Name: מדידה אוטומטיות של Cryptococcal מינים רב-סוכר כמוסה וגוף התא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: למד שימוש באלגוריתם עיבוד תמונה אוטומטי למדידת קפסולה וגוף תא ב-Cryptococcus neoformans. השיטה משפרת דיוק ומאפשרת ניתוח נפחי דגימות גדולות לחקר גורמי נגיפיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו רוצים להכיר בואן אנתוני שקופיות אשר שימשו השוואה side-by-side האדם השני, כמו גם סברינה נולאן שקופיות אשר שימשו כמו השלישי אנושי-לצד השני השוואה מיקרוסקופ.

1. הכנת שקופית אינדיה אינק
<ol><li>פיפטה 10 µL מדגם cryptococcal לשקופית. כל זן שמרים מעגלית תפעל אך עבור ניסוי זה H99 היה המתח היחידים בשימוש. הערה: אם המדגם הוא ישירות מתוך תרבות המדיה, דילול 1:2 עם PBS או מים יכול לסייע למנוע את הדיו הודו הצליעה.</li>
	<li>פיפטה 2 µL של כתם דיו הודו על המדגם ומערבבים על ידי דוחף את הטיפ פיפטה לדגימת ופיזית נע בתנועה סיבובית להופעת הדיו הודו המתפלג.</li>
	<li>הצב של coverslip על המדגם על-ידי החזקת הקצה השמאלי של coverslip מפני השטח של השקופית, ואז בעדינות ובצורה שווה להורדת הנגדי של coverslip על המדגם.</li>
	<li>לאפשר את השקופית מהאוויר להתייבש במשך 5 דקות.</li>
	<li>בעדינות להחיל שכבה של לק coverslip הגבול טופס גושפנקה ולשמר את הכתם אינדיה אינק.</li>
</ol>2. הדמיה שקופיות
<ol><li>מקום שקופיות מיקרוסקופ שדה בהיר עם המצלמה המצורף, המרת פיקסלים-כדי-מיקרו-ידוע. התאם מסננים, מטרות וחדות כך תא קפסולות ברורים ולא תא הגופות להקות ממוקד, כהה. הערה: שונים מסננים, מטרות והגדרות ניגודיות יעבוד אבל 20 x אובייקטיבי, Ph1 מסנן ו- 2 x 2 binning מומלץ.</li>
	<li>ודא שדה הראיה צפוף אבל לא כבדה ומזיהום עם התאים cryptococcal, עם ניגודיות ברורה בין כמוסה תא ורקע, וממוקד כראוי עם גוף התא דמיינו כלהקה כהה. הערה: המספר המדויק של תאים עבור תמונה אופטימלית ישתנו בהתאם לדוגמה המטרה בשימוש. ההיבטים החשובים הם כדי להבטיח התאים אינם מקובצים באשכולות או חופפים, כי המטוסים מוקד תא ולא ישתנו באופן משמעותי, וזה משמעותי דיו הודו כתם בבירור ברקע (לפחות 25% של השדה).</li>
	<li>לשמור תמונות ספריה בודדת עם כותרות ברורות, האלגוריתם מדידה יופעלו על תמונות ספריה בודדת, נתוני הפלט ימוינו לפי השמות של קבצי התמונות.</li>
</ol>3. אלגוריתם ההתקנה
<ol><li>התקנת פייתון גירסה 2.7 מ</li>
	<li>התקן ספריות פיתון נוספים על ידי הפעלת הפקודות "פיפ להתקין את הכרית", "פיפ להתקין את openpyxl".</li>
	<li>התקנת MATLAB בהתאם להוראות המפורטות ב</li>
	<li>מבנה הספרייה פיתון MATLAB על-ידי ביצוע ההוראות המפורטות ב- https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.</li>
