Name: בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: למד מדידת חדירות מחסום האפיתל בזמן אמת באורגנואידים מעיים אנושיים באמצעות מיקרו-הזרקת FITC-dextran ומיקרוסקופיה חיה. שיטה זו מאפשרת הדמיה וכימות שינויים בחדירות בתגובה לטיפולים פרמקולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצה להודות ד"ר סטפני Spohn, באזל Abuaita לדיונים שימושיים רבים על microinjection תא צורב. JRS נתמך על ידי ה מעיים תאי גזע Consortium (U01DK103141), פרויקט מחקר שיתופי שמומנו על ידי המכון הלאומי של הסוכרת העיכול, מחלות כליה (NIDDK), המכון הלאומי לאלרגיה ואת ומחלות זיהומיות (NIAID). JRS VBY נתמכים על ידי הרומן NIAID, מערכות מודל אלטרנטיבי קונסורציום המעית מחלות (NAMSED) (U19AI116482). DRH נתמכת מנגנוני פתוגנזה מיקרוביאלי הכשרה המענק של המכון הלאומי של אלרגיה ומחלה זיהומית (NIAID, T32AI007528) את פרס קלינית ומדעי Translational למכון מישיגן קלינית ובריאות מחקר (UL1TR000433).
קבצי נתונים וקוד ניתוח נתונים המשמשים כתב יד זה הינם זמינים https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

<ol><li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStandring%2C+S+%22Gray%27s+anatomy%3A+The+anatomical+basis+of+clinical+practice%22">Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice</a>. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+defense%3A+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189(2014).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+A+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li>
<li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li>
<li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability+measurements%3A+General+aspects+and+possible+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Hosp%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
<li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line%3A+T84+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li>
<li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability%3A+A+critique%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li>
<li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li>
<li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Ussing%27s+chambers%3A+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li>
<li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li>
<li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li>
<li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+a+lung%3A+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li>
<li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li>
<li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li>
<li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole+new+ball+game%3A+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2FColonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li>
<li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+organoids%3A+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li>
<li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li>
<li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+clostridium+difficile+infection%3A+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li>
<li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=Dhn2KispfdQC">Theory and practice of histological techniques</a>. , Churchill Livingstone. (2008).</li>
<li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKennedy%2C+S+%22PCR+troubleshooting+and+optimization%3A+The+essential+guide%22">PCR troubleshooting and optimization: The essential guide</a>. , Caister Academic Press. (2011).</li>
<li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKurien%2C+B+%22Western+blotting%3A+Methods+and+protocols%22">Western blotting: Methods and protocols</a>. , Springer. New York. (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+image+to+imageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+W+%22Microsoft+excel+data+analysis+and+business+modeling%22">Microsoft excel data analysis and business modeling</a>. , Pearson Education. (2016).</li>
<li>R Core Team. A language and environment for statistical computing. <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">R Foundation for Statistical Computing</a>. , (2017).</li>
<li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosenbaum%2C+S+%22Basic+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics%3A+An+integrated+textbook+and+computer+simulations%22">Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations</a>. , Wiley. (2016).</li>
<li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li>
<li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+assessment+of+intestinal+permeability%2C+size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Ther+Health+Med%22%5BJournal%5D)">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li>
<li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966(2017).</li>
</ol>

המחברים יש אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים לחשוף.

