ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע עריכת גנום ממוקדת באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9 בדגי זברה כדי להנדס נוקאאוטים גנטיים בצורה חזקה וזולה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי התפקיד הביולוגי של גן בהקשר של מערכת מודל של בעלי חוליות, כגון כיצד גן תורם לתהליכי התפתחות באיקריוטים מסדר גבוה יותר. בעזרת הליכים חזקים ופשוטים אלה, אנשי מעבדה בכל רמות הניסיון כולל סטודנטים לתואר ראשון יכולים לבצע שינויים גנומיים ממוקדים בדגי הזברה.

אנשים חדשים בשיטה זו צריכים להיות מסוגלים לעקוב אחר ההוראות שלב אחר שלב כדי לזהות מטרות גנומיות אופטימליות למוטגנזה של CRISPR, לבצע מיקרו-הזרקה של עוברי דג זברה ולזהות אללים ששונו. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששיטה זו מיועדת לסטודנטים לתואר ראשון שאולי אינם מכירים אחת או יותר מהטכניקות הדרושות. הנחיות לעיצוב אוליגואים ספציפיים לתבנית לייצור RNA מנחה מסופקות בפרוטוקול הטקסט.

כדי להתחיל, השעו את חלבון Cas9 במאגר כדי ליצור תמיסה של מיליגרם אחד למיליליטר. אחסן תמיסה זו בכמויות מוכנות להזרקה במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן סנתז את ה-sgRNA עם ערכת שעתוק במבחנה כמו זו המוצעת בחומרים של מאמר זה לפי הוראות היצרן.

טהר את ה-sgRNA המסונתז באמצעות משקעי אמוניום אצטט ללא RNAse. הוסף 25 מיקרוליטר של חמישה אמוניום אצטט מולארי ל-RNA המסונתז וערבב את התמיסה על ידי מערבולת. לאחר מכן, הוסף לדגימה 150 מיקרוליטר של 200 אתנול נטול נוקלאז הוכחה.

ומניחים את התגובה במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות במהירות מרבית. השתמש בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט תוך הקפדה לא להפריע לכדור ה-RNA.

לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של אתנול 70% והפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף שאריות מלח מהצינור. שוב צנטריפוגה במהירות מקסימלית בארבע מעלות צלזיוס למשך שבע דקות. השתמש בפיפטה P1000 כדי להסיר את רוב התמיסה.

לאחר מכן השתמש בפיפטה P200 כדי להסיר כמה שיותר מהתמיסה שנותרה מבלי להפריע לגלולה. הקפידו להימנע מזיהום RNAse, יבשו את הגלולה בחלל נקי עד שלא נראו טיפות נוזלים בצינור. השעו מחדש את הגלולה ב-30 מיקרוליטר מים נטולי RNAse והשתמשו בספקטרופוטומטר כדי לכמת את המוצר.

Aliquot הפתרון לאחסון לטווח ארוך במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מערבבים 300 עד 500 ננוגרם של sgRNA עם נפח שווה של צבע טעינת ג'ל RNA פי 2. לאחר מכן, בעזרת פיפטה P1000, נקה כל אחת מבארות ג'ל האגרוז מפסולת עם חיץ פועל מספר פעמים.

טען את התמיסות לבארות הג'ל של אגרוז והפעל את הג'ל ב-10 וולט לסנטימטר למשך זמן מספיק כדי להפריד את רצועות ה-RNA על הג'ל. הזמן עשוי להשתנות בהתאם למכשיר האלקטרופורזה. באופן כללי, יש להפעיל את חזית הצבע עד 2/3 שניות מאורך הג'ל.

לאחר מכן השתמש בכתם חומצת גרעין כדי לדמיין את הרצועות. RNA שלם מופיע כרצועה אחת כמו בנתיב הראשון והשני המוצגים כאן. RNA מושפל פועל כמריחה כמו בנתיב שלוש.

ראשית, הכינו את נבדקי דג הזברה לרבייה בלילה שלפני ביצוע הזריקות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן שלב חלבון Cas9 ו-sgRNA ביחס של שניים לאחד. דגרו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בזמן שה-Cas9 וה-sgRNA יוצרים קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין.

לאחר מכן הוסף 0.5 מיקרוליטר של תמיסות אדומות פנול 2.5% במים נטולי RNAse בכמות מספקת כדי להשיג נפח סופי של חמישה מיקרוליטר. כדי להכין את מחט ההזרקה, השתמש במושך מיקרופיפטה כדי למשוך נימי זכוכית של מילימטר אחד. לאחר מכן חותכים את קצה מחט הזכוכית המתקבלת בעזרת סכין גילוח כדי לקבל פתח זוויתי.

הנח את המחט במיקרומניפולטור המחובר למיקרו-מזרק. בעזרת מיקרוסקופ אור, כוונן את לחץ ההזרקה עד שהמחט תזריק באופן עקבי ננומטר אחד של תמיסה בצלחת הפטרי. לפני ביצוע הזרקת מיקרו לעוברים, תרגלו הכנת מחטים והזרקת עוברי ביקורת באמצעות תמיסת צבע בלבד ורשמו את ההישרדות לאחר 24 שעות של התפתחות.

אתה אמור להיות מסוגל להשיג הישרדות גדולה מ-90% בהשוואה לביקורת ללא הזרקה. לאחר מכן, בחרו 10 עד 15 עוברים כאוכלוסיית ביקורת והניחו אותם בצלחת פטרי נפרדת. בעזרת פיפטת העברה, מסדרים בזהירות את העוברים הנותרים על צלחת הזרקה בטמפרטורת החדר.

תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הזרקו ננו-ליטר אחד מהתמיסה לשק החלמון של כל עובר. לאחר מכן החזירו את העוברים שהוזרקו לצלחת פטרי מסומנת וכסו אותם במדיה 1X E3 עם מתילן כחול. מניחים את העוברים המוזרקים באינקובטור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

לאחר מכן בדוק את העוברים המוזרקים כדי להסיר פרטים מתים או מתפתחים בצורה חריגה. ראשית, אספו שתי קבוצות של חמישה עוברים בני 72 שעות מהצלחות המכילות עוברים שהוזרקו וקבוצה אחת של חמישה עוברים בני 72 שעות מקבוצת הביקורת שלא הוזרקה לתוך צינורות המיקרו-צנטריפוגה. יש להוציא בעדינות את המדיה מכל סט עוברים ולהרדים אותם.

הסר את חומר ההרדמה לאחר שתי דקות והוסף 45 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי נתרן הידרוקסיד. לאחר מכן דגרו את הדגימות ב-95 מעלות למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוציאו את הדגימות מהחממה והניחו להן להתקרר לטמפרטורת החדר.

הוסף חמישה מיקרוליטרים של pH מולארי אחד טריס הידרוכלוריד ומערבל את הדגימות במרץ. ואז צנטריפוגה את התמיסה במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. העבירו את הסופרנטנט המכיל את ה-DNA הגנומי לצינור חדש עם תווית ואחסנו את ה-gDNA במינוס 20 מעלות צלזיוס.

השתמש בפריימרים שנועדו להגביר סביב אזור היעד sgRNA כמתואר בטקסט כדי להגביר שבר PCR לניתוח הטרודופלקס. השתמש בערכת ניקוי PCR כדי לטהר את תוצרי תגובת ה-PCR. יש לדלל את הדגימות ב-30 מיקרוליטר מים ולהשתמש בספקטרופוטומטר כדי לכמת את ה-DNA.

הנח את הצינורות המכילים את מגפי ה-PCR במתלה צף באמבט מים רותחים. לאחר מכן הכינו ג'ל TBE 15% פוליאקרילאמיד באמצעות 30% פוליאקרילאמיד. לאחר שהג'ל מתייצב, הנח אותו במנגנון אלקטרופורזה עם מאגר פועל TBE.

לאחר מכן טען 500 ננוגרם של מוצרי ה-PCR המחושלים וטען בקרה ליד כל קבוצה של דגימות sgRNA. הפעל את הג'ל על 150 וולט למשך שעתיים וחצי או עד שחזית הצבע נמצאת בתחתית הג'ל. גדל עוברי דג זברה מוזרקים לבגרות המראים רצועות הטרודופלקס ב- HMA.

כדי לפרש את ה-HMA, השווה את עוצמת רצועת ההומודופלקס מה-PCR של הבקרה הלא מוזרקת מסוג הבר לדגימות המוזרקות המתאימות. אם התרחש חיתוך מספיק, עוצמת הרצועה מהדג המוזרק צריכה להיות נמוכה בכ-50% מבקרת סוג הבר. כדי לאשר את נוכחותם של אינדליים בדגי אב מייסדים פוטנציאליים, הרדימו את הדג ב-0.004% טריקאין והשתמשו בסכין גילוח נקי כדי להסיר 1/2 עד 3/4 מסנפיר הזנב.

לאחר מכן, הניחו את הזנב ב-45 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד 50 מילי-מולרי. החזר את הדג למיכל התאוששות ובצע את מיצוי ה-gDNA כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, בצע HMA על קליפ הזנב gDNA כדי לקבוע אם האדם שונה בהצלחה על ידי הזרקת CRISPR.

לאחר מכן לגדל את הבוגרים המציגים רצועות הטרודופלקס ב-DNA של הזנב לדגים מסוג בר. בחר דגי מייסד ליצירת דגי F1 על סמך ניתוח HMA של בריכות. לבסוף, רצף את ה-gDNA של הדג המעניין כדי לאפיין את טבעו של האינדל.

לאחר ייצור מוצלח ומיקרו-הזרקה של ריאגנטים של CRISPR, עוברי דג הזברה נותחו לפנוטיפים גלויים והיווצרות אינדל באמצעות HMA. היווצרות אינדל המושרה על ידי Cas9 בטירוזינאז גורמת לאובדן פיגמנטציה והיא ניקוד בקלות עד 48 שעות לאחר ההפריה. זיהוי אללים שעברו שינוי ב-CRISPR שאינם גורמים לפנוטיפים התפתחותיים גלויים מתבצע באמצעות HMA.

מיקוד מוצלח של הגן המעניין מביא להיווצרות רצועות הטרודופלקס ולהפחתת עוצמת הפס ההומודופלקס כמו בנתיבים 3 ו-4. אל תשכח שעבודה עם אורגניזם בעל חוליות נושאת אחריות אתית. פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיות הממזערות את מספר דגי הזברה הדרושים להשגת נוקאאוט, מטרה שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע הליך זה.

לאחר השליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ליצור ולזהות במהירות דגי זברה הנושאים אללים שעברו CRISPR שיועברו בקו הנבט ביעילות גבוהה. חשוב לציין, טכניקה זו עברה אופטימיזציה כדי להיות גישה בעלות נמוכה המתאימה לסטודנטים לתואר ראשון ואחרים עם מעט ניסיון קודם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנן וליישם בקלות גישת נוקאאוט גנטית מבוססת CRISPR באמצעות דג הזברה.