Name: ננוליתוגרפיה בדיקה סריקת שטח גדול בהנחייתם של יישור אוטומטי ויישומו המצע פבריקציה נוספת ללימודי תרבות תא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למד ננוליתוגרפיה סריקת שטח גדולה להכנת משטחים ננו-מובנים לחקר אינטראקציות תאים. השיטה משתמשת במערכי חיישני PDMS וביישור אוטומטי לחקירת תאי גזע מזנכימליים ופיתוח ביומטריאלים מתקדמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים לאשר תמיכה כספית ממגוון רחב של מקורות כולל את בריטניה הנדסת ולהעניק המועצה למחקר מדעי (השופט. EP/K011685/1, EP/K024485/1) ו- studentship לתואר שני עבור JH; הקרן Leverhulme (RPG-2014-292); קרן תמיכה אסטרטגית מוסדית טרסט (105610/ת/14-ת); המועצה הבריטית (216196834); אוניברסיטת מנצ'סטר עבור אוניברסיטה של מכון המחקר מנצ'סטר (UMRI משאבת לקרקע קרן), מלגת הדוקטורט לנשיאות לסיוע טכני SW. על ידי ד ר אנדריאס ליב (Nanosurf AG) הוא הודה גם בהכרת תודה.

<ol><li>Saavedra, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0034-4885/73/3/036501/meta">Hybrid Strategies in Nanolithography.</a> Rep. Prog. Phys. 73, 036501(2010).</li>
<li>Gates, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Approaches+to+Nanofabrication%3A+Molding%2C+Printing%2C+and+Other+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques.</a> Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).</li>
<li>Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Scanning+Probe+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Advanced Scanning Probe Lithography.</a> Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).</li>
<li>Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/283/5402/661">"Dip-Pen" Nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li>
<li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Dip-Pen+Nanolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of Dip-Pen Nanolithography.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).</li>
<li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.125120">Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching.</a> Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).</li>
<li>Kim, K. -H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nanofountain+Probe+with+Sub-100+Molecular+Writing+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution.</a> Small. 1, 632-635 (2005).</li>
<li>Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluidFM+as+a+Lithography+Tool+in+Liquid%3A+Spatially+Controlled+Deposition+of+Fluorescent+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles.</a> Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).</li>
<li>Salaita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Dip-Pen+Nanolithography+with+55+000-Pen+Two-Dimensional+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).</li>
<li>Huo, F., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/321/5896/1658">Polymer Pen Lithography.</a> Science. 321, 1658-1660 (2008).</li>
<li>Shim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hard-Tip%2C+Soft-Spring+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hard-Tip, Soft-Spring Lithography.</a> Nature. 469, 516-520 (2011).</li>
<li>Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Force-Feedback%22+Leveling+of+Massively+Parallel+Arrays+in+Polymer+Pen+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">"Force-Feedback" Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography.</a> Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).</li>
<li>Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/ra/c5ra11967g">Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays.</a> RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).</li>
<li>Noh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Multipoint+Force+Feedback%22+Leveling+of+Massively+Parallel+Tip+Arrays+in+Scanning+Probe+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">"Multipoint Force Feedback" Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography.</a> Small. 11, 4526-4531 (2015).</li>
<li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+of+Human+Mesenchymal+Cell+Differentiation+Using+Nanoscale+Symmetry+and+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder.</a> Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).</li>
<li>Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/tc/c5tc00186b">Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography.</a> J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).</li>
<li>Giam, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Probe-Enabled+Nanocombinatorics+Define+the+Relationship+Between+Fibronectin+Feature+Size+and+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).</li>
<li>Eichelsdoerfer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Area+Molecular+Patterning+with+Polymer+Pen+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography.</a> Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).</li>
<li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irreversible%2C+Direct+Bonding+of+Nanoporous+Polymer+Membranes+to+PDMS+or+Glass+Microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices.</a> Lab Chip. 10, 548-552 (2010).</li>
<li>Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-+and+Time-Dependent+Feature+Size+and+Shape+Control+in+Molecular+Printing+via+Polymer-Pen+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography.</a> Small. 6, 1082-1086 (2010).</li>
<li>Sheehan, P. E., Whitman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol+Diffusion+and+The+Role+of+Humidity+in+%22Dip+Pen+Nanolithography%22%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Thiol Diffusion and The Role of Humidity in "Dip Pen Nanolithography".</a> Phys. Rev. Lett. 88, 156104(2002).</li>
<li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la034464x">Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing.</a> Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).</li>
<li>Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+Binding+of+Distinct+Functional+Fibronectin+Domains+to+Immobilized+Metal+Chelates%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates.</a> Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).</li>
<li>Curran, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+Dip+Pen+Nanolithography+as+a+Tool+for+Controlling+Stem+Cell+Behaviour%3A+Unlocking+the+Potential+of+the+Next+Generation+of+Smart+Materials+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine.</a> Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).</li>
<li>Davey, M. R., Anthony, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavey%2C+MR+%22Plant+Cell+Culture%3A+Essential+Methods%22">Plant Cell Culture: Essential Methods</a>. , John Wiley & Sons. 153-172 (2010).</li>
<li>Brinkmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdigitated+Multicolored+Bioink+Micropatterns+by+Multiplexed+Polymer+Pen+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography.</a> Small. 9, 3266-3275 (2013).</li>
<li>Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose-Assisted+Dip-Pen+Nanolithography+of+Oligonucleotides+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins.</a> ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).</li>
<li>Carnally, S. A. M., Wong, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+Catalysis+to+Enhance+Scanning+Probe+Nanolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography.</a> Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).</li>
</ol>

היישור אלגוריתם והתוכנה פותחו על-ידי, ל, אוניברסיטת מנצ'סטר. הוא זמין להורדה בכתובת http://www.click2go.umip.com/.