פרוטוקול זה יוצר שיטה כללית של microinjection של HIOs hPSC, נגזר, רקמות, נגזר organoids מעיים, המדד של מחסום האפיתל חדירות בזמן אמת. הראו גם גישת ניתוח ופרשנות של נתונים שנוצר באמצעות שיטות אלה. בהתחשב אימוץ הגוברת של organoids מעיים דגם מערכות16,20,21,28 , האינטרס מכשול מעיים חדירות כרלוונטיים פיזיולוגית פונקציונלי ארוכת שנים תוצאה3,4,5,6, אנו צופים כי אחרים העובדים בתחום זה יוכלו להחיל ולבנות על שיטות אלה.
ישנם מספר שלבים אשר הם קריטיים ליישום של טכניקה זו. גישה hPSC באיכות גבוהה - או רקמות רקמות HIO נגזר גלובאלים לפני ניסויים נרחבים עם microinjection. HIO למפלגות עשויים להיות heterogenous, עם וריאציה הן בגודל וצורה, למרות רקמות זהות ועל מורפולוגיה הסלולר הוא מאוד לשחזור כאשר ניצול הוקמה מתודולוגיה ליצירת HIOs24. כדורי HIOs המורכב לומן שקופה למחצה יחיד ומדידת כ- 1 מ מ קוטר הינם אידיאליים עבור microinjection ומדידה של זריחה luminal בזמן אמת. במקרים מסוימים, microinjection ייכשל, וכתוצאה מכך התמוטטות HIO או ברור דליפה של חומר מוזרק. ניתן להסיר HIOs שנכשל מתרבות גם שיקול של המשתמש באמצעות micropipette סטנדרטי. שקול את העדשות המטרה זמין על פלטפורמת הדמיה בעת בחירת HIOs עבור microinjection ודימות. באופן כללי, 2-4 X המטרה עדשות הינם אידיאליים עבור לכידת את האות מלאה HIO פלורסנט, למרות מטרה X 10 עשוי לשמש אם עדשות צריכת חשמל נמוכה אינם זמינים או אם HIOs זמין &#60; 1 מ מ קוטר. תוכנות ליצירת תמונות לאפשר עבור לכידת תמונות פלורסנט בנקודות מוגדרות אוטומטית לאורך זמן.
מספר שינויים של פרוטוקול זה אפשריות על מנת להתאים את הדרישות ניסיוני. לדוגמה, התוצאות של בדיקות תפקוד המחסום עשוי להיות תלוי בגודל מולקולרי של תרכובות של שימוש43 , אפשר יהיה לבחון את ההכנות לתוספי של משקל מולקולרי בדרגות שונות. בנוסף, ניתן לבצע הדמיה brightfield בנוסף זריחה הדמיה כמחוון של שלמות המבנה הכולל של רקמות25. בעת ביצוע microinjection של חיידקים לחיות25,28,31,32,33,44, זה ייתכן שיהיה צורך להוסיף פניצילין, סטרפטומיצין או גנטמיצין HIO תרבות לתקשורת לפני או לאחר microinjection. החלק החיצוני של microcapillary תזדהם במהלך מילוי עם המתלה התרבות חיידקי, זה עשוי להיות מועבר בתקשורת HIO. לחלופין, ניתן לבצע microinjection HIOs מושעה בתוך מטריצה חוץ-תאית (למשל, Matrigel) ללא מדיה, הוספת המדיה לאחר השלמת את microinjection. זה עלול להגביל את זיהום מטריצה חוץ-תאית, הפנים החיצוניים של HIO. בעת תכנון מבחני צמיחת חיידקים, ייתכן צורך להסיר אנטיביוטיקה בתקשורת לאחר 1-2 h כדי למנוע האטה או מניעת התפתחותם של אורגניזמים microinjected.
לבסוף, מתוך הכרה כי לא כל החוקרים תהיה גישה מיקרוסקופ ציוד מתאים במבחנה הדמיה, זה חשוב לציין כי ניתן להחיל את ההליכים המתוארים פרוטוקול זה לאיסוף נתוני קרינה פלואורסצנטית מתמונות שצולמו ב timepoints קבוע באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי רגיל ללא לכידת התמונה האוטומטי או פקדים איכות הסביבה. דוגמאות של גישה זו ניתן למצוא בדו ' ' חות מאת לסלי ווונג. et al. 25, שבדקו difficile ג פעילות הרעלן organoids מעיים נגזר hPSC,. Karve, Pradan et al. 44, שבדקו מחסום האפיתל חדירות ב דומה נגזר hPSC המעי organoids microinjected עם חיה e. coli. פעולה ידנית של ציוד הדימות עלול לגרום גדול וריאציה ולקשיי נרמול האות פלורסנט. כאשר ביצוע הדמיה ידנית של FITC-לתוספי מזריקים HIOs זה חיוני כדי לשמור על הגדלה קבועה, עירור פלורסנט בעוצמה ושעות חשיפה לאורך כל הניסוי כדי להימנע מעיוות המדידות פלורסנט בעוצמה.

