מדידה אוטומטיות של Cryptococcal מינים רב-סוכר כמוסה וגוף התא

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא אוטומציה של מדידות ידניות מייגעות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הקריפטוקוק, כגון הקשר בין גודל הקפסולה או גוף התא, וההיבטים השונים של אלימות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת ניתוח של נפחי דגימה עצומים ללא עייפות.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בקריפטוקוקוזיס, מכיוון שגודל הקפסולה וגוף התא הם היבטים חשובים של הפתוגן. כדי להכין שקופית דיו בהודו, התחל בהזרמת 10 מיקרוליטר של דגימת קריפטוקוק על שקופית. כל זן yi מעגלי עם עבודה, אבל לניסוי זה, H99 היה הזן היחיד שנעשה בו שימוש.

פיפטה שני מיקרוליטרים של כתם דיו הודי על הדגימה וערבבו אותו על ידי דחיפה פיזית של קצה הפיפטה לתוך הדגימה ותנועה בתנועה סיבובית עד שהדיו ההודי נראה מפוזר באופן שווה. הנח החלקת כיסוי מעל הדגימה על ידי החזקת הקצה השמאלי של החלקת הכיסוי כלפי מטה כנגד פני השקופית. לאחר מכן, הורד בעדינות ובאופן שווה את הצד הנגדי של הכיסוי להחליק מעל הדגימה.

הניחו לשקופית להתייבש באוויר למשך חמש דקות. לאחר מכן, מרחו שכבה קלה של לק על גבול החלקת הכיסוי כדי ליצור אטימה ולשמר את כתם הדיו ההודי. כדי לצלם את הדגימות, הנח שקופית מתחת למיקרוסקופ שדה בהיר עם חיבור המצלמה וההמרה הידועה של פיקסל למיקרון.

התאם את המסננים, המטרות והניגודים, וודא ששדה הראייה צפוף, אך לא מאוכלס יתר על המידה, עם תאים קריפטוקוקליים עם ניגודיות ברורה בין קפסולת התא לרקע, וממוקד כראוי עם גוף התא המוצג כרצועה כהה. לאחר צילום תמונות, שמור אותן בספרייה אחת עם כותרות ברורות, שכן אלגוריתם המדידה יופעל על תמונות בספרייה אחת ונתוני הפלט יהיו מאורגנים לפי שמות קבצי התמונה. לאחר הגדרת האלגוריתם לפי פרוטוקול הטקסט, הפעל את האפליקציה על ידי לחיצה כפולה על QCA.py.

תוך כדי ביצוע השלבים המתוארים בתוכנית, הזן את סוג הסיומת של קבצי התמונה, לפניה נקודה ומופרדים באמצעות נקודה-פסיק. לאחר מכן, לחץ על כפתור Enter. בחר את הספרייה שבה ממוקמים קובצי התמונות בלחיצה על הלחצן Select Directory ובחר בתיקייה הכוללת את התמונות.

צור את רשימת קבצי התמונות בספרייה על ידי לחיצה על הלחצן צור רשימת תמונות. התמונות יופיעו בתיבת הטקסט מימין. בדוק וודא שהרשימה מדויקת ומלאה.

לאחר מכן, בחר תמונה אקראית מהרשימה שתשמש כתצוגה מקדימה על-ידי לחיצה על הלחצן Select Random Image. לאחר מכן, הזן את מטרת המיקרוסקופ ואת הגדרות ה-binning. אם הגדרות ברירת המחדל אינן תואמות למיקרוסקופ שנעשה בו שימוש, בחרו 'המרת פיקסלים מותאמת אישית' והזינו את המרת הפיקסל למיקרומטר לקובצי התמונה.

לאחר הבחירה, לחץ על חשב המרה כפתור וודא שההמרה נכונה בהתאם לתיבת הטקסט בצד ימין. כדי להזין את פרמטרי האלגוריתם לזיהוי מעגל, הזן את הרדיוס המינימלי והמקסימלי הניתן לזיהוי עבור זיהוי הקפסולה החיצונית, כפי שנכנס רדיוס הקפסולה המינימלי והמקסימלי. לאחר מכן, הזן את הרדיוס המינימלי והמקסימלי הניתן לזיהוי גוף התא כערך רדיוס גוף התא המינימלי והמקסימלי.

