Microprobe נימי אלקטרופורזה ספקטרומטריית עבור מטבולומיקס תא בודד ב- Live צפרדע (צפרדע רפואית זריזה) העוברים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לאפיין מטבוליטים בתאים חיים של עוברים מתפתחים על ידי מיקרו-דגימה באתרה של אלקטרופורזה נימית-ספקטרומטריית מסה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה התאית וההתפתחותית מכיוון שהיא מאפשרת ניתוח חילוף החומרים בתאים בודדים ישירות בעוברים חיים מתפתחים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה, ניתנת להרחבה לגדלי תאים שונים ומאפשרת דגימה זעיר פולשנית של תאים בודדים בעוברים חיים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד שלבים מסוימים מכיוון שהעובר מתפתח מהר יחסית ונעשה שימוש במכשיר יינון אלקטרו-ספריי אלקטרו-ספריי שנבנה בהתאמה אישית. התחל הליך זה עם הכנת 2% אגרוז בתמיסה אחת של 1X שטיינברג. בעודם נוזליים, מצפים את החלק התחתון של צלחות פטרי בגודל 60 מילימטר בתמיסה.

לאחר שג'ל האגרוז התקרר והתמצק, להבעיר את קצה פיפטת פסטר בגודל שישה אינץ 'עד ליצירת כדור. לאחר מכן, גע קלות בקצה המחומם כדי להטביע חמש עד 10 בארות בעומק של כמילימטר אחד לתוך האגרוז. כדי לייצר מיקרו-פיפטות עם קצה מחודד, ראשית, משוך נימי בורוסיליקט בחולץ נימים מסוג Flaming/Brown באמצעות ההגדרות שנמצאות בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, נתק את קצה המיקרופיפטה הנמשכת באמצעות זוג מלקחיים חדים עדינים כדי לקבל קוטר חיצוני של קצה נימי של כ -20 מיקרון. בצע שלב זה תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לסייע לדיוק ולשחזור. השג עוברים באמצעות הזדווגות טבעית המושרה על ידי גונדוטרופין של xenopus laevis בוגר או באמצעות הפריה חוץ גופית כפי שמוזכר בפרוטוקול הטקסט.

הסר את שכבות הג'לי המקיפות את העוברים כשהם מתחילים להיבקע לשלב שני התאים על ידי מתן אפשרות לעוברים לנוח בתמיסת הסרת הג'לי למשך שתי דקות. לאחר מכן, סובבו אותם בעדינות במשך שתי דקות נוספות כדי למנוע מהעוברים להיצמד למשטח צלחת האיסוף. יוצקים בעדינות את תכולת המנה לכוס נקייה ושופכים במהירות את תמיסת הסרת הג'לי מהכוס.

מכסים מיד את הביצים בתמיסה של שטיינברג 0.1X כדי לשטוף את תמיסת הסרת הג'לי שנותרה. מערבבים בעדינות ואז שופכים את התמיסה. חזור על שלב זה ארבע פעמים כדי לשטוף היטב את העוברים.

העבירו את העוברים המפורקים לתמיסה של שטיינברג 1X בצלחת פטרי. כדי למזער את הצפיפות בתוך הצלחות, הניחו כ -100 עוברים לכל צלחת של 100 מילימטר. מיין את העוברים הבקיעים בשלב שני התאים לצלחת נפרדת שבה פיגמנטציה סטריאוטיפית מסמנת בביטחון את הגישה הגחונית הגבית בהתייחס ליצירת מפות סולפט.

זהה נכון עוברים מבקעים על ידי הקפדה על כך שתלם המחשוף הראשון, המסמן את המישור האמצעי, חוצה את משיכת החיה בעלת הפיגמנט הכהה ואת משיכת החיה בעלת הפיגמנט הקל כך ששני החצאים הם תמונות מראה. לאחר מכן, הרכיב מיקרופיפטה מפוברקת על מיקרומניפולטור רב-צירי. חבר את המיקרופיפטה למיקרו-מזרק.

השתמש בפיפטה להעברה מפלסטיק כדי לשאוב כחמישה מתוך שמונת העוברים של התאים ולהעביר אותם לתוך צלחת הדגימה המכילה תמיסת שטיינברג פי 0.5. באמצעות לולאת שיער, מקם את העובר לדגימה לבאר בודדת וודא שהתא המעניין שזוהה כהלכה פונה למיקרו-בדיקה בזווית משוערת של 90 מעלות. תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ הסטריאו, הנח את קצה המיקרופיפטה לתוך התא הבודד המזוהה בתוך העובר החי.