האפיתל במעי יוצרת מחסום סלקטיבי המעביר התעבורה כיוונית של חומרים מזינים,2O H, יונים, ו הפסולת תוך מזעור ספציפי exchange בתיווך דיפוזיה של חלקיקים אחרים בין לומן ו mesenchymal רקמות או דם אספקה1,2. החדירות לא ספציפית של המכשול אפיתל המעי מזמן נחשב פרמטר פונקציונלי מפתח מחלה ובריאות3,4,5,6, המשקפת שיעור פעפוע של מולקולות קטנות על פני האפיתל דרך החלל paracellular. מדידה של חדירות מחסום האפיתל יכול להתבצע בחיה מודלים7 , בני אדם חולים8 באמצעות הבליעה של לקטולוז, אשר יש אין טרנספורטר ספציפי של מערכת העיכול, ואת האוסף עוקבות מדידת ריכוזים לקטולוז בדם ההיקפי. סמנים בלע חלופי של פונקציית מכשול כגון פחמימות fluorescently שכותרתו הינם גם זמינים9,10. גישה זו היה מותאם תרביות תאים אפיתל המעי גדל תומך Transwell11, בגישה פשוטה מאפשר בקרה ניסויית גדול יותר, אך גם ביקורת כמו מנבא המסכן של vivo חדירות בשל היעדר תת אפיתל הבדיל ו- מבנה רקמות12. באמצעות לשכות מייצג גישה אחרת ובכל זאת ולאפשר לשקילת מחסום האפיתל פונקציה mucosa מעיים כל לשעבר vivo13. היישום של טכניקה זו לעתים קרובות מוגבל על ידי רקמת זמינות ותנאי13,14. לכן שיטות חדשות אשר לאזן הפארמצבטית ותפוקת עם רלוונטיות הפיזיולוגיות נחוצים.
התפתחויות במבחנה organogenesis הובילו האימוץ של תרביות רקמה 3D דגם מערכות כפלטפורמה מתוחכמים recapitulating את הדינמיקה של רקמות מורכבות15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. בפרט, אנושי pluripotent תאי גזע (hPSC) נגזר organoids מעיים אנושיים (HIOs)19,24 הופיעו כמערכת מודל השפעול צייתן הדירים לצורך המחקר של אינטראקציות מיקרוביאליים המארח ו מחסום האפיתל dynamics25,26,27,28. באופן דומה, organoids נגזר רקמה אנושית (הידוע גם בשם enteroids) הנגזרות הליך הביופסיה פשוטה והוא יכול לשמש כמערכת צייתן ללמוד פיזיולוגיה אנושית ו מחלת15,29,30. Microinjection של organoids מעיים אנושיים מאפשרת למסירה של תרכובות ניסיוני25 או לחיות חיידקים25,31,32,33 הפסגה אפיתל פני השטח של לומן תא צורב. . לסלי ווונג et al. 25 הותאם לאחרונה בטכניקה זו כדי למדוד את מחסום חדירות ב- HIOs microinjected עם fluorescein isothiocyanate (FITC) עם התווית לתוספי בעקבות חשיפה ל: רעלנים חיידקי.
פרוטוקול זה מיועד כמדריך לשקילת מחסום האפיתל חדירות נגזר hPSC HIOs, HIOs, נגזר רקמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם שינויים מזעריים, זה יכול לשמש גם פריימר כללי על microinjection של HIOs עם תרכובות ניסיוני. משתמשים ייתכן שנשלים פרוטוקול זה עם יישומי הזרם נוספים או חלופית לאחר microinjection.

<table><tbody><tr><td>EGTA 0.5 M סטרילי (pH 8.0)</td><td>Bioworld</td><td>405200081</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מטריצת תאים (Matrigel)</td><td>קורנינג</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision RT מערכת הדמיית תאים חיים</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td></tr> <tr><td>מצלמה</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>כלול במערכת Deltavision</td></tr><tr><td>תוכנת הדמיה softWoRx</td> GE <td>Life Sciences</td><td>29065728</td><td>כלול במערכת Deltavision</td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית</td><td>Labconco</td><td>Cell Logic+</td><td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>12634-010</td><td>רכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>B27 supplement (50X)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>רכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>L-glutamine (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>רכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24מאגר </td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td>רכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>מניפולטור</td><td>Narshge</td><td>UM-3C</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narshge</td><td>UM-1PF</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק פיפטה</td><td>Narshge</td><td>UP-1</td><td>חלופי למחזיק פיפטה Xenoworks</td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>היקף ניתוח Narshge</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SX61</td><td>היקף מומלץ, אם כי סביר להניח שדגמים אחרים תואמים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי Olympus IX71 Olympus</td><td></td><td>IX71</td><td>כלול במערכת Deltavision</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Photometrics</td><td>29065728</td><td>כלול במערכת Deltavision</td></tr><tr><td>רקומביננטית C. difficile רעלן A/TcdA חלבון</td><td>R& D Systems</td><td>8619-GT-020</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td>רכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>4645-RS</td><td>רכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems</td><td>6057-NG</td><td>רכיב של מדיית ENR; ראה McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dextran (4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטות</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526PK</td><td></td></tr><tr><td>חוטי זכוכית</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מיקרופיפטה</td><td>Xenoworks</td><td>BR-MH2</td><td>מכשיר מועדף</td></tr><tr><td>ערכת צינורות אנלוגית</td><td>Xenoworks</td><td>BR-AT</td><td></td></tr><tr><td>1/16 בטבעת שקופה</td><td>Xenoworks</td><td>V001104</td><td></td></tr><tr><td>1-1.2 מ"מ טבעת</td><td>O Xenoworks</td><td>V300450</td><td></td></tr></tbody></table>