פרוטוקול זה משמש כדי לספק למשתמשים מתודולוגיה נוח לבצע במהירות nanolithographic תכנים אחידות גבוהה וגודל תכונה לשליטה על גדול אזורים (2ס מ). מצעים הנושאת אלה nanopatterns שטח גדול יכול אז להיות כתביעות למגוון רחב של יישומים. אחד היישומים העיקריים של טכנולוגיה זו הוא דור של משטחים nanofabricated ללימודי תא-פני אינטראקציה. דוח זה מציג כמה דוגמאות להמחשה של תרבית תאים על חומרים אלה, הפגנת שליטה על מורפולוגיה hMSC מאת nanofabricated סובסטרטים.
לתמוך מפתח של פרוטוקול זה הוא האוטומציה של ההליך יישור (שלב 4) המאפשר ייצור מאוד אחידה, תפוקה גבוהה של תכונות על משטחים, עד רזולוציה ננו, שמאפשר תחלופת מהירה של ניסויים התרבות התא. הדפס אבן העט פולימר מתבצעת באמצעות אלגוריתם יישור זה הוא מסוגל לייצר ננו התכונות בתוך כ 30 דקות. הפארמצבטית ואת הדיוק של יישור אוטומטי, ובכך האחידות של התכונות בדוגמת, הוא אולם אנושות התלוי על האיכות של המערכים בדיקה כי הם יוצרו (שלב 1 ו-2). פגמים בהכנה שלהם כי התוצאה הגששים בוטה, שבור או חסר; כגון אוויר לכוד בועות (שלב 1.5), או פסולים הפרדת הגששים מתבנית הבסיס (שלב 1.8) יכול לגרום יישור לא מדויק, ליתוגרפיה באיכות ירודה.
זה דיווח שיטת מניות מגבלה במשותף עם שיטות אחרות יישור המסתמכים על משוב. הקביעה מדויקת של מתי הגששים נמצאים בקשר עם פני השטח מוגבל בשל הצורך להביא בחשבון רקע ויברציות הנגרמת על ידי הסביבה הסביבה והתנועה של השלב הדגימה. באופן כללי, החיישנים יש רגישות כוח המשטר µN (2 µN במקרה זה), אבל האלגוריתם יישור נועד רק להירשם לכח µN 490 לפחות כאיש קשר סופית את הגששים בין פני השטח, על מנת למנוע כל תוצאות הבדיקות של 'תוצאות חיוביות שגויות' טינג מרעש הרקע. 13 כך, שיטה זו נוטה לייצר תכונות גדול (1-2 מיקרומטר) מאז הגששים חייב מורחב מרחק גדול z-ציר (עם כוח גבוה הסוגר) כדי להירשם קשר. כדי לפצות, תכונות קטן יכול להיווצר על-ידי הפחתת את z-ציר מרחק נסע במהלך השלב הדפס אבן (למשל, הזנת את ההגדרה 'שחור' בשלב 5.2.3.2 כמו מיקרומטר 3 במקום 5 מיקרומטר).
ובכל זאת, אפילו עם מגבלה זו, אוטומציה האלגוריתם הוא מסוגל לטפל היבט קריטי ביישום של ויישומי סריקה בדיקה שיטות ליתוגרפיה, כמו יישור היה בעבר הכי תובעני ולא מדויק הצעד ב יישום של טכניקות אלה. אוטומציה הזה עכשיו עובר לשלב הגבלת קצב של תהליך ייצור מ היישור לכתוב ליטוגרפית עצמה. בעוד פרוטוקול זה מדגים היישום של הליך היישור כדי PPL, המסגרת יכול לחול על מספר טכניקות SPL כגון שומנים בדם-DPN26 , ליתוגרפיה בסיוע מטריקס27 , כמו גם העתיד פוטנציאל קטליטי מערכות בדיקה. 28

