ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio
August 28th, 2018
הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע עריכת גנום ממוקדת באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9 בדגי זברה כדי להנדס נוקאאוטים גנטיים בצורה חזקה וזולה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי התפקיד הביולוגי של גן בהקשר של מערכת מודל של בעלי חוליות, כגון כיצד גן תורם לתהליכי התפתחות באיקריוטים מסדר גבוה יותר. בעזרת הליכים חזקים ופשוטים אלה, אנשי מעבדה בכל רמות הניסיון כולל סטודנטים לתואר ראשון יכולים לבצע שינויים גנומיים ממוקדים בדגי הזברה.
אנשים חדשים בשיטה זו צריכים להיות מסוגלים לעקוב אחר ההוראות שלב אחר שלב כדי לזהות מטרות גנומיות אופטימליות למוטגנזה של CRISPR, לבצע מיקרו-הזרקה של עוברי דג זברה ולזהות אללים ששונו. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששיטה זו מיועדת לסטודנטים לתואר ראשון שאולי אינם מכירים אחת או יותר מהטכניקות הדרושות. הנחיות לעיצוב אוליגואים ספציפיים לתבנית לייצור RNA מנחה מסופקות בפרוטוקול הטקסט.
כדי להתחיל, השעו את חלבון Cas9 במאגר כדי ליצור תמיסה של מיליגרם אחד למיליליטר. אחסן תמיסה זו בכמויות מוכנות להזרקה במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן סנתז את ה-sgRNA עם ערכת שעתוק במבחנה כמו זו המוצעת בחומרים של מאמר זה לפי הוראות היצרן.
טהר את ה-sgRNA המסונתז באמצעות משקעי אמוניום אצטט ללא RNAse. הוסף 25 מיקרוליטר של חמישה אמוניום אצטט מולארי ל-RNA המסונתז וערבב את התמיסה על ידי מערבולת. לאחר מכן, הוסף לדגימה 150 מיקרוליטר של 200 אתנול נטול נוקלאז הוכחה.
ומניחים את התגובה במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות במהירות מרבית. השתמש בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט תוך הקפדה לא להפריע לכדור ה-RNA.
לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של אתנול 70% והפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף שאריות מלח מהצינור. שוב צנטריפוגה במהירות מקסימלית בארבע מעלות צלזיוס למשך שבע דקות. השתמש בפיפטה P1000 כדי להסיר את רוב התמיסה.
לאחר מכן השתמש בפיפטה P200 כדי להסיר כמה שיותר מהתמיסה שנותרה מבלי להפריע לגלולה. הקפידו להימנע מזיהום RNAse, יבשו את הגלולה בחלל נקי עד שלא נראו טיפות נוזלים בצינור. השעו מחדש את הגלולה ב-30 מיקרוליטר מים נטולי RNAse והשתמשו בספקטרופוטומטר כדי לכמת את המוצר.
Aliquot הפתרון לאחסון לטווח ארוך במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מערבבים 300 עד 500 ננוגרם של sgRNA עם נפח שווה של צבע טעינת ג'ל RNA פי 2. לאחר מכן, בעזרת פיפטה P1000, נקה כל אחת מבארות ג'ל האגרוז מפסולת עם חיץ פועל מספר פעמים.
טען את התמיסות לבארות הג'ל של אגרוז והפעל את הג'ל ב-10 וולט לסנטימטר למשך זמן מספיק כדי להפריד את רצועות ה-RNA על הג'ל. הזמן עשוי להשתנות בהתאם למכשיר האלקטרופורזה. באופן כללי, יש להפעיל את חזית הצבע עד 2/3 שניות מאורך הג'ל.
לאחר מכן השתמש בכתם חומצת גרעין כדי לדמיין את הרצועות. RNA שלם מופיע כרצועה אחת כמו בנתיב הראשון והשני המוצגים כאן. RNA מושפל פועל כמריחה כמו בנתיב שלוש.