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב organoids מעיים אנושיים

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

ההתקדמות בתרבות תלת-ממד של רקמות מעיים מושגת באמצעות ביופסיה או שנוצר מתאי גזע pluripotent באמצעות בידול מכוונת, גרמו מודלים מתוחכמים במבחנה של רירית המעי. מינוף מערכות אלה-דגם המתעוררים ידרוש עיבוד של כלים וטכניקות שפותחו עבור מערכות התרבות 2D של בעלי חיים. כאן, אנו מתארים שיטה למדידת מחסום האפיתל חדירות ב organoids מעיים אנושיים בזמן אמת. זו מושגת על-ידי microinjection של fluorescently-ידי לתוספי, הדמיה-מיקרוסקופ הפוכה מצויד מסננים פלורסנטי. מדידת בזמן אמת החדירות מכשול ב organoids מעיים מקלה על הדור של נתונים זמני ברזולוציה גבוהה ברקמת האפיתל במעי האדם, למרות טכניקה זו ניתן גם ליישם קבוע timepoint הדמיה גישות. פרוטוקול זה ניתנת להתאמה בקלות לשקילת חדירות מחסום האפיתל בעקבות חשיפה סוכנים תרופתי, מוצרים חיידקי או רעלנים או אורגניזמים חיים. עם שינויים מזעריים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם פריימר כללי על microinjection של organoids מעיים, משתמשים עשויים לבחור תוספת פרוטוקול זה עם יישומי הזרם נוספים או חלופיים בעקבות microinjection.