התקדמות בננוטכנולוגיה היא תלויה התפתחות טכניקות מסוגל ביעילות ובאמינות בדיית תכונות ננו על משטחים. 1 , עם זאת, 2 יוצר כזה כולל על פני שטחים גדולים (מספר ס מ2) באופן אמין, על עלות נמוכה יחסית היא מאמץ לא טריוויאלי. רוב טכניקות הקיים, נגזר תעשיית המוליכים למחצה, מסתמכים על פוטוליתוגרפיה פולשני ליצור חומרים 'קשים'. לאחרונה, שיטות ליטוגרפיה נגזר סריקת בדיקה מיקרוסקופית (SPM) הופיעו כמו בגישה נוחה, רב-תכליתי עבור שטנץ מהירה של ננו עיצובים. 3 טכניקות מבוססות SPM מסוגלים במהירות ובנוחות ' לכתוב ' בכל תבנית על-ידי המשתמש. הידועה ביותר של אלה הוא מח שעט ננוליתוגרפיה (DPN), חלוץ ידי מירקין. et al.,4 שם בדיקה סריקה משמש בתור 'עט' להעביר 'דיו' מולקולרית השטח בהפקת תכונות בצורה מקבילה לכתיבה. תחת תנאי הסביבה, כמו בדיקה נסרק על פני משטח מולקולות 'דיו' מועברים על פני השטח באמצעות מניסקוס מים צורות בין החללית לבין פני השטח (איור 1). DPN ובכך מאפשר בתצהיר nanolithographic של מגוון רחב של חומרים, כולל חומרים "רכים" כגון פולימרים מולקולות. 5 באמצעות הגששים מהונדסים עם ערוצים עבור משלוח נוזל, טכניקות הקשורות בדרכים שונות המכונה 'nanopipettes', 'ננו-מזרקה עטים', גם דווחו. 6 , 7 , 8
המכשול העיקרי ליישום רחב יותר של ליתוגרפיה SPM-derived היא תפוקת, כפי שהוא דורש תקופה ארוכה מדי דפוס סנטימטר בקנה מידה אזורי גשש בודד. המאמצים המוקדמים כדי לטפל בבעיה זו התמקדו parallelization של DPN המבוסס על זיז, עם 'אחד-מימדי' וגם 'דו מימדי' מערכי בדיקה (2D) שדווח עבור ליתוגרפיה של אזורים בגודל סנטימטר. 5 , 9 . אולם, אלה זיז מיוצרים באמצעות שיטות ייצור שקודמים מורכבות יחסית ומעריכי חלשים יחסית. ההמצאה של פולימר עט ליתוגרפיה (PPL) התייחס בעיה זו על-ידי החלפת cantilevers SPM סטנדרטי של מערך דו-ממדי של הגששים elastomer siloxane רך בונדד לשקופית זכוכית. 10 תוכנית התקנה זו בדיקה פשוטה מקטין באופן משמעותי את העלות והמורכבות של תכנים שטחים גדולים, פתיחת ננוליתוגרפיה למגוון רחב של יישומים. ארכיטקטורה זו ללא זיז הורחב גם כדי קשה-טיפ קפיצים רכים לליטוגרפיה,11 אשר מספק הכלאה של גיבוי אלסטומרים רכים עם טיפים סיליקון קשיח נותנת רזולוציה משופרת לעומת דפוסים המיוצר באמצעות רך אלסטומר טיפים.
גורם מכריע בביצוע של טכנולוגיות אלה דו-ממדיות מערך הוא המערך בדיקה חייב להיות מקביל בדיוק המצע משטח כך כשהוא מנוצל ליתוגרפיה, כל הגששים לבוא במגע עם המשטח בו זמנית. אפילו אי-התאמות קטן יכול לגרום הבדל משמעותי בגודל תכונה מצד אחד של המערך השני, מאז הגששים כמה יבואו במגע עם המשטח מוקדם יותר במהלך הירידה של המערך, בעוד אחרים יבואו במגע מאוחר או בכלל לא. 12 יישור מדויק חשוב במיוחד עם PPL בשל ודפורמביליות של הגששים elastomer רך, איפה הגששים פנייה אל פני השטח קודם לכן יהיה דחוס, להשאיר טביעת רגל גדולה יותר על פני השטח.
העבודה מוקדם על PPL מועסקים בדיקה ויזואלית בלבד כדי להנחות תהליך יישור, בעזרת מצלמה רכוב מעל המערך להתבונן להרכב של הגששים כפירמידה כפי הם הובאו במגע עם המשטח. 10 יישור נשפט על ידי התבוננות באיזה צד של הגששים בא במגע עם המשטח תחילה, ולאחר מכן התאמת הזווית חוזר את ההליך בצורה איטרטיבית עד ההבדל בין קשר בכל צד של המכשיר היה שהכחיש העין. כפי בהליך יישור זה מסתמך על בדיקה ויזואלית סובייקטיבית על ידי המפעיל, הפארמצבטית הוא נמוך.
לאחר מכן, בגישה אובייקטיבית יותר פותחה, המורכב חיישן כוח רכוב מתחת המצע למדוד לחיל. מוחל על מגע של הגששים על פני השטח. 12 יישור ובכך הושג על-ידי התאמת הזוויות הטיה להגדיל את הכוח שהופעל, אשר ציין כי כל הגששים היו בו זמנית במגע. שיטה זו הראה כי יישור כדי בתוך 0.004° המקבילה משטח אפשרי. זה 'חיל משוב מכונות להשמה והפצה' עכשיו יושם לתוך מערכות אוטומטית לחלוטין שני דוחות עצמאיים. 13 , 14 שני להשתמש שילוש של חיישנים חיל רכוב או המצע מתחת או מעל המערך, למדוד את כמות הכוח המופעל על קשר בין מערכי בדיקה פני השטח. מערכות אלה לתת ברמת דיוק גבוהה, דיווח misalignments של ≤0.001 מעלות מעל 1 ס מ אורך קנה מידה,14 או ≤ 0.0003 ° מעל 1.4 ס מ.13 מערכות אוטומטיות יישור אלה מספקים גם רס ן תוך חיסכון למפעיל זמן וזמן הכללית כדי להשלים ליתוגרפיה תהליך.
יישום מרכזי אחד של תפוקה גבוהה משטח פבריקציה נוספת זמינה על-ידי טכנולוגיה זו הוא הדור של סובסטרטים התרבות תאים. ובכן עכשיו שמאץ פנוטיפ תא הזה ניתן לטפל על ידי שליטה האינטראקציה הראשונית בין תאים לבין תכונות פני השטח, וזה יכול להיות מוגברת זו-ננו. 15 . במיוחד, שיטות סריקה של ליתוגרפיה בדיקה הוכחו להיות שיטה נתיישב לייצר מגוון רחב של משטחים nanofabricated כזה ניסויים התרבות התא. 16 . לדוגמה, משטחים מציג דפוסי ננו monolayers עצמית שהורכבו ו מטריצה חוץ-תאית חלבונים בתבניות על ידי PPL DPN שימשו כדי ללמוד את הפוטנציאל של חומרים ננו-השתנה בחומר המושרה הבידול של תאי גזע. 17