משוך חלק רצוי מתכולת התא על ידי הפעלת פולסים בלחץ שלילי על המיקרו-נימי באמצעות המיקרו-מזרק. החזר בעדינות את המיקרו-בדיקה מהתא והעביר את קצהו לארבעה מיקרוליטרים של ממס מיצוי המטבוליטים מקורר בבקבוקון בגודל מיקרו. לאחר מכן, הפעל נחשול לחץ של 80 psi חיובי למשך שנייה אחת על הנימים באמצעות המיקרו-מזרק כדי להוציא את השאיבה לתוך הממס.

סגור היטב את הבקבוקון כדי למנוע אידוי והנח את הבקבוקון בחזרה על הקרח עד להשלמת הדגימה. לאחר השלמת הדגימה, מערבבים מערבולת את הדגימה המכילה בקבוקוני מיקרו-צנטריפוגה למשך כדקה אחת כדי לזרז את מיצוי המטבוליטים. לאחר מכן, צנטריפוגה את הבקבוקונים ב-8,000 פעמים גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול פסולת תאית וחלקיקים אחרים.

אחסן את תמציות התאים יחד עם פסולת התא ומשקע במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך יום או במינוס 80 מעלות צלזיוס עד חודש עד למדידה על ידי CE-ESI-MS. בנה את פלטפורמת הזרקת CE המסוגלת לתרגום אנכי מהיר של שלב המחזיק את בקבוקון האלקטרוליט ברקע ואת טעינת הדגימה מיקרו-ויאלי כפי שמתייחס לפרוטוקול הטקסט. הרכיבו את ממשק CE-ESI על ידי הרכבה ראשונה של פולט המתכת האלקטרו-ספריי לתוך איחוד T בעל שלוש יציאות.

לאחר מכן, הזינו את נימי ה-CE ההפרדה דרך פולט האלקטרו-ספריי, מה שמאפשר לו לבלוט כ-40 עד 100 מיקרון מעבר לקצה הפולט. עבוד תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לסייע לדיוק. חבר את נימי תמיסת הגיליון ליציאה שנותרה כדי לספק את תמיסת האלקטרו-ספריי.

השתמש בשרוולים מתאימים ובחיבורים מהודקים באצבעות להפעלה ללא דליפות של ממשק CE-ESI. באמצעות מחזיק לוחות, הרכיב את ממשק CE-ESI על שלב תרגום תלת-צירי ומקם את קצה פולט האלקטרו-ספריי כשני מילימטרים מפתח ספקטרומטר המסה. כדי לנקות את רכיבי הממשק, ספק תחילה את תמיסת יריעת האלקטרו-ספריי דרך פולט האלקטרו-ספריי במיקרוליטר אחד לדקה ואת ה-BGE דרך נימי ההפרדה CE.

השתמש במשאבות מזרק כדי להאכיל את הממיסים בקצב קבוע. לאחר מכן, שטפו את נימי הפרדת CE לפני כל מדידה על ידי חיבור מזרק לקצה כניסת הנימים. השתמש במזרקים גדולים ביעילות כדי למזער מילוי מחדש ותחול של קווי אספקת ממס.

לאחר שטיפת נימי ההפרדה למשך כחמש דקות, העבירו את כניסתו לתמיסת BGE הממוקמת בבקבוקון הנירוסטה. מקם את קצה פולט האלקטרו-ספריי כשני מילימטרים מפתח ספקטרומטר המסה. Fine התאם מרחק זה באמצעות שלב תרגום ליצירת אלקטרוספריי במשטר סילון החרוט היציב תוך ניטור התרסיס באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.

עקוב אחר היציבות של זרם היונים הכולל או TIC למשך כ-30 עד 45 דקות כדי להבטיח פעולה יציבה. החל 21 פלוס מינוס שני קילו-וולט על בקבוקון ה-BGE על ידי הגדלה הדרגתית של הפוטנציאל במשך כ-15 שניות, בדרך כלל יצירת כ-7.5 מיקרו-אמפר של זרם על פני נימי ההפרדה תוך שימוש ב-1% אחוז חומצה פורמית כ-BGE. לפני כל מדידה, ודא את יציבות המערכת על ידי ניטור פרופיל ה-TIC למשך כחמש עד 10 דקות ולאחר מכן הורד בהדרגה את פוטנציאל ההפרדה לאפס וולט.