HIOs היו הבדיל מתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית בפתרון מטריקס תא כמו בעבר תיאר19,24. לאחר 4 שבועות בתרבות, HIOs היה להרחיב במידה מספקת כדי לאפשר microinjection. HIOs היו microinjected עם 4 kDa FITC מצומדת לתוספי מושעה PBS או PBS המכיל Clostridium difficile רעלן TcdA. ג difficile הוא פתוגן במערכת העיכול הזדמנותית זה מוצגים בתיווך הרעלן רעילות אפיתל HIOs25. כפקד חיובית, EGTA נוספה HIO תרבות המדיה של תת-קבוצה של HIOs מוזרק עם PBS ו FITC-לתוספי. EGTA הוא chelator סידן הגורמת מהירה והתבקשתי פלמור של שלד התא אקטין42. זריחה FITC היה פיקוח בזמן אמת על מיקרוסקופ הדמיה חיה בתוך תא הסביבה מבוקרת, תמונות נלקחו בשבי במרווחים של-10 דקות.
פוסט-הוק ניתוח של נתונים הדמיה גילה הבדלים ניכרים השמירה של זריחה FITC (איור 5). HIOs מוזרק עם PBS נשמר כמעט את כל האות פלורסנט נוכח t = 0, אולם HIOs זה גם הוזרקו TcdA של מטופלים עם EGTA הציג ירידה משמעותית בעוצמת פלורסנט לפי 8 שעות פוסט-microinjection (איור 5A)-נתוני הדמיה היו לכמת עבור כל HIOs בנקודות זמן כל לייצר dataset ברזולוציה גבוהה המייצג את השינוי היחסי בעוצמתם פלורסנט לאורך זמן במצב כל ניסיוני (איור 5B). הבדלים חדירות אפיתל הוערכו על ידי חישוב חיסול אכזרי הזמן (t1/2 ) של FITC עבור כל קבוצת הטיפול (טבלה 1) השוואת הבדלים t t1/2 בין קבוצות באמצעות הסטודנט t-מבחן. HIOs שטופלו שליטה נשמרים רוב FITC אות ניאון יותר מ 16 שעות (t1/2 = ± 17 0.3 h). טיפול עם EGTA הקטינה באופן משמעותי זמן ביעור FITC-לתוספי יחסי שליטה HIOs (t1/2 = 2.6 ± 0.2 שעות; P = 1.3 x 10-8). בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו בעבר25, microinjection של TcdA גדל באופן משמעותי מחסום האפיתל חדירות יחסי שליטה טיפול (t1/2 = ± 7.6 0.6 h; P = 5.4 x 10-4). לפיכך, חיצוני (EGTA) והן microinjected (TcdA) תרכובות המסוגלים גרימת שינויים משמעותיים במחסום האפיתל חדירות ב- HIOs. תוצאות אלו מראים כי ההשפעות של מגוון רחב של סוכנים תרופתי מטבוליטים, מוצרים חיידקי, ציטוקינים, גורמי גדילה, תרכובות אחרות על מחסום האפיתל פונקציה עשויים להעריך באמצעות גישה זו.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>טיפול</td>
			<td>Half-life (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>להוריד את 95% CI (h)</td>
			<td>העליון 95% CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>שליטה</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0.3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17.78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2.58</td>
			<td>0.19</td>
			<td>1.78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0.63</td>
			<td>השקיעו 5.93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: זאת אומרת זמן ביעור (t1/2) עבור FITC-לתוספי ב HIOs שטופלו EGTA או TcdA. יחידות הינן microinjection שלאחר שעות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
איור 1: שהעיצוב הבסיסי של microinjector ו- micromanipulator עבור HIO microinjection. תמונה זו מציגה את המשלים מלאה של ציוד המשמש לביצוע microinjection של HIOs. רכיבי מפתח מסומנות, פרטי הזמנה ניתן למצוא בטבלת חומרים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
איור 2: פולר Micropipette. הנחושת חימום סליל hc, מהדק העליון c1, קלאמפ התחתון (c2), זרוע פולר (הרשות), חום הנבחר דו-מצבי (ht) מזוהים באמצעות החצים. ההגדרה הנכונה של חום 1 ולמשוך מסומנים בטקסט אדום. שיבוץ מראה של פילמנט זכוכית נטענים כהלכה מוכן לחימום. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