פרוטוקול זה מתאר הניצול של כוח אטומי שונה מיקרוסקופ (AFM) מערכת המאפשרת PPL שטח גדול. פירוט לנו האיתור של כוח באמצעות חיישנים כוח מרובים כאמצעי לקביעת בדיקה-משטח מגע, יחד עם אלגוריתם אשר הופך לאוטומטי את תהליך איטרטיבי יישור. Functionalization הבאים מדפוסים אלה עם fibronectin חלבון מטריצה חוץ-תאית, התרבות של האדם גזע mesenchymal (hMSC) מתוארים, כמו הפגנה של משטחים מפוברק-PPL בקשה לקבלת תרבית תאים.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexAFM מותקן על 5 צירים ממונעים (XYZ&Theta; &פי;) תרגום ושלב גוניומטר</td><td>NanoSurf</td><td>P40008</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת בקרת AFM NanoSurf</td><td></td><td>C3000</td><td></td></tr><tr><td>עט חריטה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225568</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>האריק PDC-32G-2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלזמה</td><td></td><td>PDC-FMG-2</td><td></td></tr><tr><td>משאבת שירות חמצן יבש כלכלה</td><td>פלזמה האריק</td><td>PDC-OPE-2</td><td></td></tr><tr><td>צינור מסובב</td><td>סטיוארט</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>ואקום מייבש</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q מערכת טיהור מים</td><td>Merck Millipore</td><td>ZRXQ015WW</td><td></td></tr><tr><td>מחולל לחות מודולרי</td><td>proUmid</td><td>MHG32</td><td></td></tr><tr><td>Proline Plus פיפטה 100-1000 ומיקרו; L</td><td>Sartorius</td><td>728070</td><td></td></tr><tr><td>מאסטרים סיליקון NIL</td><td>טכנולוגיה</td><td>בהתאמה</td><td></td>אישית</tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף</td><td>אולימפוס</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>מטרות מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>10x ו-60x UPlan FLN &infin;/-/FN 26.5</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שדה בהיר זקוף</td><td>Leica</td><td>DM 2500M</td><td></td></tr><tr><td>אולטראסוניקטור</td><td>אולטרה-ווייב בע"מ</td><td>גיליון אלקטרוני U95</td><td></td></tr><tr><td>להקלטה והטמעה של תוצאות יישור אוטומטי</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34863</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דליק Sildes, שקוף, טחון</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>451000</td><td></td></tr><tr><td>(7&ndash; 8% וינילמתילסילוקסן)-דימתילסילוקסן קופולימר,</td><td>ג'לסט</td> עם סיומתיל סילוקסי <td>VDT-731</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5,7-טטרמתיל-1,3,5,7-טטרה-וויניל ציקלוטטרסילוקסן</td><td>ג'לסט</td><td>SIT7900.0</td><td></td></tr><tr><td>פלטינום(0)-1,3-דיוויניל-1,1,3,3-טטרמתילדיסילוקסן תמיסת קומפלקס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>479527</td><td>מזיק, רעיל</td></tr><tr><td>(25&ndash; 35% מתילהידרוסלוקסן)-דימתילסילוקסן קופולימר, ג'לסט מסתיים טרימתילסילוקסן</td><td></td><td>HMS-301</td><td></td></tr><tr><td>סירת משקל 100 מ"ל</td><td>ציוד מעבדה מדעית</td><td>BALI828</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה פסטר</td><td>אפלטון וודס</td><td>KS230</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>ST10-031T</td><td></td></tr><tr><td>סרט פחמן דביק</td><td>אגר מדעי</td><td>AGG3939</td><td></td></tr><tr><td>16-חומצה מרקפטוהקסדקנואית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>448303-1G</td><td>אתנול מזיק ורעיל</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34852</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ מצופה זהב</td> דליק <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>643203</td><td>לאחר פתיחת הזהב יישאר מגיב לתיולים למשך חודש אחד לפחות</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8656</td><td>מזיק, ברזל רעיל</td></tr><tr><td>(III) חנקתי נונאהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>529303</td><td>מזיק, רעיל</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>84415</td><td>מזיק, רעיל</td></tr> <tr><td>(11-מרקפטונדציל) הקס (אתילן גליקול)</td> <td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>675105</td><td>מזיק, פיברונקטין רעיל</td></tr><tr><td>מפלזמה אנושית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>קובלט (II) ניטראט הקסהידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>203106</td><td>מזיק ורעיל</td></tr><tr><td>דולבקו s פוספט חוצץ מלח</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MSCGM צמיחת תאי גזע מזנכימליים בינוני</td><td>לונזה בריטניה</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>תאי גזע מזנכימליים אנושיים</td><td>לונזה בריטניה</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>הראוס מולטיפוגה X1 צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר 75004210</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה CELLSTAR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/0840/53</td><td>מזיק, רעיל</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td> <td>"חומר ניקוי" בכתב יד</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade מדיום הרכבה עם</td><td>וקטור DAPI מעבדות</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ארנב נוגדן נגד פיברונקטין</td><td>Abcam</td><td>ab2413</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 12 בארות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10253041</td><td></td></tr><tr><td>T75 רקמה בקבוק תרבות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790113</td><td></td></tr><tr><td>שלוחה</td><td>BudgetSensor</td><td>ContAl-G</td><td></td></tr></tbody></table>