	<li>להוריד את הקבצים הדרושים שלוש הכלולות בחומרים של כתב יד זה משלים ("QCA.py", "Analysis2.m" ו- "TestRun.m"). הערה: קבצים אלה ניתן לחילוץ לכל מקום, אבל שלושתן חייב להיות באותה ספריה.</li>
</ol>4. שימוש באלגוריתם
<ol><li>הפעל את היישום על-ידי לחיצה כפולה על QCA.py. הערה: היישום עשוי להימשך מספר דקות כדי להתחיל. קובץ ה-"QCA.py" מכיל את מבנה תוכנית שקוראת את הקבצים "דדי כהן" כדי להפעיל את האלגוריתם בפועל.</li>
	<li>בצע את השלבים המפורטים בתכנית.<ol>
<li>הקלט סוג הסיומת של קבצי התמונות ולפניהם תקופה, כשהם מופרדים באמצעות תווי נקודה-פסיק (ex. ". TIF;. jpeg") ואז לחץ לחצן Enter .</li>
		<li>בחר את הספריה שבה ממוקמים את קובצי התמונה על-ידי לחיצה על לחצן בחר מדריך ובחירת התיקיה המכילה את התמונות.</li>
		<li>צור הרשימה של קבצי תמונה בספריה על-ידי לחיצה על לחצן צור רשימת התמונה . התמונות יפורטו בתיבת הטקסט לימין. לסקור, ודא שהרשימה מדויקים ומלאים.</li>
		<li>בחר תמונה אקראית מתוך הרשימה שתשמש תצוגה מקדימה על-ידי לחיצה על לחצן בחר תמונה אקראית . הערה: אם התמונה היא אפשרות לפתוח עקב "שגוי תמונת מצב שגיאה", האלגוריתם ימשיכו לפעול כראוי למרות לא מציג את התמונה. לאחר שלב 4.2.7, עדיין להציג תמונת הבדיקה.</li>
		<li>קלט מיקרוסקופ אובייקטיבית, binning הגדרות. אם הגדרות ברירת המחדל אינם תואמים המיקרוסקופ משמש, בחר מותאמת אישית פיקסל המרה"ולהזין פיקסל-כדי-אום ההמרה עבור קבצי תמונה. לאחר הבחירה, לחץ על כפתור חישוב המרה ולהבטיח שההמרה היא הנכונה לפי תיבת הטקסט בצד הימין. הערה: להחליפן בתמונות המוצגות באיור 1 חושבו עם 40 x הגדלה ו 2 x 2 binning שנבחר.</li>
		<li>קלט פרמטרי האלגוריתם לזיהוי עיגול.<ol>
<li>קלט את רדיוס מינימום ומקסימום לזיהוי איתור קפסולה החיצוני כערכים Min ו- Max כמוסה רדיוס. מגוון קטן יותר יאפשר תוצאות מדויקות יותר.</li>
			<li>קלט את רדיוס מינימום ומקסימום לזיהוי לגילוי גוף התא כערכים Min ו- Max גוף התא Radius. הערה: כל ארבעת ערכים אלה צריכים להיות מספרים המייצגים את הערכים המתאימים שלהם בפיקסלים, על פי תמונות המקור.</li>
			<li>הזז את המחוונים כמוסה ורגישות לגוף התא כדי להתאים את סף הרגישות של האלגוריתם. רגישות נמוכה יהיה נוקשה, להפחית את זיהוי מעגל חיובי כוזב, אך עלולה גם לאתר פחות עיגולים אמיתיים. לעומת זאת, רגישות גבוהה יגדל שיעור גילוי, אך עלולה גם במעגלים חיובי כוזב. הערה: נציג התוצאות התקבלו עם מינימום רדיוס קפסולה של 7, רדיוס קפסולה מקסימלית של 45, הגוף מינימום רדיוס של 4, הגוף המרבי ברדיוס של 30, רגישות קפסולה של 87, ורגישות הגוף של 87.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בדוק את הפרמטרים בתמונה שנבחרו באקראי על ידי לחיצה על לחצן הפעל בדיקת . התוצאות יוצגו במרכז העליון של התוכנית, החלפת התמונה המקורית. אם התוצאות נראות מדויק, מומלץ לבחור תמונה אקראית נוספים כדי לנסות כמו גם להבטיח שערכי הפרמטרים יתאימו לכל התמונות שנבחרו.<ol>
