בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את חדירות מחסום האפיתל באורגנואידים במעי האנושי לאורך זמן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגסטרואנטרולוגיה, כגון כיצד רעלים ספציפיים, מוצרים חיידקיים או אפילו טיפולים תרופתיים יכולים לשנות את חדירות מחסום האפיתל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הן הדמיה והן מדידה כמותית של חדירות מחסום האפיתל בזמן אמת ושימוש ברקמת אפיתל במעי האנושי.

לפני הזרקת מיקרו-אורגנואידים במעי אנושי, יש להגדיר את המיקרו-מזרק, ולהכין, להתקין ולבדוק את המיקרו-נימי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי למלא את המיקרו-נימי בחומר ההזרקה, טבלו את קצה המיקרו-נימי הזכוכית במתלה ההזרקה FITC-dextran, והקפידו להימנע משבירת קצה המיקרו-נימי כנגד הצד או התחתית של הצינור. משוך לאחור את מזרק השמן המינרלי כדי לשאוב כ-10 מיקרוליטר של מתלה FITC-dextern לתוך המיקרו-נימי.

כאשר מתלה המיקרו-הזרקה ממלא 90% מאורך המיקרו-נימי הזכוכית, הפסק למלא את המיקרו-נימי. לחץ מעט על המזרק לפני הוצאת המיקרו-נימי מתמיסת המיקרו-הזרקה כדי להבטיח שקצה המיקרו-נימי אינו מכיל כיסי אוויר. הסר את צלחת תרבית האורגנואיד במעי האנושי מאינקובטור תרבית התאים והעבר לארון הבטיחות הביולוגי עם המיקרו-מזרק.

הסר את המכסה מצלחת התרבית ומרכז את הבאר הראשונה על במת המיקרוסקופ כך שהוא נראה בבירור דרך העינית של הסקופ בהגדרת ההגדלה הנמוכה ביותר. סובב את זרוע המיקרומניפולטור כך שהמיקרו-נימי יופנה כלפי מטה לתוך התרבות היטב בזווית הגדולה מ-45 מעלות ביחס לשלב המיקרוסקופ. מקם את קצה המיקרו-נימי מעל באר התרבית הראשונה בערך סנטימטר אחד מעל פני המדיה.

בדוק שגם קצה חוט הזכוכית וגם האורגנואיד במעי האנושי נראים דרך העינית. המפתח למיקרו-הזרקה מוצלחת הוא ליישר בזהירות את המיקרו-נימי עם האורגנואיד לפני ניסיון המיקרו-הזרקה. ואני תמיד ממליץ למשתמשים חדשים להתאמן עם טישו עודף לפני שהם מנסים ניסוי קריטי.

על ידי סיבוב כפתור הבקרה של ציר z בכיוון השעון, קדם את המיקרו-נימי לאט. חודרים את האורגנואיד של המעי האנושי עם הקצה המיקרו-נימי. המשטח החיצוני של האורגנואיד במעי האנושי ידכא מעט כאשר המיקרו-נימי יתחיל להפעיל לחץ, ויחזור לצורתו כאשר הקצה חודר ללומן.

אם יש קושי לראות את קצה המיקרו-נימי בתוך הלומן, התאם את הגדרות התאורה או ההגדלה של המיקרוסקופ המנתח. כאשר המיקרו-נימי ממוקם נכון עם קצה המיקרו-נימי ליד מרכז האורגנואיד של המעי האנושי, הסר את הידיים מפקדי המיקרומניפולטור. לחץ מעט על המזרק המלא בשמן מינרלי כדי לדחוף את תמיסת המיקרו-הזרקה החוצה מהמיקרו-נימי לתוך לומן האורגנואיד במעי האנושי.

האורגנואיד במעי האנושי עשוי להתרחב מעט כדי להתאים לנפח ההזרקה. כאשר המיקרו-נימי ממוקם מעל המדיה כדי למנוע נזק מקרי לאורגנואידים במעי האנושי במהלך התמרון, עבור למטרה האורגנואידית הבאה במעי האנושי. בין טיפולים או במקרה של שבירה, שנה את המיקרו-נימים.