ננוליתוגרפיה בדיקה סריקת שטח גדול בהנחייתם של יישור אוטומטי ויישומו המצע פבריקציה נוספת ללימודי תרבות תא

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

סריקת בדיקה מיקרוסקופיית אפשרה היצירה של מגוון שיטות בונה ('') מלמעלה למטה מימדיות של תכונות בקנה מידה ננומטר. מבחינה היסטורית, חיסרון גדול של סריקת בדיקה ליתוגרפיה כבר התפוקה נמוכה ממהותם של מערכות בדיקה בודדת. זה יש כבר הסתער על ידי השימוש של מערכים של הגששים מרובים כדי לאפשר ננוליתוגרפיה מוגברת תפוקה. לצורך יישום כזה ננוליתוגרפיה ויישומי, יישור מדויק של מערכי בדיקה עם משטח המצע הוא חיוני, כך לבצע רגשים כל קשר עם פני השטח בו זמנית כאשר המתבנת ליטוגרפיה מתחילה. פרוטוקול זה מתאר את הניצול של פולימר ליתוגרפיה עט כדי לייצר ננומטר-סולם תכונות מעל אזורים בגודל סנטימטר, בהנחייתם של השימוש של אלגוריתם עבור יישור מערכי בדיקה מהירה, מדויקת, אוטומטית. . הנה, ננוליתוגרפיה של תיולים על מצעים זהב מדגים את הדור של תכונות עם אחידות גבוהה. הדפוסים הללו הם functionalized ואז עם fibronectin לשימוש בהקשר של תא שטח מכוון מורפולוגיה מחקרים.