פיפטה מיקרוליטר אחד של התמיסה הסטנדרטית לקירור אצטיל לתוך בקבוקון ההזרקה והעבירה את נימי ההפרדה מבקבוקון ה-BGE לבקבוקון ההזרקה. הרם את שלב הזרקת CE 15 סנטימטרים בשנייה אחת. לאחר 60 שניות, הזרקו הידרודינמית שישה ננוליטרים מהדגימה לתוך נימי ההפרדה.

לאחר מכן, תרגם את השלב בחזרה לרמות ההתחלה והעבר בעדינות את קצה הכניסה הנימים לתוך ה-BGE. מיד לאחר מכן, הגדל את מתח CE כדי להתחיל הפרדה אלקטרופורטית ורכישת מצב EMA. לאחר גילוי התקן, עצור את קליטת הנתונים והורד את מתח ההפרדה בצעד לאפס וולט.

לאחר מכן, אחזר את הפולט לשני סנטימטרים מהפתח. שטוף את נימי ההפרדה למשך חמש דקות לפני ניתוח תמצית התאים. מדוד 10 ננוליטר של תמצית התא הבודד על ידי חזרה על שלבים אלה תוך 90 שניות כדי להזריק את הדגימה באופן הידרודינמי.

מוצגת כאן אלקטרופרוגרמה מייצגת של תמצית התא, בה מוצגת ההפרדה של סדרה של מטבוליטים מזוהים. 70 אותות שונים זוהו בביטחון גבוה כמטבוליטים קוטביים קטנים על סמך זמן ההגירה ודפוסי פיצול MS/MS של אותות חילוץ תאים בהשוואה לאלה מספריות ספקטרליות סטנדרטיות או מספריות ספקטרליות מסה טנדם. זיהוי מטבוליט מתבצע על ידי השוואת המסה המדויקת, זמן ההגירה והתנהגות הפיצול של האות הלא ידוע מהדגימה מול תקן המטבוליט או הנתונים הזמינים במסד נתונים של מטבוליטים.

שלב זה מודגם עבור היסטידין. כאן, תאי הגב הבודדים שזוהו ונדגמו באמצעות מיקרו-בדיקה CE-ESI-MS מוצגים בשלבים העובריים של שמונה תאים, 16 תאים ו-32 תאים. ניתוח רב מגוון של מטבוליטים שזוהו בשלושת סוגי התאים השונים חשף פרופילים מטבוליים שונים ומגמות מטבוליות מורכבות על פני שלבי התא.

ניתוח המרכיבים העיקריים של המטא-נתונים הכמותיים חשף שינויים מטבוליים כתא אב מזוהה של העובר בן שמונה התאים המחולק ליצירת שיבוט תאים בעובר בן 16 תאים ו-32 תאים. מגמות מייצגות מוצגות עבור מטבוליטים נבחרים. מטבוליטים כמו אצטילכולין פחתו בשפע עם חלוקת התאים, בעוד שטרולאמין וסרין/ארגינין הראו מגמות מנוגדות בסוגי תאים אלה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו מהר מאוד, בדרך כלל תוך פחות מ-10 שניות עבור כל תא. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר התחלנו במיפוי ההטרוגניות המטבולית של התאים בעובר המוקדם של קסנופוס לאביס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בספקטרומטריית מסה של אלקטרופורזה נימית של מיקרו-בדיקה כדי לנתח מטבוליטים בתאים עובריים בודדים.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד מהר מכיוון שהמטבולום דינמי והתאים מתחלקים במהירות בעובר המתפתח. כמו כן, בדוק פרטים אנליטיים כדי להבטיח שנאספים נתונים בעלי נאמנות איכותית גבוהה על חילוף החומרים בתאים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון דגימות חיות מכיוון שגישת ספקטרומטריית המסה של המיקרו-בדיקה שלנו עובדת במהירות, היא זעיר פולשנית ותואמת לדגימות קטנות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מעקב סולפט על מנת לענות על שאלות נוספות כמו השפעת מטבוליטים על מפרט הרקמות. אל תשכח שעבודה עם ספקי כוח במתח גבוה עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון בידוד חשמלי של ממשקים חשמליים בעת ביצוע הליך זה.