מסודרים תורמים לתפקוד החלבון או להרכבת קומפלקסים, ובכך מספק מידע על הרלוונטיות של סמני ביולוגיים (biomarkers).
- קידום מותאם סיכון: תומך בהחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי הפחתת אי-הוודאות ביחסי מבנה-תפקוד של המטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה היברידית זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל, כאשר ביטחון מבני בחלבונים באורכם המלא מאפשר התקדמות מהימנה יותר לשלבים הפרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי פתרון של דומיינים מסודרים ולא מסודרים של גורמי הרכבה כגון Nsa1.
- סריקה: מספקת דגימות חלבון מונו-דיספרסיות ומוכנות לבדיקה, אשר תוקפו בוצע באמצעות SAXS וקריסטלוגרפיה, מה שמבטיח הערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת פלטי SAXS כמותיים (למשל, Rg, I(0), P(r)) המאפשרים השוואה של מצבים קונפורמציוניים תחת תנאים משתנים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מבני דומיינים ברזולוציה גבוהה לבין התנהגות במצב תמיסה, מה שמאפשר המשכיות למודלים פרה-קליניים של ביוגנזה של ריבוסומים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לחקר חלבונים רב-דומייניים אחרים עם אזורים מסודרים ולא מסודרים, ובכך ממקסמת את ההשקעה בביולוגיה מבנית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במודלים של מטרות על ידי פתרון אזורים לא מסודרים שאינם נראים באמצעות קריסטלוגרפיה בלבד.
- ערך תפעולי: מספק נתונים מבניים סטנדרטיים הניתנים לשחזור באמצעות שילוב של שיטות אורתוגונליות.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי הפחתת אי-ודאות ביולוגית בתיקוף המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון על בסיס תיקוף מבני מקיף.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיהור חלבונים, קריסטלוגרפיה, ואיסוף וניתוח נתוני SAXS.
- תלוי בגישה לקווי קרן של סינכרוטרון לצורך מדידות SAXS ודיפרקציית קרני X באיכות גבוהה.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת דגימות כדי למנוע אגרגציה, הפוגעת הן לקריסטלוגרפיה והן ל-SAXS.
- כולל אופטימיזציה קפדנית של עיצוב המבנה (construct) להסרת אזורים הרגישים לפרוטאז תוך שימור דומיינים פונקציונליים.
- דורש שיתוף פעולה בין-תחומי בין ביולוגים מבניים, ביופיזיקאים וצוותים לגילוי תרופות לצורך פרשנות של מודלים היברידיים.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Nsa1 (Nop7 Associated 1) Protein Purification
3:43
Proteolytic Screening
5:14
Small-Angle X-Ray Scattering (SAXS) Data Processing, Comparison of Concentration Series, and Ensemble Modeling
7:31
Results: Modeling the Disordered C-Terminus Region of Nsa1
8:37
Conclusion