כעת, הזז את מחווני הרגישות של הקפסולה וגוף התא כדי להתאים את סף הרגישות של האלגוריתם. רגישות נמוכה תהיה קפדנית, ותפחית את זיהוי המעגלים החיוביים השגויים, אך עשויה גם לזהות פחות עיגולים אמיתיים. לעומת זאת, רגישות גבוהה תגדיל את קצב הזיהוי, אך עלולה גם לגרום למעגלים חיוביים כוזבים.

הגדל את מספר הגופים והקפסולות שזוהו ובדוק חזותית אם העיגולים נראים מתאימים כהלכה. מספר הגופים בתוך הקפסולות שזוהו יוצג בתיבת הטקסט מימין. אחרת, תפעל את פרמטרי האלגוריתם עד שהתוצאות יהיו מדויקות.

הפעל את אלגוריתם הזיהוי בכל ספריית קובצי התמונה בלחיצה על הלחצן התחל ניתוח. כל תמונה תנותח והתוכנית תציג סיים בתיבת הטקסט מימין כאשר כל התמונות נותחו. לאחר מכן, לחץ על כפתור התאמה וניקוי.

זה יתאים את גופי התאים שזוהו לקפסולות שזוהו בהן הם שוכנים, ויחשב את רדיוס הקפסולה האמיתי על ידי הפחתת הגוף מהקפסולה. בספריית התמונות, אתר את הנתונים שהושלמו ב- CleanedOutput. csv.

אם נבחרה פיסת נתונים אחת בלבד, הקובץ יסומן בתווית CleanedBodies. csv או CleanedCapsules.csv. כפי שניתן לראות כאן בתמונה המיקרוסקופית הזו של שקופית דיו בהודו, התאים מופרדים ובצפיפות נמוכה מספיק כדי לא להציף את שדה הראייה.

נעשה שימוש גם בכמות מספקת של כתמים ליצירת ניגודיות בין התאים לרקע. האלגוריתם קובע סף ייחודי לכל תמונה על ידי לקיחת ערך העוצמה הממוצע והוספת סטיית התקן. עוצמות פיקסלים בעוצמה גבוהה מהסף נחשבות לבנות, ובעוצמה נמוכה יותר נחשבות לשחורות.

יש לדמיין את גוף התא כעיגול שחור חזק על הרקע הלבן של הקפסולה. מישור המוקד הטוב ביותר לשימוש הוא זה שבו גוף התא מופיע כרצועה כהה ומרוכזת. מישור מוקד זה מקובל כסטנדרט, מכיוון שהוא ממקד כראוי את התא.

זה אושר על ידי הדמיה של דופן התא עם UVITEX, מעין כתם שברור שהוא דופן תא חד וממוקד עם אות חלש במרכז. כאשר מקפידים על הפרוטוקול במדויק ומתקבלות תמונות אופטימליות, האלגוריתם מדויק ואמין. עם זאת, אם הפרוטוקול מתבצע בצורה לא נכונה ומתקבלות תמונות לא אופטימליות עקב צביעה לקויה, צפיפות יתר או פרמטרים אחרים שהוזכרו קודם לכן, האלגוריתם מאבד דיוק ואינו יכול לסכם מדידות אנושיות.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-10 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לקבל תחושה של רכישת תמונות אופטימליות מבעוד מועד, כך שתהיה מוכן בעת רכישת דוגמאות אמיתיות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחקר הקריפטוקוקלי לחקור את גדלי הגוף של קפסולות ותאים בכל מערכת הדמיה שבה השניים מוצגים בבירור.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד למדוד כמוסות קריפטוקוקליות וגופי תאים. אל תשכח שעבודה עם קריפטוקוקוס עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון בטיחות BSL2 בסיסית בעת ביצוע הליך זה.