ראשית, הכינו את נבדקי דג הזברה לרבייה בלילה שלפני ביצוע הזריקות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן שלב חלבון Cas9 ו-sgRNA ביחס של שניים לאחד. דגרו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בזמן שה-Cas9 וה-sgRNA יוצרים קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין.
לאחר מכן הוסף 0.5 מיקרוליטר של תמיסות אדומות פנול 2.5% במים נטולי RNAse בכמות מספקת כדי להשיג נפח סופי של חמישה מיקרוליטר. כדי להכין את מחט ההזרקה, השתמש במושך מיקרופיפטה כדי למשוך נימי זכוכית של מילימטר אחד. לאחר מכן חותכים את קצה מחט הזכוכית המתקבלת בעזרת סכין גילוח כדי לקבל פתח זוויתי.
הנח את המחט במיקרומניפולטור המחובר למיקרו-מזרק. בעזרת מיקרוסקופ אור, כוונן את לחץ ההזרקה עד שהמחט תזריק באופן עקבי ננומטר אחד של תמיסה בצלחת הפטרי. לפני ביצוע הזרקת מיקרו לעוברים, תרגלו הכנת מחטים והזרקת עוברי ביקורת באמצעות תמיסת צבע בלבד ורשמו את ההישרדות לאחר 24 שעות של התפתחות.
אתה אמור להיות מסוגל להשיג הישרדות גדולה מ-90% בהשוואה לביקורת ללא הזרקה. לאחר מכן, בחרו 10 עד 15 עוברים כאוכלוסיית ביקורת והניחו אותם בצלחת פטרי נפרדת. בעזרת פיפטת העברה, מסדרים בזהירות את העוברים הנותרים על צלחת הזרקה בטמפרטורת החדר.
תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הזרקו ננו-ליטר אחד מהתמיסה לשק החלמון של כל עובר. לאחר מכן החזירו את העוברים שהוזרקו לצלחת פטרי מסומנת וכסו אותם במדיה 1X E3 עם מתילן כחול. מניחים את העוברים המוזרקים באינקובטור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
לאחר מכן בדוק את העוברים המוזרקים כדי להסיר פרטים מתים או מתפתחים בצורה חריגה. ראשית, אספו שתי קבוצות של חמישה עוברים בני 72 שעות מהצלחות המכילות עוברים שהוזרקו וקבוצה אחת של חמישה עוברים בני 72 שעות מקבוצת הביקורת שלא הוזרקה לתוך צינורות המיקרו-צנטריפוגה. יש להוציא בעדינות את המדיה מכל סט עוברים ולהרדים אותם.
הסר את חומר ההרדמה לאחר שתי דקות והוסף 45 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי נתרן הידרוקסיד. לאחר מכן דגרו את הדגימות ב-95 מעלות למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוציאו את הדגימות מהחממה והניחו להן להתקרר לטמפרטורת החדר.
הוסף חמישה מיקרוליטרים של pH מולארי אחד טריס הידרוכלוריד ומערבל את הדגימות במרץ. ואז צנטריפוגה את התמיסה במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. העבירו את הסופרנטנט המכיל את ה-DNA הגנומי לצינור חדש עם תווית ואחסנו את ה-gDNA במינוס 20 מעלות צלזיוס.
השתמש בפריימרים שנועדו להגביר סביב אזור היעד sgRNA כמתואר בטקסט כדי להגביר שבר PCR לניתוח הטרודופלקס. השתמש בערכת ניקוי PCR כדי לטהר את תוצרי תגובת ה-PCR. יש לדלל את הדגימות ב-30 מיקרוליטר מים ולהשתמש בספקטרופוטומטר כדי לכמת את ה-DNA.
הנח את הצינורות המכילים את מגפי ה-PCR במתלה צף באמבט מים רותחים. לאחר מכן הכינו ג'ל TBE 15% פוליאקרילאמיד באמצעות 30% פוליאקרילאמיד. לאחר שהג'ל מתייצב, הנח אותו במנגנון אלקטרופורזה עם מאגר פועל TBE.