כדי לבדוק היישור האוטומטי היה מוצלח, נבחנו הגרפים המותווים מתוך נתוני יישור (בגיליון מהשלב 4.8). שם תהליך יישור הצליחה שתי החלקות, המתאימים לזווית שבו הבמה לדוגמה יש כבר מוטה לאורך הצירים θ באמצעות וφ, הראה סדרה של בעליה וירידה נקודות נתונים. בכל אחת החלקות, שני מתאים ליניארי של נקודות הנתונים הראה מוגדרים היטב על המחשב המשולב "שיא" המציין את מרבית z-את הזווית המתאימה שבה היה יישור והסיומת מושגת (איור 4A , 4B). תהליך זה הוא חוזרות ארבע פעמים (כלומר, פעמיים על כל ציר), התווה ארבע נקודות ציון. נקודת ההצטלבות בין כל זוג של נקודות הציון ובכך מראה הזוויות הכולל אופטימום (איור 4C). 13 במקרים שבו היישור לא היה מוצלח, זה יכול להיות שנצפו כי θ באמצעות המתאימים וחלקות הזווית φ שלהם לא נותנים מתאים ליניארי באיכות טובה, או שאינם נחתכים (איור 5). היישורים כושל כזה בדרך כלל כתוצאה מערכי של להיות קצוץ באופן לא תקין או רכוב על המחזיק בדיקה (שלבים 1.7, 1.8 ו- 2.2). במקרים אלה, מערכי של שנמחקו, אחד חדש שהוכן רכוב (שלבים 1 ו- 2) ו תהליך יישור חוזרות (שלב 4).
יישור מוצלחת ועל ליתוגרפיה עם מנהל מאת PPL, מצעים זהב בדוגמת היו אז עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ כוח לרוחב לבחון התצהיר התרחש. בדיקה אזור גדול של משטחים המודפס נערך גם על ידי מיקרוסקופ אופטי של סובסטרטים לאחר איכול הזהב אינו מוגן על ידי תיול הפקיד (איור 6 ואיור 7). עם זאת, הדפוסים חרוט אינם יכולים לשמש עבור עוד יותר functionalization, ניתן להשתמש בו רק כדי לאשר המתבנת על מדגמים מייצגים של אצווה של סובסטרטים השטח המודפס. אם התבניות חרוט להראות אזורים ריקים המייצגים עטים בודדים (איור 8), תוצאה זו עולה כי הייצור של מערכי בדיקה לא סיים בהצלחה, וכי הגששים כמה הם פגומים או חסרים. זה inhomogeneity של הגששים יכול להיות בגלל השימוש הציירים הגדולים שבהם הציפוי perfluorinated שחק (שלב 1.3), וכתוצאה מכך כמה הגששים נקרעת משם כאשר המערך מופרדת מן המאסטר. במקרים אלה, אדון חדש אמור לשמש. התוצאה יכול להיות גם בגלל הנוכחות של אוויר בועות לכוד בין הזכוכית גיבוי והמאסטר (שלב 1.5), או אם המערך בדיקה לא נקיה הופרד מהמאסטר לאחר ריפוי (שלב 1.8).
מיקרוסקופ נמכרות התמונות של משטחים fibronectin functionalized hMSCs מתפשט היו גם שנאספו (איור 9). באופן כללי, הכל מצעים היו יציבים בתוך הסביבה תרבות במבחנה , התאים דבקה ומותאמים שלהם מורפולוגיה לתבניות המודפסות במקרה של קטן מבודד 20 x 20 מערך של תכונות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig1.jpg"> איור 1. ייצוג סכמטי של פולימר עט ליתוגרפיה מראה דיו מולקולרית תחבורה באמצעות מניסקוס מים על קצה המקדח. (א) מבט צד, מבט מלמעלה (ב) של המערך עט פולימרי מציינים כי כאשר בדיקת array ו משטח המצע מיושרים באופן מלא, כל הגששים לבוא במגע עם המשטח בו זמנית, וכתוצאה מכך ליתוגרפיה ויישומי. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig2.jpg"> באיור 2. תרשים סכמטי של פולימר עט ליתוגרפיה להגדיר האם (א) מבט צד מורחבת ניסיוני להגדיר איפה המערך מוכן בדיקה מצורף כדי לחקור מחזיק, רכוב על הסורק AFM. המצע מושם על הבמה, להלן אשר ממוקמים שלושת בכוח חיישנים. (ב) ייצוג של מכשור התאספו, מציג ראש הסריקה AFM ביחס השלב מדגם. התצוגה התחתונה (ג) חיל חיישן מיקום מציג. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig3.jpg"> איור 3. ייצוג סכמטי המתאר את התוכנית ספקטרוסקופיה שהפרוצדורה יישור. הסורק AFM מוגדר להעביר את הגששים לכיוון לדוגמה על-ידי למרחק של 10 מיקרומטר בתוך 100 ms, שהתקיים עמדה עבור 250 ms, ואחריו הכחשה של 10 מיקרומטר בתוך 100 ms, והחזיק מכן עבור ms 250 במיקום שקועה. ההצעה ואז חוזרת לאורך כל תהליך היישור. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig4.jpg"> באיור 4. גרפים הממחישות יישור מוצלחת של. גרפים של מיקום z נגד הטיה זוויות (א) θ באמצעות, (ב) φ ליישור מוצלחת, איפה ● מציין נמדדו הערכים הממשיים ומציין + הכי מתאים באמצעות שיטת הריבועים הפחותים. (ג) גרף של φ נגד θ באמצעות מצויד זוויות עם ארבע נקודות איפה z-המיקום המירבי הושג. נקודת ההצטלבות מסומן הוא הזווית הסופי הטיה אופטימלית לאורך שני הצירים. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig5.jpg"> איור 5. גרפים הממחישות ישור כושל. גרפים של מיקום z נגד הטיה זוויות (א) θ באמצעות φ (B) עבור ישור כושל, איפה ● מציין נמדדו הערכים הממשיים ומציין + הטוב ביותר להתאים את שיטת הריבועים הפחותים. (ג) גרף של φ נגד θ באמצעות מצויד זוויות עם ארבע נקודות איפה z-המיקום המירבי הושג. אין אופטימה ברורה או נקודת ההצטלבות שנצפו, לכן הזוויות אופטימום היישור לא נפתרים. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig6.jpg"> איור 6. מיקרוסקופ אופטי המחשה ותמונות של מיקרוסקופ כוח אטומי של סובסטרטים זהב היו בדוגמת עם מנהל על ידי מערכי PPL המיושרת של, ואז חרוט. (א) ו- (ב) הם תמונות ברצף המוגדל מיקרוסקופ אופטי של הדפוסים חרוט; (ג) היא תמונה הטופוגרפיה AFM של רשת יחיד של תבניות. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig7.jpg"> איור 7. תמונות המחשה מיקרוסקופ אופטי של סובסטרטים זהב היו בדוגמת עם מנהל על ידי מערכי PPL המיושרת של, ואז חרוט. (א) ו- (ב) הם תמונות ברצף המוגדל מיקרוסקופ אופטי של דפוסי חרוט והוא (ג) תמונה הגדלה נמוכה יותר, המציג את שטח גדול דפוסי הומוגנית. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig8.jpg"> איור 8. תמונת המחשה מיקרוסקופ אופטי של מצע זהב היה לצר בדוגמת עם מנהל ולאחר מכן חרוט. הדפוסים המיועד (מוצג באותיות שיבוץ) היו חוזרים רשתות קווי נקודה 20 מסודרים קווים 20, עם כל שתי שורות המיוצרים על ידי הגדלת את z-הרחבת ציר מאת 1 מיקרומטר (הנע בין 5 ל-5 µm). ניתן לראות כי באזורים מסוימים אין דפוסי נוצרים, עקב חסר הגששים במיקומים אלה. באזורים שבהם מיוצרים רק שתי שורות של נקודות, תוצאה זו עולה כי בדיקה קיים אבל זה לא באותו גובה כמו הגששים לתפקוד מלא, כך פיקדון בלבד כולל כאשר המערך יורחב כך מלא z-ציר המרחק. בתמונה זו, הניגוד שונתה בכוונה כדי לאפשר תצפית של האזורים חלקית המודפס. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig9.jpg"> איור 9. Epifluorescence תמונות מיקרוסקופ של hMSCs תרבותי במערכים fibronectin בתבניות על ידי PPL. (א) ו (ב) הם תמונות בהגדלה הצגה לתאים בודדים. (ג) מציג תבנית דוגמה של המערך fibronectin ללא חסיד תא ו- (ד) הוא תמונת שדה רחב של התאים תרבותי בתצוגת רשת (סכימטי של התבנית המודפסת היא גם שמוצג שיבוץ). התאים מוכתמים כדי להראות fibronectin (אדום), F-אקטין (ירוק) ותא גרעינים (כחול). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

