בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים
18 בדצמבר 2017
פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מחסום האפיתל חדירות בטיפול תרופתי בזמן אמת הבאים בהאדם organoids מעיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות התא מיקרוסקופ.
המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את חדירות מחסום האפיתל באורגנואידים במעי האנושי לאורך זמן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגסטרואנטרולוגיה, כגון כיצד רעלים ספציפיים, מוצרים חיידקיים או אפילו טיפולים תרופתיים יכולים לשנות את חדירות מחסום האפיתל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הן הדמיה והן מדידה כמותית של חדירות מחסום האפיתל בזמן אמת ושימוש ברקמת אפיתל במעי האנושי.
לפני הזרקת מיקרו-אורגנואידים במעי אנושי, יש להגדיר את המיקרו-מזרק, ולהכין, להתקין ולבדוק את המיקרו-נימי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי למלא את המיקרו-נימי בחומר ההזרקה, טבלו את קצה המיקרו-נימי הזכוכית במתלה ההזרקה FITC-dextran, והקפידו להימנע משבירת קצה המיקרו-נימי כנגד הצד או התחתית של הצינור. משוך לאחור את מזרק השמן המינרלי כדי לשאוב כ-10 מיקרוליטר של מתלה FITC-dextern לתוך המיקרו-נימי.
כאשר מתלה המיקרו-הזרקה ממלא 90% מאורך המיקרו-נימי הזכוכית, הפסק למלא את המיקרו-נימי. לחץ מעט על המזרק לפני הוצאת המיקרו-נימי מתמיסת המיקרו-הזרקה כדי להבטיח שקצה המיקרו-נימי אינו מכיל כיסי אוויר. הסר את צלחת תרבית האורגנואיד במעי האנושי מאינקובטור תרבית התאים והעבר לארון הבטיחות הביולוגי עם המיקרו-מזרק.
הסר את המכסה מצלחת התרבית ומרכז את הבאר הראשונה על במת המיקרוסקופ כך שהוא נראה בבירור דרך העינית של הסקופ בהגדרת ההגדלה הנמוכה ביותר. סובב את זרוע המיקרומניפולטור כך שהמיקרו-נימי יופנה כלפי מטה לתוך התרבות היטב בזווית הגדולה מ-45 מעלות ביחס לשלב המיקרוסקופ. מקם את קצה המיקרו-נימי מעל באר התרבית הראשונה בערך סנטימטר אחד מעל פני המדיה.
בדוק שגם קצה חוט הזכוכית וגם האורגנואיד במעי האנושי נראים דרך העינית. המפתח למיקרו-הזרקה מוצלחת הוא ליישר בזהירות את המיקרו-נימי עם האורגנואיד לפני ניסיון המיקרו-הזרקה. ואני תמיד ממליץ למשתמשים חדשים להתאמן עם טישו עודף לפני שהם מנסים ניסוי קריטי.
על ידי סיבוב כפתור הבקרה של ציר z בכיוון השעון, קדם את המיקרו-נימי לאט. חודרים את האורגנואיד של המעי האנושי עם הקצה המיקרו-נימי. המשטח החיצוני של האורגנואיד במעי האנושי ידכא מעט כאשר המיקרו-נימי יתחיל להפעיל לחץ, ויחזור לצורתו כאשר הקצה חודר ללומן.
אם יש קושי לראות את קצה המיקרו-נימי בתוך הלומן, התאם את הגדרות התאורה או ההגדלה של המיקרוסקופ המנתח. כאשר המיקרו-נימי ממוקם נכון עם קצה המיקרו-נימי ליד מרכז האורגנואיד של המעי האנושי, הסר את הידיים מפקדי המיקרומניפולטור. לחץ מעט על המזרק המלא בשמן מינרלי כדי לדחוף את תמיסת המיקרו-הזרקה החוצה מהמיקרו-נימי לתוך לומן האורגנואיד במעי האנושי.
האורגנואיד במעי האנושי עשוי להתרחב מעט כדי להתאים לנפח ההזרקה. כאשר המיקרו-נימי ממוקם מעל המדיה כדי למנוע נזק מקרי לאורגנואידים במעי האנושי במהלך התמרון, עבור למטרה האורגנואידית הבאה במעי האנושי. בין טיפולים או במקרה של שבירה, שנה את המיקרו-נימים.
שחרר את המהדק בקצה זרוע המיקרומניפולטור והסר את המיקרו-נימי ממחזיק המיקרו פיפטה. כדי לבדוק תרכובות המועברות לאפיתל האפיקלי, יש לתלות מחדש את התרכובת ב-PBS סטרילי המכיל שני מיליגרם למיליליטר FITC-dextn. בניסוי מייצג זה, יש להשעות מחדש את הרעלן Clostridium difficile TcdA, להוסיף 12.8 ננוגרם למיקרוליטר ב-PBS המכיל FITC-dextan לפני הזרקת המיקרו.