איור 3: להחליפן בתמונות של רקמות-derived HIO הזריק FITC-לתוספי. תמונה (A) הממחיש את מיקום microcapillary זכוכית בדיוק לפני הכניסה לתוך HIO ו microinjection. (B) Brightfield דימוי רקמות-derived האנושי מעיים organoids לאחר microinjection של FITC-לתוספי. שימו לב כי האות זריחה נראית לעין אפילו ללא השימוש של ערכת מסנן ספציפי. הגיוון הזה מסייע דיוק microinjection. 3 X הגדלה <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
איור 4: חיים זרימת הדמיה- (א) מסך הממחישות את השלבים הנחוצים להפיכת קבע את הפרמטרים מיקרוסקופ, למצוא את HIOs על השקופית ולשמור את המיקום של הבמה עבור כל HIO לדימות. (B) הדמיה מראש הגדרות עבור לכידת בערוץ FITC במרווחי זמן קבועים בכל התנוחות שצוינו א (ג) הדמיה לאחר ייצוא של נתונים בפורמט DV קבצים כתמונות TIFF עם תמונה TIFF אחת לכל HIO לכל נקודת זמן.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
איור 5: תוצאות נציג. תאי גזע (A) נגזר organoids האנושי מעיים (HIO) microinjected עם 2 מ"ג/מ"ל FITC-לתוספי עם תמונה (4 kDa) במשך 20 שעות. HIOs היו microinjected גם עם PBS (בקרה) או Clostridium difficile הרעלן TcdA (12.8 ng/µL) או מטופלים עם 2 מ מ EGTA הוסיף למדיה תרבות חיצוניים. 4 X הגדלה. (B) מגרש בעוצמה אומר מנורמל FITC לאורך זמן, HIOs שטופלו PBS (בקרה), TcdA או EGTA. קווי שגיאה מייצגים S.E.M. ו- n = 11 HIOs (בקרה), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מחסום האפיתל חדירות בטיפול תרופתי בזמן אמת הבאים בהאדם organoids מעיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות התא מיקרוסקופ.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את חדירות מחסום האפיתל באורגנואידים במעי האנושי לאורך זמן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגסטרואנטרולוגיה, כגון כיצד רעלים ספציפיים, מוצרים חיידקיים או אפילו טיפולים תרופתיים יכולים לשנות את חדירות מחסום האפיתל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הן הדמיה והן מדידה כמותית של חדירות מחסום האפיתל בזמן אמת ושימוש ברקמת אפיתל במעי האנושי.לפני הזרקת מיקרו-אורגנואידים במעי אנושי, יש להגדיר את המיקרו-מזרק, ולהכין, להתקין ולבדוק את המיקרו-נימי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי למלא את המיקרו-נימי בחומר ההזרקה, טבלו את קצה המיקרו-נימי הזכוכית במתלה ההזרקה FITC-dextran, והקפידו להימנע משבירת קצה המיקרו-נימי כנגד הצד או התחתית של הצינור. משוך לאחור את מזרק השמן המינרלי כדי לשאוב כ-10 מיקרוליטר של מתלה FITC-dextern לתוך המיקרו-נימי.כאשר מתלה המיקרו-הזרקה ממלא 90% מאורך המיקרו-נימי הזכוכית, הפסק למלא את המיקרו-נימי. לחץ מעט על המזרק לפני הוצאת המיקרו-נימי מתמיסת המיקרו-הזרקה כדי להבטיח שקצה המיקרו-נימי אינו מכיל כיסי אוויר. הסר את צלחת תרבית האורגנואיד במעי האנושי מאינקובטור תרבית התאים והעבר לארון הבטיחות הביולוגי עם המיקרו-מזרק.הסר את המכסה מצלחת התרבית ומרכז את הבאר הראשונה על במת המיקרוסקופ כך שהוא נראה בבירור דרך העינית של הסקופ בהגדרת ההגדלה הנמוכה ביותר. סובב את זרוע המיקרומניפולטור כך שהמיקרו-נימי יופנה כלפי מטה לתוך התרבות היטב בזווית הגדולה מ-45 מעלות ביחס לשלב המיקרוסקופ. מקם את קצה המיקרו-נימי מעל באר התרבית הראשונה בערך סנטימטר אחד מעל פני המדיה.בדוק שגם קצה חוט הזכוכית וגם האורגנואיד במעי האנושי נראים דרך העינית. המפתח למיקרו-הזרקה מוצלחת הוא ליישר בזהירות את המיקרו-נימי עם האורגנואיד לפני ניסיון המיקרו-הזרקה. ואני תמיד ממליץ למשתמשים חדשים להתאמן עם טישו עודף לפני שהם מנסים ניסוי קריטי.על ידי סיבוב כפתור הבקרה של ציר z בכיוון השעון, קדם את המיקרו-נימי לאט. חודרים את האורגנואיד של המעי האנושי עם הקצה המיקרו-נימי. המשטח החיצוני של האורגנואיד במעי האנושי ידכא מעט כאשר המיקרו-נימי יתחיל להפעיל לחץ, ויחזור לצורתו כאשר הקצה חודר ללומן.