כאן אנו מציגים עבור סריקה מרחבית ננוליתוגרפיה בדיקה זמינה על-ידי יישור איטרטיביים של מערכי בדיקה, כמו גם הניצול של דפוסי ליטוגרפית ללימודי אינטראקציה תא-פני פרוטוקול.

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

יש צורך גדול בכלים נוחים ליצירת תכונות ואובייקטים בקנה מידה ננומטרי, במיוחד בחקר אינטראקציות ביולוגיות עם חומרים ומשטחים ננומטריים. פרוטוקול זה מאפשר שכפול מהיר והומוגני של מערכי חלבונים על פני אזורים בקנה מידה של סנטימטר ברזולוציה ננומטרית. זה מאפשר לנו לחקור אינטראקציות של תאי גזע מזנכימליים על משטחים אלה.משטחי מודל אלה מאפשרים לנו לבחון אינטראקציות מבוקרות בין משתני חומר ספציפיים ותאי גזע מזנכימליים, ומספקים קריטריונים בסיסיים לתכנון חומרים שיודיעו על עיצובים עתידיים של ביו-חומרים. כדי להתחיל בהליך, מערבבים היטב את מרכיבי הפולימר PDMS בסירת שקילה. הסר את התערובת במייבש ואקום למשך 20 דקות או עד שכל בועות הגז נעלמו.לאחר מכן, הנח את מאסטר הסיליקון עבור מערך ה-PPL בצלחת פטרי של ארבעה סנטימטרים. יוצקים את תערובת הפרה-פולימר PDMS נטולת הגז על המאסטר עד לכיסוי מלא. הורד את ה-PDMS המכסה את המאסטר למשך חמש דקות נוספות.במהלך הסרת הגז יש לטפל במגלשת זכוכית עם פלזמת חמצן למשך דקה אחת. לאחר הסרת הגז, הנח בזהירות את השקופית על ה-PDMS כשהצד המטופל פונה כלפי מטה. לחץ בעדינות על המגלשה על מאסטר הסיליקון כדי להסיר אוויר כלוא וכדי להבטיח ששכבה אחידה של PDMS דחוקה בין המאסטר לשקופית.העבירו את מערך ה-PDMS הסנדוויץ' לצלחת פטרי אחרת עם מאסטר הסיליקון בתחתית. רפאו את ה-PDMS בתנור בחום של 70 עד 80 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות. לאחר מכן, הוציאו את מערך ה-PPL הנרפא מהתנור והניחו לו להתקרר במשך 15 דקות.השתמש בסכין גילוח כדי לקצץ בזהירות עודפי PDM מהגב ומהצדדים של מגלשת הזכוכית. פוצצו פסולת PDMS רופפת עם זרם של גז חנקן יבש. חשוב לקצץ PDMS עודפים מהחלק האחורי והקצוות של המערך כדי לאפשר יישור מדויק.זה גם עוזר למשתמש להתבונן טוב יותר בתנאי הבדיקות מתחת ל-AFM במהלך הליתוגרפיה. תקע סכין גילוח בפינת המערך בעומק של מילימטר אחד וחטף בזהירות את המערך ממאסטר הסיליקון בתנועת הרמה אחת רציפה. לאחר מכן חותכים ומגרדים בזהירות 0.5 מילימטרים מה-PDMS בקצוות המערך בעזרת סכין גילוח.על המשתמשים להיות זהירים מאוד בעת חיטוט המערכים מהמאסטר כדי להבטיח הפרדה טובה וכדי למנוע פגיעה בבדיקות. זה צריך להיעשות בפעולה אחת וחלקה מבלי שהמערכים ייפלו בחזרה על מאסטר הסיליקון. טפל במערך ה-PPL בפלסמיד חמצן למשך 30 שניות, ולאחר מכן זרוק 20 מיקרוליטר של מים נטולי יונים על משטח המערך.אם המים אינם מתפשטים באופן שווה על פני כל המערך, חזור על הטיפול בפלזמה. יבש היטב את המערך שטופל בפלזמה, ולאחר מכן השתמש בסרט פחמן דו צדדי כדי לחבר את המערך למחזיק בדיקת מיקרוסקופ הכוח האטומי. התקן את מחזיק הבדיקה על מחזיק ה-AFM kinematic.כדי להדפיס את המערך, יש למרוח טיפה של 20 מיקרוליטר של תמיסת MHA של מילי-מולרית אחת באתנול על המערך, תוך הימנעות ממגע בין קצה הפיפטה למשטח המערך. אפשר לתמיסת MHA להתפשט בכל המערך. המתן עד שהאתנול יתאדה.התקן את מחזיק הגשושית עם מערך ה-PPL על ה-AFM, ולאחר מכן הנח מצע זהב במרכז דגימת ה-AFMTAGה. תקן את המצע במקומו בעזרת סרט דבק. כדי להתחיל ביישור, הפעל את תוכנית ההתקנה של בקר ה-stage כדי לאפס את כל הצירים והזוויות לנקודת אפס מכוילת מראש.השתמש ב-AFM sample tagקונסולת הבקרה של ציר X ו-Y כדי להעביר את המצע למיקום ההדפסה הרצוי. החלף את ה-stagידית שחרור כדי לשחרר את הדגימהtagה ולהפעיל את חיישני הכוח. אפשר לחיישנים להתאזן למשך 15 דקות לפחות, ולאחר מכן השתמש בבקר ציר Z כדי להעלות את הדגימהtagה עד שהמערך יהיה קרוב ככל האפשר למצע.ודא שהמערך נמצא בטווח של מילימטר אחד מהמצע. לאחר מכן, פתח את תוכנית היישור האוטומטית. מלאו את שלב הזווית, מרחק הצעד הגס ומרחק הצעד העדין.הגדר את נתיב הקובץ של גיליון האלקטרוני וצרף את תבנית הגיליון האלקטרוני. לאחר מכן פתח את תוכנת הבקרה AFM ונווט לקטע הספקטרוסקופיה. הגדר את תנודת ציר ה-Z של ראש הסריקה כך שתתארך 10 מיקרומטר על פני 100 אלפיות השנייה, החזק למשך 250 אלפיות השנייה, החזר 10 מיקרומטר על פני 100 אלפיות השנייה והחזק למשך 250 אלפיות השנייה.הפעל את תנודת ראש הסריקה והפעל את היישור האוטומטי. לאחר שהתוכנה מציינת שהיישור הסתיים, סיים את תהליך היישור. בדוק את ההתאמה הליניארית שנוצרה אוטומטית של נתוני היישור כדי לקבוע אם היישור הצליח וכדי לזהות את הזוויות האופטימליות הכוללות, ולאחר מכן העלה את שלב הדגימה במרווחים של 500 ננומטר עד שנצפה מגע בין המערך למצע עם מצלמת AFM למעלה view.נקישה עצור בתוכנת הבקרה AFM כדי להחזיר את המערך ב-10 מיקרומטר. כדי להתחיל בתהליך PPL, פתח את קטע הליתוגרפיה של תוכנת הבקרה AFM. בחר את מצב ההפעלה Z-modulation ונווט אל תבנית הליתוגרפיה שיש לייבא.מלאו את גודל דוגמת המילוי שתיווצר. הגדר את היסט המקור ל-25 מיקרומטר הן בציר X והן בציר Y, ולאחר מכן בחר מיקום Modulation Absolute Z, הגדר את המכשיר לפשט לשתי שכבות, והגדר את ערכי השחור והלבן לחמישה ושליליים חמישה מיקרומטרים, בהתאמה. לחץ על אישור כדי להחיל את ההגדרות ולסגור את החלון.פתח את עורך השכבות מחלון הליתוגרפיה והגדר את זמן ההשהיה. לאחר מכן, הורד את תא הבידוד האטמוספרי על ה-AFM ופתח את תוכנת הבקרה שלו. הגדר לחות יחסית של 45%a, טמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, וקצב חילופי אטמוספירה של 500 מיליליטר.יישם את ההגדרות והמתן להשגת רמת הלחות הרצויה. לאחר מכן התחל את הרצף הליתוגרפי. עם השלמת הליתוגרפיה, החזר את השלב ב-500 מיקרומטר.הסר את תא הבידוד האטמוספרי. נעל את הדגימהtagה כדי להשבית את חיישני הכוח. לבסוף, הסר את המצע מהבמה לצורך הדמיה או עיבוד נוסף.PPL שימש להפקת דפוסים הומוגניים בקנה מידה גדול של רשתות מערך עדינות או תמונות מפורטות. הדפוסים הודגמו למיקרוסקופיה אופטית על ידי חריטת הזהב שאינו מוגן על ידי התיול שהושקע. דפוס לא סדיר מעיד על בדיקות פגומות או חסרות.מערכי MHA שהודפסו על זהב עם PPL עברו תפקוד עם פיברונקטין והודגרו עם תאי גזע מזנכימליים אנושיים. תאים בודדים נצמדו למערכים המתפקדים בפיברונקטין, והתאימו את המורפולוגיה שלהם לדפוסים בעת הצורך. ניתן להשתמש בטכניקת PPL זו כדי להפקיד מגוון רחב של דפוסי חלבון לניסויים בביולוגיה של התא.משתמש מיומן יכול ליצור דפוסים כמו אלה המוצגים תוך כשלוש שעות. זכרו שהכנה קפדנית של המערך היא המפתח להצלחה. טכניקת ה-PPL היא גנרית למדי וניתן להשתמש בה להפקדת תרכובות החל ממולקולות קטנות ועד פולימרים וביו-מולקולות, מה שסולל את הדרך למגוון מחקרים בכימיה, ביולוגיה ומדעי החומרים.

large-area-scanning-probe-nanolithography-facilitated-automated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

סרטון זה מדגים הדמיית תהודה פלסמונית מקומית על פני השטח כדי לזהות הפרשות חלבונים מתא יחיד. באמצעות מערך מיקרופלואידי ושבב ננו-מבנה פלסמוני הקשור לפפטידים, שינויים בעוצמת האור המוחזר בזווית התהודה חושפים אינטראקציות עם חלבונים המופרשים מתא יחיד.