מיקרו הזרקת התרכובת ללומן האורגנואיד במעי האנושי כפי שהודגם בסעיף הקודם. כדי לבדוק תרכובות המועברות לתא הצדדי הבסיסי, לאחר הזרקת מיקרו של FITC-dextern, החלף את אמצעי התרבות החיצוני במדיה חדשה המכילה שני מילי-מולרי EGTA כבקרה חיובית, רכב PBS בלבד כבקרה שלילית, או תרכובת ניסיונית אחרת. התחל בהדמיה חיה מיד לאחר הזרקת מיקרו.
תמונת שדה בהיר מייצגת זו מציגה אורגנואיד מעיים אנושי שמקורו ברקמה לאחר מיקרו-הזרקה של FITC-dextern. האות הפלואורסצנטי ניכר גם ללא שימוש בערכת מסננים ספציפית. אורגנואידים במעי אנושיים שמקורם בתאי גזע הוזרקו עם ארבעה דקסטרן מצומד FITC קילודלטון תלוי ב-PBS, או PBS המכיל רעלן קלוסטרידיום דיפיצילה TcdA.
כבקרה חיובית, EGTA נוסף למצע תרבית האורגנואידים במעי האנושי בתת-קבוצה של אורגנואידים במעי אנושי שהוזרקו עם PBS ו-FITC-dextern. האורגנואידים במעי האנושי צולמו במשך 20 שעות. כפי שמודגם בתמונות אלה, אורגנואידים במעי אנושי שהוזרקו עם PBS שמרו כמעט על כל האות הפלואורסצנטי הקיים ב-T אפס.
עם זאת, אורגנואידים במעי אנושיים שהוזרקו גם הם עם TcdA, או טופלו ב-EGTA, הראו ירידה משמעותית בעוצמת הפלואורסצנט עד שמונה שעות לאחר המיקרו-הזרקה. נתוני ההדמיה כומתו עבור כל אורגנואידים במעי האנושי בכל נקודות הזמן כדי ליצור מערך נתונים ברזולוציה גבוהה המייצג את השינוי היחסי בעוצמת הפלואורסצנט לאורך זמן בכל תנאי ניסוי. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-30 דקות עד שעה, תלוי במספר תנאי הניסוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות סבלני ולקחת את הזמן בעת יישור האורגנואידים של המעי האנושי עם המיקרו-נימי לפני המיקרו-הזרקה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR, כתם מערבי וחיפוש RNA כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לתגובת האורגנואיד במעי האנושי לחומר המוזרק. פיתוח טכניקה זו אפשר לנו לבחון את ההשפעות של רעלנים חיידקיים, חומרים פרמקולוגיים, ציטוקינים ואפילו מיקרואורגניזמים חיים על תפקוד מחסום האפיתל באורגנואידים במעי אנושי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק מיקרו דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית וחומרים ניסיוניים אחרים ללומן של אורגנואיד מעי אנושי. אל תשכח שכאשר עובדים עם רעלנים חיידקיים או אורגניזמים חיים, זה יכול להיות מסוכן ביותר, ולכן תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בציוד הגנה אישי מתאים בעת ביצוע הליך זה. ולבסוף, היזהר במיוחד להימנע מפצעי דקירה מכיוון שהמיקרו-נימים חדים במיוחד.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת חדירות מחסום אפיתליאלי באורגנואידים של מעי אנושי בזמן אמת. באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים ופלואורסצנציה, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להדמות ולכמת שינויים בחדירות בעקבות טיפולים פרמקולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- גסטרואנטרולוגיה
- ביולוגיה של התא
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- שלמות מחסום האפיתל היא קריטית לבריאות המעי.
- שיבוש עלול להוביל למגוון מחלות גסטרואינטסטינליות.
- טכניקות מדידה בזמן אמת משפרות את ההבנה של שינויים בחדירות.
- אורגנואידים של מעי אנושי מספקים מודל רלוונטי לחקר התפקוד האפיתליאלי.
מטרת המחקר
- למדידת ההשפעות של רעלים וטיפולים פרמקולוגיים על חדירות מחסום אפיתליאלי.
- להדמיה של שינויים בחדירות בזמן אמת.
- לביסוס שיטה אמינה למחקרים גסטרואנטרולוגיים עתידיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרו-הזרקה של FITC-dextran אל תוך אורגנואידים של מעי אנושי.
- דימות חי למעקב אחר שינויים באות הפלואורסצנטי לאורך זמן.