לאחר מכן טען 500 ננוגרם של מוצרי ה-PCR המחושלים וטען בקרה ליד כל קבוצה של דגימות sgRNA. הפעל את הג'ל על 150 וולט למשך שעתיים וחצי או עד שחזית הצבע נמצאת בתחתית הג'ל. גדל עוברי דג זברה מוזרקים לבגרות המראים רצועות הטרודופלקס ב- HMA.
כדי לפרש את ה-HMA, השווה את עוצמת רצועת ההומודופלקס מה-PCR של הבקרה הלא מוזרקת מסוג הבר לדגימות המוזרקות המתאימות. אם התרחש חיתוך מספיק, עוצמת הרצועה מהדג המוזרק צריכה להיות נמוכה בכ-50% מבקרת סוג הבר. כדי לאשר את נוכחותם של אינדליים בדגי אב מייסדים פוטנציאליים, הרדימו את הדג ב-0.004% טריקאין והשתמשו בסכין גילוח נקי כדי להסיר 1/2 עד 3/4 מסנפיר הזנב.
לאחר מכן, הניחו את הזנב ב-45 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד 50 מילי-מולרי. החזר את הדג למיכל התאוששות ובצע את מיצוי ה-gDNA כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, בצע HMA על קליפ הזנב gDNA כדי לקבוע אם האדם שונה בהצלחה על ידי הזרקת CRISPR.
לאחר מכן לגדל את הבוגרים המציגים רצועות הטרודופלקס ב-DNA של הזנב לדגים מסוג בר. בחר דגי מייסד ליצירת דגי F1 על סמך ניתוח HMA של בריכות. לבסוף, רצף את ה-gDNA של הדג המעניין כדי לאפיין את טבעו של האינדל.
לאחר ייצור מוצלח ומיקרו-הזרקה של ריאגנטים של CRISPR, עוברי דג הזברה נותחו לפנוטיפים גלויים והיווצרות אינדל באמצעות HMA. היווצרות אינדל המושרה על ידי Cas9 בטירוזינאז גורמת לאובדן פיגמנטציה והיא ניקוד בקלות עד 48 שעות לאחר ההפריה. זיהוי אללים שעברו שינוי ב-CRISPR שאינם גורמים לפנוטיפים התפתחותיים גלויים מתבצע באמצעות HMA.
מיקוד מוצלח של הגן המעניין מביא להיווצרות רצועות הטרודופלקס ולהפחתת עוצמת הפס ההומודופלקס כמו בנתיבים 3 ו-4. אל תשכח שעבודה עם אורגניזם בעל חוליות נושאת אחריות אתית. פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיות הממזערות את מספר דגי הזברה הדרושים להשגת נוקאאוט, מטרה שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע הליך זה.
לאחר השליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ליצור ולזהות במהירות דגי זברה הנושאים אללים שעברו CRISPR שיועברו בקו הנבט ביעילות גבוהה. חשוב לציין, טכניקה זו עברה אופטימיזציה כדי להיות גישה בעלות נמוכה המתאימה לסטודנטים לתואר ראשון ואחרים עם מעט ניסיון קודם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנן וליישם בקלות גישת נוקאאוט גנטית מבוססת CRISPR באמצעות דג הזברה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי לעריכת גנום ממוקדת בדג זברה באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9. הוא מדגיש את יצירת וזיהוי אללים שאינם הגיוניים שמקורם ב-CRISPR באמצעות שילוב של טכניקות הכוללות ניתוח ניידות הטרודופלקס ורצף דור הבא.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
- אורגניזמים מודליים
רקע
- דגי זברה משמשים כמודל חשוב של חולי חוליות לחקר תפקוד הגנים.
- טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מאפשרת עריכת גנום מדויקת.
- הבנת תפקידי הגנים יכולה להבהיר תהליכי התפתחות באוקריוטים גבוהים יותר.
- שיטה זו נגישה לחוקרים בכל רמות הניסיון.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול אמין ליצירת נוקאאוטים של גנים בדג זברה.