הדמיית תהודה פלסמונית מקומית על פני השטח לאיתור הפרשות חלבונים מתא בודד

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים ייצור של שכבות תרבית תאי לב ביומימטיות העשויות משני חומרים פולימריים נפרדים באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי.  השיטות המתוארות מספקות טכניקה ניתנת להרחבה וחסכונית להנדסת המבנה והתפקוד של רקמות לב מקרוסקופיות ליישומי in vitro ו-in vivo.

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

ניתן להשתמש בננוסקופיה של בדיקה קולואידית במגוון תחומים כדי לקבל תובנה לגבי היציבות הפיזית וקינטיקה של קרישה של מערכות קולואידיות ולסייע במדעי גילוי וניסוח תרופות באמצעות מערכות ביולוגיות. השיטה המתוארת בה מספקת אמצעי כמותי ואיכותי לחקר מערכות כאלה.

בחינה כמותית ואיכותי של אינטראקציות חלקיקי חלקיקים באמצעות קולואיד Probe Nanoscopy

אנו מדווחים על פרוטוקול לשילוב המטרולוגיה האטומית של מיקרוסקופ המנהור הסורק לדפוס פני השטח עם שקיעת שכבה אטומית סלקטיבית ותחריט יונים תגובתי. באמצעות תהליך חזק הכולל חשיפות אטמוספריות רבות והובלה, ננו-מבנים תלת מימדיים עם מטרולוגיה אטומית מיוצרים.

ייצור ננו-מבנה אטומי למעקב

תקשורת בין-תאית היא קריטית לשליטה בפעילות פיזיולוגית שונות בתוך ומחוץ לתא. מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידת טבע מרחב ובזמן של הפרשות תא בודדות. כדי להשיג זאת, גישה רב תחומית המשלבת משמשת nanoplasmonic ללא תווית חישה עם הדמיה תא חי.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

מוצג פרוטוקול לייצור שטח גדול של מצע ננו-דפוסי מתבניות ננו-דפוסיות קטנות לחקר אפנון ננוטופוגרפי של התנהגות התא.

הרחבת טכניקת תפר באמצעות מצעי nanopatterned עבור Nanotopographical אפנון של התנהגות תא

אנו משתמשים מתוקן-סטייה סריקה הילוכים מיקרוסקופ אלקטרוני להגדיר דפוסים חד-ספרתיות ננומטר מתנגד נפוץ קרינה שני: פולי (חומצתי) ו silsesquioxane מימן. להתנגד דפוסי ניתן לשכפל אותו בחומרים היעד של בחירה עם נאמנות ננומטר בעלי ספרה אחת באמצעות השיגור, פלזמה תצריב קו, ומתנגדים חדירה על-ידי organometallics.

חד-ספרתיות ננומטר ליתוגרפיה קרינה עם תיקון סטייה סריקה הילוכים מיקרוסקופ אלקטרוני

הצגנו כי תחריט של הננו-ארכיטקטורה לתוך התקנים מיקרו-אלקטרודה תאיים עשוי להפחית את התגובה הדלקתית ויש לו את הפוטנציאל לשפר הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. השיטות המתוארות כאן מתווה גישה לחרוט ננו-ארכיטקטורות לפני השטח של מיקרואלקטרודות שאינן תפקודי ופונקציונלי בודד.

ליתוגרפיה של קרן יון ממוקדת לחרוט ננו-ארכיטקטורות למיקרואלקטרודות

אנו מציגים שיטה לרכישת קורסי זמן לכתב פלואורסצנטי מתאים בודדים באמצעות מערכים micropatterned. הפרוטוקול מתאר הכנת מערכים חד-תאיים, התקנה ותפעול של מיקרוסקופיית זמן-לשגות של סריקת תאים חיים וכלי לניתוח תמונות בקוד פתוח לצורך בחירה מראש אוטומטית, בקרה חזותית ומעקב אחר קורסי זמן פלואורסצנטיים משולבים בתאים לכל אתר הידבקות.

הדמיית תא חי של מערכים חד-תאיים (LISCA) - טכניקה רב-תכליתית לכימות קינטיקה תאית

לבדיקת דגימה בקנה מידה גדול עם רזולוציה ננומטרית יש מגוון רחב של יישומים, במיוחד עבור פרוסות מוליכים למחצה ננו-מפורקות. מיקרוסקופ כוח אטומי יכול להיות כלי נהדר למטרה זו, אך מוגבל על ידי מהירות ההדמיה שלהם. עבודה זו משתמשת במערכי קנטיליבר פעילים מקבילים ב- AFM כדי לאפשר בדיקות בתפוקה גבוהה ובקנה מידה גדול.

מיקרוסקופ כוח אטומי פעיל של בדיקה עם מערכי קנטיליבר קוואטרו-מקביליים לבדיקת דגימות בקנה מידה גדול בתפוקה גבוהה

למד ננוליתוגרפיה סריקת שטח גדולה להכנת משטחים ננו-מובנים לחקר אינטראקציות תאים. השיטה משתמשת במערכי חיישני PDMS וביישור אוטומטי לחקירת תאי גזע מזנכימליים ופיתוח ביומטריאלים מתקדמים.

ננוליתוגרפיה בדיקה סריקת שטח גדול בהנחייתם של יישור אוטומטי ויישומו המצע פבריקציה נוספת ללימודי תרבות תא

גלה סרטונים נוספים