<li>להגדיל את מספר הגופות, קפסולות זוהה באופן חזותי לבחון החוגים יופיעו כדי להתאים כראוי. מספר הגופות בתוך קפסולות זוהה יוצג בתיבת הטקסט לימין. אחרת, לשנות את הפרמטרים אלגוריתם עד התוצאות מדויקות. הערה: עיגולים צבעוניים עבים הם רק. כדי לעזור עם פריט חזותי. החוגים בפועל שנוצר למדידה הוא עקומה מתמטית מחושב על ידי האלגוריתם של HCT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להפעיל את אלגוריתם זיהוי על הספריה כולה של קבצי תמונה על-ידי לחיצה על לחצן להתחיל בניתוח . כל תמונה ינותחו ויציג התוכנית "סיים" בתיבת הטקסט ימינה כאשר יש כבר ניתחו את כל התמונות.</li>
		<li>לחץ על הלחצן התאמה וניקוי . זה תואם הגופות שזוהו תא הקפסולות שזוהו שהם מתגוררים, לחשב את רדיוס קפסולה נכון על-ידי חיסור מהגוף כמוסה. הערה: אם האלגוריתם נמצא בשימוש כדי לזהות קרינה פלואורסצנטית או מצב אחר שבו מעגל היחידה היא מזוהה שלב זה הוא מיותר. במקום לחץ על הגופים למשוך רק או לחצן קפסולות למשוך רק כדי לאסוף את הנתונים רק את הכחול או רק את עיגולים ירוקים, בהתאמה. חשוב לציין כי אם רק אחזור הנתונים קפסולה הרדיוס יפנה מהרדיוס הכולל של התא כפי הרדיוס של גוף התא לא יכול להיות מופחתים.</li>
		<li>לאתר את הנתונים הושלמה בקובץ "CleanedOuput.csv" בספריית תמונות. אם רק חתיכה אחת של נתונים נבחרה, יסומנו כסעיפים את הקובץ "CleanedBodies.csv" או "CleanedCapsules.csv".</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li>
<li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii%2C+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760(2014).</li>
<li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508(1985).</li>
<li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.neurology.org/content/80/7_Supplement/P04.007">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007(2013).</li>
<li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
<li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li>
<li>Araujo, G. deS., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561(2012).</li>
<li>García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+neoformans+CAP59+%28or+Cap59p%29+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li>
<li>Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2891871/">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li>
<li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC219591/">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li>
<li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