אם יש קושי לראות את קצה המיקרו-נימי בתוך הלומן, התאם את הגדרות התאורה או ההגדלה של המיקרוסקופ המנתח. כאשר המיקרו-נימי ממוקם נכון עם קצה המיקרו-נימי ליד מרכז האורגנואיד של המעי האנושי, הסר את הידיים מפקדי המיקרומניפולטור. לחץ מעט על המזרק המלא בשמן מינרלי כדי לדחוף את תמיסת המיקרו-הזרקה החוצה מהמיקרו-נימי לתוך לומן האורגנואיד במעי האנושי.האורגנואיד במעי האנושי עשוי להתרחב מעט כדי להתאים לנפח ההזרקה. כאשר המיקרו-נימי ממוקם מעל המדיה כדי למנוע נזק מקרי לאורגנואידים במעי האנושי במהלך התמרון, עבור למטרה האורגנואידית הבאה במעי האנושי. בין טיפולים או במקרה של שבירה, שנה את המיקרו-נימים.שחרר את המהדק בקצה זרוע המיקרומניפולטור והסר את המיקרו-נימי ממחזיק המיקרו פיפטה. כדי לבדוק תרכובות המועברות לאפיתל האפיקלי, יש לתלות מחדש את התרכובת ב-PBS סטרילי המכיל שני מיליגרם למיליליטר FITC-dextn. בניסוי מייצג זה, יש להשעות מחדש את הרעלן Clostridium difficile TcdA, להוסיף 12.8 ננוגרם למיקרוליטר ב-PBS המכיל FITC-dextan לפני הזרקת המיקרו.מיקרו הזרקת התרכובת ללומן האורגנואיד במעי האנושי כפי שהודגם בסעיף הקודם. כדי לבדוק תרכובות המועברות לתא הצדדי הבסיסי, לאחר הזרקת מיקרו של FITC-dextern, החלף את אמצעי התרבות החיצוני במדיה חדשה המכילה שני מילי-מולרי EGTA כבקרה חיובית, רכב PBS בלבד כבקרה שלילית, או תרכובת ניסיונית אחרת. התחל בהדמיה חיה מיד לאחר הזרקת מיקרו.תמונת שדה בהיר מייצגת זו מציגה אורגנואיד מעיים אנושי שמקורו ברקמה לאחר מיקרו-הזרקה של FITC-dextern. האות הפלואורסצנטי ניכר גם ללא שימוש בערכת מסננים ספציפית. אורגנואידים במעי אנושיים שמקורם בתאי גזע הוזרקו עם ארבעה דקסטרן מצומד FITC קילודלטון תלוי ב-PBS, או PBS המכיל רעלן קלוסטרידיום דיפיצילה TcdA.כבקרה חיובית, EGTA נוסף למצע תרבית האורגנואידים במעי האנושי בתת-קבוצה של אורגנואידים במעי אנושי שהוזרקו עם PBS ו-FITC-dextern. האורגנואידים במעי האנושי צולמו במשך 20 שעות. כפי שמודגם בתמונות אלה, אורגנואידים במעי אנושי שהוזרקו עם PBS שמרו כמעט על כל האות הפלואורסצנטי הקיים ב-T אפס.עם זאת, אורגנואידים במעי אנושיים שהוזרקו גם הם עם TcdA, או טופלו ב-EGTA, הראו ירידה משמעותית בעוצמת הפלואורסצנט עד שמונה שעות לאחר המיקרו-הזרקה. נתוני ההדמיה כומתו עבור כל אורגנואידים במעי האנושי בכל נקודות הזמן כדי ליצור מערך נתונים ברזולוציה גבוהה המייצג את השינוי היחסי בעוצמת הפלואורסצנט לאורך זמן בכל תנאי ניסוי. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-30 דקות עד שעה, תלוי במספר תנאי הניסוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות סבלני ולקחת את הזמן בעת יישור האורגנואידים של המעי האנושי עם המיקרו-נימי לפני המיקרו-הזרקה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR, כתם מערבי וחיפוש RNA כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לתגובת האורגנואיד במעי האנושי לחומר המוזרק. פיתוח טכניקה זו אפשר לנו לבחון את ההשפעות של רעלנים חיידקיים, חומרים פרמקולוגיים, ציטוקינים ואפילו מיקרואורגניזמים חיים על תפקוד מחסום האפיתל באורגנואידים במעי אנושי.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק מיקרו דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית וחומרים ניסיוניים אחרים ללומן של אורגנואיד מעי אנושי. אל תשכח שכאשר עובדים עם רעלנים חיידקיים או אורגניזמים חיים, זה יכול להיות מסוכן ביותר, ולכן תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בציוד הגנה אישי מתאים בעת ביצוע הליך זה. ולבסוף, היזהר במיוחד להימנע מפצעי דקירה מכיוון שהמיקרו-נימים חדים במיוחד.