- ניתוח כמותי של עוצמת הפלואורסצנציה להערכת חדירות.
- שימוש בביקורות לאישור תנאי הניסוי.
תוצאות עיקריות
- אורגנואידים של מעי אנושי שמרו על אות פלואורסצנטי כאשר טופלו ב-PBS.
- נצפתה ירידה משמעותית בפלואורסצנציה בטיפולים ב-TcdA וב-EGTA.
- הופקו נתונים כמותיים המראים שינויים יחסיים בחדירות.
- ניתן לבצע את הטכניקה ביעילות בתוך 30 דקות עד שעה.
מסקנות
- שיטה זו מספקת כלי בעל ערך לחקר תפקוד מחסום אפיתליאלי.
- דימות בזמן אמת משפר את ההבנה של דינמיקת חדירות.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול בדיקה של סוכנים פרמקולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה בזמן אמת של חדירות מחסום אפיתליאלי באורגנואידים של מעי אנושי מאפשרת הערכה כמותית ברזולוציה גבוהה של תפקוד המחסום במערכת תלת-ממדית הרלוונטית לבני אדם. יכולת זו היא קריטית להפחתת סיכונים בהשערות גילוי מוקדמות סביב ויסות מחסום המעי, ולהערכת ההשפעה של סוכנים פרמקולוגיים, רעלנים או תוצרי מיקרובים על השלמות האפיתליאלית. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בנקודת המפגש בין תיקוף מטרות לבחירת מודלים פרה-קליניים עבור פורטפוליו של גילוי תרופות למערכת העיכול.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של תפקוד מחסום האפיטל במודל אנושי רלוונטי פיזיולוגית.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית באמצעות כימות פגיעה במחסום בתגובה לחומרים מועמדים או רעלים.
- מקל על תיקוף תפקודי של נתיבים המעורבים בשמירה על שלמות המחסום ובמחלות.
- מספק נתונים כמותיים לבסיס קבלת החלטות של go/no-go בתוכניות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקיים בדיקה כמותית וניתנת לשחזור של חדירות מחסום באמצעות דימיון חי (live imaging) וסמנים פלואורסצנטיים.
- מאפשר השוואה סטנדרטית של השפעות תרכובות במגוון תנאים ניסיוניים.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובהתאמתה לסריקת מודולטורים פרמקולוגיים או מיקרוביאליים של תפקוד המחסום.
- מאפשר הערכה רחבה של שינויים שלם-תאיים בשלמות האפיתליאלית המושרים על ידי תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים של רקמות אנושיות הרלוונטיים למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשרות לביצוע ניתוחים מולקולריים המשכיים לאחר הזרקה מיקרוסקופית.
- מפחית את הסיכון התרגומי באמצעות מידול של תגובות ספציפיות לבני אדם להתערבויות מועמדות.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של תרכובות המכוונות למסלולי מחסום אפיתליאלי.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף מהגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אפשור הערכה תפקודית של שלמות המחסום באורגנואידים אנושיים, ובכך היא תומכת הן בתהליכי תיקוף של מטרות והן בתהליכי הערכת מובילים.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת שינויים בזמן אמת בחדירות המחסום כדי להבהיר מעורבות של מסלולים ומכניזמים ביולוגיים.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור, המתאימים להשוואת תרכובות ולסטנדרטיזציה של בדיקות.
- אנליטיקה: מספקת נתונים זמניים ברזולוציה גבוהה על שימור או איבוד של סמן פלואורסצנטי, התומכים בניתוח סטטיסטי של שינויים בחדירות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro למודלים פרה-קליניים על ידי שימוש באורגנואידים ממקור אנושי ומאפשר פרופיל מולקולרי בהמשך.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה גמישה הניתנת להתאמה לשאלות ניסיוניות ולסוגי תרכובות מגוונים במחקר של מערכת העיכול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתוכניות המכוונות למחסומים ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הערכת חדירות באמצעות תהליכי עבודה ניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות מוקדמות של המשך או עצירה (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי תיעדוף מטרות מאושרות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום נכסים בעלי פעילות מוכחת של ויסות מחסומים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרו-הזרקה ובדימות של תאי חיים בתרביות אורגנואידים תלת-ממדיות.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית הפוכה ולציוד מיקרו-מניפולציה מדויק.
- נדרש סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ההזרקה והדימות בין צוותים שונים לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאים את הפרוטוקול, בשינויים קלים, הן לאורגנואידים של מעי אנושי המופקים מרקמות והן לאלו המופקים מתאי גזע.
- טיפול זהיר ואמצעי בטיחות ביולוגית חיוניים בעבודה עם רעלנים או מיקרואורגניזמים חיים.