השלבים הקריטיים של טכניקה זו מכין את השקופית אינדיה אינק, רכישת תמונות מיקרוסקופ. בעוד האלגוריתם נבדק בהצלחה עם מגוון רחב של טכניקות שקופיות ותמונה הפרוטוקול המומלץ מתואר בכתב היד. הקפסולה רב-סוכר מזוהה בהתבסס על הכללת חלקיקי דיו הודו מהתחום של הקפסולה, כמו חלקיקי האלה גדולות מדי לחדור לרשת fibril רב-סוכר. אינדיה אינק הדרה תוצאות במעגל בהיר על רקע כהה. האלגוריתם יזהה חוגים מבוסס על מה טוב הם חדות עם הרקע שלהם. לפיכך, כתם דיו הודו כבד יגרום חדות גבוהה יותר בין רב-סוכר כמוסה ורקע, הגדלת האות לרעש יחס ושיפור איכות התוצאה. ל...

קריפטוקוקוס neoformans היא פטרייה פתוגניים נמצאו ubiquitously ברחבי העולם המשויך מחלות אנושיות בעיקר באוכלוסיות immunosuppressed. Neoformans ג שהבולט מהווה גורם משמעותי סך מקרי המוות השנתי ב אפריקה שמדרום לסהרה עקב מחלה זיהומית1. הביטוי הקליני העיקריים של זיהום cryptococcal הוא meningoencephalitis, אשר עוקב אחר הפלישה של מערכת העצבים המרכזית על ידי תחבורה נגוע מקרופאגים (הסוס הטרויאני באופן) או מעבר ישיר של מחסום הדם - מוח. Neoformans ג מבטא מספר גורמים התקפה אלימה, כולל היכולת לשכפל את טמפרטורת גוף נורמלית, פעילות אוראז, melanization, ואת היווצרות קפסולה רב-סוכר2. הקפסולה רב-סוכר מורכב חוזרות glucuronoxylomannan glucoronoxylomannangalactan פולימרים והפונקציות כמחסום מגן נגד גורמי עקה ו מארח תגובות חיסוניות2.
למרות הגודל לגודל הקפסולה cryptococcal רב-סוכר לא עקבי שויכה התקפה אלימה, יש ראיות כי זה גורם פתוגנזה2,3,4,5, 6,7. גודל קפסולה מזוהה עם דלקת קרום המוח פתולוגיה6, יכול להשפיע על מקרופאג היכולת לשלוט קריפטוקוקוס זיהום5, יכול לגרום לאובדן של התקפה אלימה אם נעדר8. לפיכך, מדידות גודל קפסולה נפוצים במחקר cryptococcal, אבל יש fieldwide אין תקן שיטת מדידה קפסולה.
כיום, neoformans ג רב-סוכר קפסולה המדידה מבוססת על מדידות ידניות של תמונות מיקרוסקופ, השיטות המדויק של רכישות התמונה והן מידה משתנים על פני מעבדות9,10, 11. הדאגה המיידית לשיטה זו היא כי מספר מחקרים דורשים הרכישה של אלפי מדידות, מה שהופך ולשמירה על רמת דיוק ואמינות קשה. יתר על כן, גם כאשר מתפרסמות התוצאות, יש לעיתים קרובות תיאור לקוי של שיטת מדידה. פרסומים רבים לא מסבירים איך המדידות שלהם התקבלו, איזה מטוס מוקד שימש, איך הם קבעו את הסף עבור זיהוי קפסולה, בין אם הם השתמשו רדיוס או קוטר, בין אם הם השתמשו מדידה אחת או בממוצע מספר, או אחרים פרטים. כמה פרסומים היחידה המדינה שלהם לשיטה כמו איזו תוכנית ששימשה, למשל, "Adobe Photoshop CS3 שימש כדי למדוד את התאים"11. חוסר פירוט תקנון ודיווח באפשרותך להפוך הפארמצבטית קשה אם לא בלתי אפשרי. הבדלים הראייה האנושי, בהירות המחשב, ההגדרות מיקרוסקופ, שקופיות תאורה, גורמים אחרים יכולים להשתנות לא רק בין יחידים אלא בין דגימות, ואילו חישובים בהתבסס על יחסי גודל של פיקסל ערכי העוצמה יישאר קבוע, החלים בין הדגימות. טכניקה זו נוצר בהקשר של מתן טכניקה סטנדרטית, מדויק, מהיר ופשוט למדוד גדלים קפסולות של שדה שבו היה קודם.
כאמור, האלגוריתם CHT ותיקה, קבצי script כדי לזהות באופן אוטומטי את העיגולים נכתבו לפני. שיטה זו משפרת בשני תחומים איפה סקריפטים אחרים יפול קצר. ראשית, גילוי פשוט עיגולים אינה מספיקה, כי עם תאים cryptococcal שני מעגלים נפרדים חייב להתגלות אחד ביחס לשני. שיטה זו במיוחד מזהה תא גופות בתוך קפסולות מפלה בין השניים, מבצעת את החישובים רק על זוגות הגוף-קפסולת הרלוונטיים. שנית, אפילו כאשר בעקבות באותו פרוטוקול, חוקרים שונים יגיעו עם שונה רכשה תמונות. בכך שהוא מאפשר את השליטה חוקר כל פרמטר אלגוריתם, כלי זה יכול להיות מותאם כדי להתאים למגוון רחב של שיטות רכישה. יש צורך היקף מתוקננת, המטרה, סינון וכן הלאה.
טכניקה זו ניתן בקלות ליישם בכל מצב שבו החוקר צריך לזהות החוגים בתוך תמונה בניגוד עם הרקע שלהם. שניהם עיגולים בהיר יותר וכהה יותר הרקע שלהם יכול להתגלות, ספרתי, נמדד בעזרת טכניקה זו.