שחרר את המהדק בקצה זרוע המיקרומניפולטור והסר את המיקרו-נימי ממחזיק המיקרו פיפטה. כדי לבדוק תרכובות המועברות לאפיתל האפיקלי, יש לתלות מחדש את התרכובת ב-PBS סטרילי המכיל שני מיליגרם למיליליטר FITC-dextn. בניסוי מייצג זה, יש להשעות מחדש את הרעלן Clostridium difficile TcdA, להוסיף 12.8 ננוגרם למיקרוליטר ב-PBS המכיל FITC-dextan לפני הזרקת המיקרו.

מיקרו הזרקת התרכובת ללומן האורגנואיד במעי האנושי כפי שהודגם בסעיף הקודם. כדי לבדוק תרכובות המועברות לתא הצדדי הבסיסי, לאחר הזרקת מיקרו של FITC-dextern, החלף את אמצעי התרבות החיצוני במדיה חדשה המכילה שני מילי-מולרי EGTA כבקרה חיובית, רכב PBS בלבד כבקרה שלילית, או תרכובת ניסיונית אחרת. התחל בהדמיה חיה מיד לאחר הזרקת מיקרו.

תמונת שדה בהיר מייצגת זו מציגה אורגנואיד מעיים אנושי שמקורו ברקמה לאחר מיקרו-הזרקה של FITC-dextern. האות הפלואורסצנטי ניכר גם ללא שימוש בערכת מסננים ספציפית. אורגנואידים במעי אנושיים שמקורם בתאי גזע הוזרקו עם ארבעה דקסטרן מצומד FITC קילודלטון תלוי ב-PBS, או PBS המכיל רעלן קלוסטרידיום דיפיצילה TcdA.

כבקרה חיובית, EGTA נוסף למצע תרבית האורגנואידים במעי האנושי בתת-קבוצה של אורגנואידים במעי אנושי שהוזרקו עם PBS ו-FITC-dextern. האורגנואידים במעי האנושי צולמו במשך 20 שעות. כפי שמודגם בתמונות אלה, אורגנואידים במעי אנושי שהוזרקו עם PBS שמרו כמעט על כל האות הפלואורסצנטי הקיים ב-T אפס.

עם זאת, אורגנואידים במעי אנושיים שהוזרקו גם הם עם TcdA, או טופלו ב-EGTA, הראו ירידה משמעותית בעוצמת הפלואורסצנט עד שמונה שעות לאחר המיקרו-הזרקה. נתוני ההדמיה כומתו עבור כל אורגנואידים במעי האנושי בכל נקודות הזמן כדי ליצור מערך נתונים ברזולוציה גבוהה המייצג את השינוי היחסי בעוצמת הפלואורסצנט לאורך זמן בכל תנאי ניסוי. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-30 דקות עד שעה, תלוי במספר תנאי הניסוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות סבלני ולקחת את הזמן בעת יישור האורגנואידים של המעי האנושי עם המיקרו-נימי לפני המיקרו-הזרקה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR, כתם מערבי וחיפוש RNA כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לתגובת האורגנואיד במעי האנושי לחומר המוזרק. פיתוח טכניקה זו אפשר לנו לבחון את ההשפעות של רעלנים חיידקיים, חומרים פרמקולוגיים, ציטוקינים ואפילו מיקרואורגניזמים חיים על תפקוד מחסום האפיתל באורגנואידים במעי אנושי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק מיקרו דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית וחומרים ניסיוניים אחרים ללומן של אורגנואיד מעי אנושי. אל תשכח שכאשר עובדים עם רעלנים חיידקיים או אורגניזמים חיים, זה יכול להיות מסוכן ביותר, ולכן תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בציוד הגנה אישי מתאים בעת ביצוע הליך זה. ולבסוף, היזהר במיוחד להימנע מפצעי דקירה מכיוון שהמיקרו-נימים חדים במיוחד.