real-time-measurement-epithelial-barrier-permeability-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בתכשירי רקמת מעיים שנכרתו או "שקי מעיים" כמודל ex vivo של תפקוד מחסום המעי. מודל זה עשוי לשמש להערכת שלמות מחסום האפיתל ושכבת הג'ל הרירית באתרי מעיים ספציפיים במודלים של מחלות עיכול בבעלי חיים.

Sacs Ex Vivo המעיים להעריך חדירות ריריות מודלים של מחלות במערכת העיכול

שתי שיטות מוצגים כאן כדי לקבוע פונקציה מכשול המעי. מטר אפיתל (וולט/אוהם) משמש עבור מדידות של ההתנגדות החשמלית transepithelial של epithelia בתרבית ישירות בבארות תרביות רקמה. בעכברים, שיטת gavage FITC-לתוספי משמשת כדי לקבוע את חדירות המעי ויוו.

במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי

כאן אנו מתארים טכניקה כדי לכמת את שלמות המכשול של אורגנואידים מעיים קטנים. העובדה כי השיטה מבוססת על אורגנואידים חיים מאפשר חקירה רציפה של שלמות מכשול שונים חומרים מודולים או שילובים אותם באופן שנפתר בזמן.

חקירת פירוק מחסום המעיים באורגנואידים חיים

תוך ניצול של מיקרוסקופ תוך-ויטאל, השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה בזמן אמת של שפיכת תאי אפיתל במעיים בבעלי חיים חיים. לכן, רירית מעיים מוכתמת topically (acriflavine ו rhodamineB-dextran) של עכברים מרדימים הוא תמונה עד רזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופית confocal.

גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל

כאן, אנו מתארים את ההכנה של מונו-שכבות אפיתל מעיים שמקורן באורגנואידים אנושיים לחקר תפקוד מחסום המעיים, חדירות והובלה. מכיוון שאורגנואידים מייצגים את התגובה המקורית של רקמת האפיתל לגירויים חיצוניים, מודלים אלה משלבים את היתרונות של יכולת ההרחבה של קווי התאים ואת הרלוונטיות והמורכבות של הרקמה הראשונית.

מונו-שכבת אפיתל שמקורה באורגנואידים: מודל במבחנה רלוונטי מבחינה קלינית לתפקוד מחסום המעי

פרוטוקול זה מפרט את התבססותם של אנטרואידים, מודל מעיים תלת-ממדי, מרקמת המעי העוברית. הדמיה אימונופלואורסצנטית של סמנים ביולוגיים אפיתליאליים שימשה לאפיון מודלים. חשיפה אפית של ליפופוליסכרידים, אנדוטוקסין חיידקי, באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה המושרה חדירות אפיתל באופן תלוי מינון שנמדד על ידי דליפה של דקסטרן פלואורסצנטי.

בדיקת חדירות אפיתל באנטרוידים שמקורם ברקמות עובריות

הפרוטוקול הנוכחי מתווה שיטה המשתמשת בצהוב לוציפר במודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט כדי לקבוע חדירות מעיים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע חדירות paracellular ב enteroids כי מודל מחלות מעי דלקתיות כגון דלקת אנטרוקוליטיס נמקית.

קביעת חדירות מעיים באמצעות לוציפר צהוב במודל אנטרואיד אפיקל-אאוט

מחקר זה מציג פרוטוקול ליצירת חד-שכבות דו-ממדיות של מעי בקר מאורגנואידים, ומציע גישה משופרת לחקר אינטראקציות בין פונדקאי לפתוגן. הוא כולל שיטות להערכת שלמות ותפקוד הממברנה, קידום מודלים במבחנה המחקים את הפיזיולוגיה של מערכת העיכול של הבקר. גישה זו מבטיחה יתרונות ביו-רפואיים וחקלאיים משמעותיים, כולל אסטרטגיות טיפול משופרות.

התקדמות בטכנולוגיית אורגנואיד בקר באמצעות ממשקים חד-שכבתיים של מעי קטן וגדול

מחקר זה מתאר פרוטוקול ליצירת חד-שכבות דו-ממדיות של אורגנואידים חזיריים שמקורם במעי הדק והגס. הצמיחה של חד-שכבות אלו מסומנת על ידי הגדלת ערכי TEER, המעידים על שלמות אפיתל חזקה. בנוסף, חד-שכבות אלה מציגות תגובות הפרשה פיזיולוגיות בניסויי תא אוסינג לאחר יישום פורסקולין.

אורגנואידים דו-ממדיים במעי חזיר המשקפים את התכונות הפיזיולוגיות של המעיים הטבעיים

הפרוטוקול המובא במחקר זה מתאר שיטות לניטור בזמן אמת של התקדמות מחדש באמצעות מדידת הקינטית של סמנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים חיוביים ושליליים באמצעות ניתוח תזרים cytometry. הפרוטוקול גם כולל את הערכה המבוססת על הדמיה של מורפולוגיה, סמן או ביטוי הכתב במהלך הדור iPSC.

מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

למד מדידת חדירות מחסום האפיתל בזמן אמת באורגנואידים מעיים אנושיים באמצעות מיקרו-הזרקת FITC-dextran ומיקרוסקופיה חיה. שיטה זו מאפשרת הדמיה וכימות שינויים בחדירות בתגובה לטיפולים פרמקולוגיים.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

גלה סרטונים נוספים