<table><tbody><tr><td>הודו דיו</td><td>בקטון, דיקינסון ושות'.</td><td></td><td></td>261194</tr><tr><td>פישרברנד סופרפרוסט מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-143</td><td>25x75x1</td></tr><tr><td>פישר פרימיום כיסוי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-548-B</td><td>22x22-1</td></tr><tr><td>סאלי הנסן Hardasציפורניים Xtreme ללבוש לק</td><td>סאלי הנסן</td><td>N/A</td><td>109 בלתי נראה</td></tr><tr><td>SAB מדיה</td><td>סיגמא</td><td>S3306</td><td></td></tr><tr><td>קריפטוטוקוס neoformans</td><td>ATCC</td><td>208821</td><td>זן H99</td></tr><tr><td>אולימפוס AX70 מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>AX70TRF</td><td>הופסק ; מיקרוסקופ שדה בהיר</td></tr><tr><td>Qimaging Retiga 1300</td><td>Qimaging</td><td>N/A</td><td>הופסק ; מצורף למיקרוסקופ מצלמה</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>הגרסה העדכנית ביותר מומלצת</td></tr><tr><td>שפת תכנות</td><td>Python</td><td>Python N/A</td><td>גרסה 2 הכרחית; 2.7 מומלץ</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>הגרסה האחרונה המומלצת</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידה אוטומטיות של cryptococcal מינים רב-סוכר כמוסה וגוף התא

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

מטרת טכניקה זו היא לספק תהליך עקבי, מדויק, הניתנים לניהול והגמישים עבור מספרים גדולים של מדידות קפסולה רב-סוכר.
ראשית, תמונת הסף נוצר בהתבסס על ערכי העוצמה מחושב באופן ייחודי עבור כל תמונה. לאחר מכן, עיגולים מזוהים בהתבסס על הניגוד בין אובייקט לבין רקע בעזרת האלגוריתם מעגל האף טרנספורמציה (CHT) ומבוססת. לבסוף, תא שזוהו קפסולות של גופים מתאימים על פי קואורדינטות מרכז ואת גודל הרדיוס, הנתונים מיוצאים אל המשתמש בגיליון לניהול.
היתרונות של שיטה זו הם פשוטים אך משמעותי. הראשון, כי חישובים אלה מבוצעים על ידי אלגוריתם מאשר אדם דיוק ואמינות הוגדלה. אין שום ירידה הדיוק או המהימנות בין כמה דוגמאות מנותחות. שנית, גישה זו מבססת על סטנדרטי פוטנציאליים עבור השדה קריפטוקוקוס במקום המצב הנוכחי שבו מדידה קפסולה משתנה על ידי המעבדה. שלישית, מכיוון שטווח המידות קפסולה ידני הם איטי ומונוטוני, אוטומציה מאפשר מדידות מהירה על מספר גדול של תאי שמרים בתורו המקל על תפוקה גבוהה ניתוח נתונים וסטטיסטיקות חזק יותר ויותר.
המגבלות הגדולות של טכניקה זו בא איך הפונקציות אלגוריתם. ראשית, האלגוריתם יפיק רק מעגלים. בעוד קריפטוקוקוס תאים וכמוסות שלהם לקחת על מורפולוגיה מעגלית של, זה יהיה קשה ליישם טכניקה זו לאיתור אובייקט שאינו עגול. שנית, בשל כמה עיגולים מזוהים האלגוריתם CHT יכול לזהות עצום עיגולים המדומה המבוססת על הקצוות החיצוניים של מעגלים באשכולות. עם זאת, גופות תא מטעים המוצגים נתפס בתוך המעגל מדומה בקלות ועוזרת להסיר ערכות הנתונים הנוצרת.
טכניקה זו מיועד למדידת הקפסולות רב-סוכר מעגלית של מינים קריפטוקוקוס בהתבסס על מיקרוסקופיית שדה בהיר דיו הודו; אבל זה יכול להיות מיושם על חדות אחרות מבוסס אובייקט עגול מדידות.

תמונות מתקבלים לראשונה על ידי מיקרוסקופ של דיות שקופיות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר בשילוב עם מצלמה (איור 1א'). חשוב לקבוע תאים נפרדו, בצפיפות נמוכה מספיק לא להכריע בתחום התצוגה, כמו גם באשר להשתמש הכתם מספיק כדי ליצור ניגודיות בין תאים לבין הרקע. כאמור בפרוטוקול, המספר המדויק של תאים עבור תמונה אופטימלית ישתנו בהתאם לדוגמה, מיקרוסקופ, המטרה בשימוש. ההיבטים החשובים הם כדי להבטיח התאים אינם מקובצים באשכולות או חופפים, כי המטוסים מוקד תא ולא ישת...