- להקל על זיהוי מוטציות הנובעות מעריכת CRISPR.
- לאפשר לחוקרים לחקור תפקודי גנים בביולוגיה התפתחותית.
שיטות ששימשו
- הכנת חלבון Cas9 ו-sgRNA למחיקה מיקרוסקופית.
- מחיקה מיקרוסקופית של עוברי דג זברה עם רכיבי CRISPR.
- שימוש ברצף דור הבא לזיהוי מוטציות.
- ניתוח ניידות הטרודופלקס לניתוח מוטציות.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של אללים שאינם הגיוניים שמקורם ב-CRISPR בדג זברה.
- שיעורי הישרדות גבוהים של עוברים לאחר מחיקה מיקרוסקופית.
- זיהוי יעיל של שינויים גנומיים באמצעות טכניקות רצף.
- הוכחת יישומיות השיטה לחוקרים עם רמות ניסיון שונות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק גישה אמינה לעריכת גנום ממוקדת בדג זברה.
- הוא משפר את היכולת לחקור תפקודי גנים במודל של חוליות.
- שיטה זו יכולה להיות מאומצת בקלות על ידי חוקרים וסטודנטים כאחד.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, cost-effective generation of gene knockouts in zebrafish, a key vertebrate model for target validation and phenotypic screening in early drug discovery. By providing a streamlined workflow for CRISPR-based genome editing accessible to researchers of all experience levels, it supports mechanistic de-risking and predictive confidence in therapeutic hypothesis testing. The method reduces resource requirements while maintaining high germline transmission efficiency, aligning with enterprise goals for scalable, reproducible discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function through protein-null allele generation in a vertebrate system.
- Operational Value: Supports rapid target validation using zebrafish embryos with high survival rates post-microinjection.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by linking genotype to phenotype in a disease-relevant model.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates modified alleles suitable for downstream phenotypic and functional screening assays.
- Operational Value: Employs heteroduplex mobility assay (HMA) and NGS for standardized, quantitative indel detection.
- Scalability: Designed to minimize fish and equipment needs, enabling high-throughput allele identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses zebrafish as a disease-relevant system to bridge discovery and preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Confirms germline transmission of CRISPR modifications, supporting F1 generation for inheritance studies.
- Predictive Confidence: Enables characterization of indels via NGS to predict functional impact of genetic perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows, supporting progression from target hypothesis to lead identification through reliable genome editing in zebrafish.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing via targeted gene knockout in a vertebrate model with high editing efficiency.
- Screening: Produces validated biological systems for assay development using HMA-confirmed founder fish.
- Analytics: Provides quantitative mutation analysis through HMA band intensity comparison and NGS-based indel sequencing.
- Translational Research: Supports continuity from gene editing to phenotypic assessment in developing zebrafish embryos.
- Enterprise Reuse: Optimized for low cost and undergraduate accessibility, enabling broad laboratory adoption and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through precise, CRISPR-generated nonsense alleles.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via streamlined sgRNA preparation and microinjection protocols.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk through early functional gene interrogation in a vertebrate system.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on germline transmission and phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, embryo handling, and nucleic acid extraction techniques.
- Dependent on access to microinjectors, thermocyclers, gel electrophoresis, and spectrophotometry for QC.
- Necessitates standardization of sgRNA design and Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complex formation across users.
- Adaptation considerations include varying sgRNA efficiency and potential mosaicism in injected embryos.
- Practical limitations include the need for phenotypic screening to distinguish functional knockouts from silent indels.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Preparation of CRISPR-reagents for Embryo Microinjection
4:03
Microinjection of CRISPR-components into Zebrafish Embryos
6:12
Analysis of Efficiency of Indel Formation Using an HMA
8:45
Identification and Propagation of Knock-out Lines
9:45
Results: Zebrafish Embryos Exhibit a Pigment Defect when Injected with an sgRNA Targeting Tyrosinase at the One Cell Stage
10:32
Conclusion