טכניקה זו מתאר של אצווה אוטומטיות מעבד שנועד למדוד את רדיוס כמוסה וגוף רב-סוכר. אמנם תוכנן בתחילה למדידות קפסולה קריפטוקוקוס neoformans מעבד התמונות האוטומטי ניתן גם ליישם אחרים ניגוד המבוסס על זיהוי אובייקטים מעגלית.

מדידה אוטומטיות של Cryptococcal מינים רב-סוכר כמוסה וגוף התא

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא אוטומציה של מדידות ידניות מייגעות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הקריפטוקוק, כגון הקשר בין גודל הקפסולה או גוף התא, וההיבטים השונים של אלימות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת ניתוח של נפחי דגימה עצומים ללא עייפות.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בקריפטוקוקוזיס, מכיוון שגודל הקפסולה וגוף התא הם היבטים חשובים של הפתוגן. כדי להכין שקופית דיו בהודו, התחל בהזרמת 10 מיקרוליטר של דגימת קריפטוקוק על שקופית. כל זן yi מעגלי עם עבודה, אבל לניסוי זה, H99 היה הזן היחיד שנעשה בו שימוש.פיפטה שני מיקרוליטרים של כתם דיו הודי על הדגימה וערבבו אותו על ידי דחיפה פיזית של קצה הפיפטה לתוך הדגימה ותנועה בתנועה סיבובית עד שהדיו ההודי נראה מפוזר באופן שווה. הנח החלקת כיסוי מעל הדגימה על ידי החזקת הקצה השמאלי של החלקת הכיסוי כלפי מטה כנגד פני השקופית. לאחר מכן, הורד בעדינות ובאופן שווה את הצד הנגדי של הכיסוי להחליק מעל הדגימה.הניחו לשקופית להתייבש באוויר למשך חמש דקות. לאחר מכן, מרחו שכבה קלה של לק על גבול החלקת הכיסוי כדי ליצור אטימה ולשמר את כתם הדיו ההודי. כדי לצלם את הדגימות, הנח שקופית מתחת למיקרוסקופ שדה בהיר עם חיבור המצלמה וההמרה הידועה של פיקסל למיקרון.התאם את המסננים, המטרות והניגודים, וודא ששדה הראייה צפוף, אך לא מאוכלס יתר על המידה, עם תאים קריפטוקוקליים עם ניגודיות ברורה בין קפסולת התא לרקע, וממוקד כראוי עם גוף התא המוצג כרצועה כהה. לאחר צילום תמונות, שמור אותן בספרייה אחת עם כותרות ברורות, שכן אלגוריתם המדידה יופעל על תמונות בספרייה אחת ונתוני הפלט יהיו מאורגנים לפי שמות קבצי התמונה. לאחר הגדרת האלגוריתם לפי פרוטוקול הטקסט, הפעל את האפליקציה על ידי לחיצה כפולה על QCA.py.תוך כדי ביצוע השלבים המתוארים בתוכנית, הזן את סוג הסיומת של קבצי התמונה, לפניה נקודה ומופרדים באמצעות נקודה-פסיק. לאחר מכן, לחץ על כפתור Enter. בחר את הספרייה שבה ממוקמים קובצי התמונות בלחיצה על הלחצן Select Directory ובחר בתיקייה הכוללת את התמונות.צור את רשימת קבצי התמונות בספרייה על ידי לחיצה על הלחצן צור רשימת תמונות. התמונות יופיעו בתיבת הטקסט מימין. בדוק וודא שהרשימה מדויקת ומלאה.לאחר מכן, בחר תמונה אקראית מהרשימה שתשמש כתצוגה מקדימה על-ידי לחיצה על הלחצן Select Random Image. לאחר מכן, הזן את מטרת המיקרוסקופ ואת הגדרות ה-binning. אם הגדרות ברירת המחדל אינן תואמות למיקרוסקופ שנעשה בו שימוש, בחרו 'המרת פיקסלים מותאמת אישית' והזינו את המרת הפיקסל למיקרומטר לקובצי התמונה.לאחר הבחירה, לחץ על חשב המרה כפתור וודא שההמרה נכונה בהתאם לתיבת הטקסט בצד ימין. כדי להזין את פרמטרי האלגוריתם לזיהוי מעגל, הזן את הרדיוס המינימלי והמקסימלי הניתן לזיהוי עבור זיהוי הקפסולה החיצונית, כפי שנכנס רדיוס הקפסולה המינימלי והמקסימלי. לאחר מכן, הזן את הרדיוס המינימלי והמקסימלי הניתן לזיהוי גוף התא כערך רדיוס גוף התא המינימלי והמקסימלי.כעת, הזז את מחווני הרגישות של הקפסולה וגוף התא כדי להתאים את סף הרגישות של האלגוריתם. רגישות נמוכה תהיה קפדנית, ותפחית את זיהוי המעגלים החיוביים השגויים, אך עשויה גם לזהות פחות עיגולים אמיתיים. לעומת זאת, רגישות גבוהה תגדיל את קצב הזיהוי, אך עלולה גם לגרום למעגלים חיוביים כוזבים.הגדל את מספר הגופים והקפסולות שזוהו ובדוק חזותית אם העיגולים נראים מתאימים כהלכה. מספר הגופים בתוך הקפסולות שזוהו יוצג בתיבת הטקסט מימין. אחרת, תפעל את פרמטרי האלגוריתם עד שהתוצאות יהיו מדויקות.הפעל את אלגוריתם הזיהוי בכל ספריית קובצי התמונה בלחיצה על הלחצן התחל ניתוח. כל תמונה תנותח והתוכנית תציג סיים בתיבת הטקסט מימין כאשר כל התמונות נותחו. לאחר מכן, לחץ על כפתור התאמה וניקוי.זה יתאים את גופי התאים שזוהו לקפסולות שזוהו בהן הם שוכנים, ויחשב את רדיוס הקפסולה האמיתי על ידי הפחתת הגוף מהקפסולה. בספריית התמונות, אתר את הנתונים שהושלמו ב- CleanedOutput. csv.אם נבחרה פיסת נתונים אחת בלבד, הקובץ יסומן בתווית CleanedBodies. csv או CleanedCapsules.csv. כפי שניתן לראות כאן בתמונה המיקרוסקופית הזו של שקופית דיו בהודו, התאים מופרדים ובצפיפות נמוכה מספיק כדי לא להציף את שדה הראייה.נעשה שימוש גם בכמות מספקת של כתמים ליצירת ניגודיות בין התאים לרקע. האלגוריתם קובע סף ייחודי לכל תמונה על ידי לקיחת ערך העוצמה הממוצע והוספת סטיית התקן. עוצמות פיקסלים בעוצמה גבוהה מהסף נחשבות לבנות, ובעוצמה נמוכה יותר נחשבות לשחורות.יש לדמיין את גוף התא כעיגול שחור חזק על הרקע הלבן של הקפסולה. מישור המוקד הטוב ביותר לשימוש הוא זה שבו גוף התא מופיע כרצועה כהה ומרוכזת. מישור מוקד זה מקובל כסטנדרט, מכיוון שהוא ממקד כראוי את התא.זה אושר על ידי הדמיה של דופן התא עם UVITEX, מעין כתם שברור שהוא דופן תא חד וממוקד עם אות חלש במרכז. כאשר מקפידים על הפרוטוקול במדויק ומתקבלות תמונות אופטימליות, האלגוריתם מדויק ואמין. עם זאת, אם הפרוטוקול מתבצע בצורה לא נכונה ומתקבלות תמונות לא אופטימליות עקב צביעה לקויה, צפיפות יתר או פרמטרים אחרים שהוזכרו קודם לכן, האלגוריתם מאבד דיוק ואינו יכול לסכם מדידות אנושיות.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-10 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לקבל תחושה של רכישת תמונות אופטימליות מבעוד מועד, כך שתהיה מוכן בעת רכישת דוגמאות אמיתיות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחקר הקריפטוקוקלי לחקור את גדלי הגוף של קפסולות ותאים בכל מערכת הדמיה שבה השניים מוצגים בבירור.לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד למדוד כמוסות קריפטוקוקליות וגופי תאים. אל תשכח שעבודה עם קריפטוקוקוס עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון בטיחות BSL2 בסיסית בעת ביצוע הליך זה.

automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים בדיקת היצמדות אופסונו-לבחינת האינטראקציה בין חיידקים שעברו אופסונציה לבין תאי מערכת החיסון. חיידקים המסומנים בפלואורסצנטית, מטופלים בסרום בדיקה המכיל נוגדנים נגד קפסולות, מודגרים עם מקרופאגים. לאחר צביעת המקרופאגים בפלואורסצנטיות, החיידקים המחוברים על פני המקרופאגים נצפים תחת מיקרוסקופ לצורך הדמיה.

בדיקת היצמדות אופסונו-להערכת האופסוניזציה של חיידקים עטופים על ידי נוגדנים נגד קפסולות

הנה, אנחנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בcytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח בתרבות. טכניקה זו יכולה לשמש כאלטרנטיבה לספירת CFU.

שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

אנו מציגים שיטה מודולרית אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי ואפיון של אקסופוליסכרידים מיקרוביאליים בקנה מידה קטן. שיטה זו משלבת בחירה מוקדמת מהירה לניתוח הכמות הכוללת של פוליסכרידים המופרשים עם טביעת אצבע מפורטת של פחמימות כדי לאפשר סינון מהיר של זני חיידקים שבודדו לאחרונה או אוספי זנים שלמים.

פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

הקפסולה רב-סוכר הוא הגורם העיקרי התקפה אלימה , קריפטוקוקוס neoformans , גודלו בקורלציה עם זן התקפה אלימה. מידות קוטר קפסולה משמשים בבדיקות פנוטיפי וכדי להעריך את היעילות הטיפולית. כאן מוצגת שיטה סטנדרטית האינדוקציה קפסולה, שתי שיטות של צביעת ומדידת קוטר מושווים.

גודל ענייני: מדידה של הקפסולה בקוטר של neoformans קריפטוקוקוס

נדגים את השימוש צפיפות מקוטע הדרגתיים כדי להפריד בין אוכלוסיות חיידקים המבוססת על ייצור כמוסה. שיטה זו משמשת כדי להשוות בין כמות קפסולה בין תרבויות, לבודד מוטנטים עם פנוטיפ קפסולה ספציפית, או כדי לזהות הרגולטורים כמוסה. המתוארים כאן הוא אופטימיזציה ריצה של וזמינותו.

הפרדת חיידקים על ידי כמות הקפסולה באמצעות הדרגה צפיפות מקוטע

נייר זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ו אמבות כי הוא למד באמצעות עדיין, תמונות פלורסנט ברזולוציה גבוהה שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. מומחש כאן היא הדרך שבה נתונים כמותיים יכולים להשלים מידע איכותי כזה.

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

פרוטוקול זה נועד להפוך מדידות AFM לאוטומטיות על מאות תאים מיקרוביאליים. ראשית, מיקרואורגניזמים משותקים למיקרו-מבנים של חותמות PDMS ולאחר מכן מאלצים מדידות ספקטרוסקופיה להתבצע באופן אוטומטי על מאות תאים משותקים.

אוטומציה של מדידות מיקרוסקופ כוח ביו-אטומי על מאות תאי C. אלביקנס

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

מיקרוסקופיה הקפאה-אלקטרונית של חלקיק יחיד דורשת חבילת תוכנה מתאימה וצנרת ידידותית למשתמש לרכישת נתונים אוטומטית בתפוקה גבוהה. כאן, אנו מציגים את היישום של חבילת תוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת תמונות, Latitude-S, וצינור מעשי לאיסוף נתונים של ביומולקולים משוקלים בתנאים במינון נמוך.

ידידותית למשתמש, תפוקה גבוהה ותוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

למד שימוש באלגוריתם עיבוד תמונה אוטומטי למדידת קפסולה וגוף תא ב-Cryptococcus neoformans. השיטה משפרת דיוק ומאפשרת ניתוח נפחי דגימות גדולות לחקר גורמי נגיפיות.

מדידה אוטומטיות של Cryptococcal מינים רב-סוכר כמוסה וגוף התא

גלה סרטונים נוספים