שיטה של מטוסי אף-16 יישוב רצף של דגימות חלב

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להגביר 16 SRRNA מחלב אם ודגימות אחרות של ביומסה נמוכה באמצעות פרוטוקול חצי אוטומטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהתפתחות ובהפרעות של המיקרוביום האנושי בהקשר של בריאות וחולי. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא חצי אוטומטית, קלה יחסית לביצוע וניתנת להתאמה לסוגי דגימות מרובים כולל הפרשה, ספוגיות וצואה.

לאחר הפשרה והקצאת חלב מלא על פי פרוטוקול הטקסט, סובב את הדגימות ב-5000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לגלול את התאים. השתמש במרית פלסטיק או בקצה פיפטה גדול כדי להסיר את שכבת השומן העליונה. ואז מבלי להפריע לגלולה, הסר את כל הסופרנטנט, למעט 100 מיקרוליטר.

עם מיליליטר אחד של PBS, השעו מחדש ושטפו את הגלולה. לאחר מכן הכינו בקרה שלילית על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS סטרילי לצינור של חמישה מיליליטר. העבירו את המתלה לצינור צנטריפוגה נקי של נקודה אחת של חמישה מיליליטר וסובבו אותו ב-5000 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.

לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה סטרילי מסונן בנפח 1000 מיקרוליטר כדי להשליך את כל שכבת השומן העל-טבעית. כדי לשבש ולהומוגניזציה של הדגימה, הוסף לגלולה 600 מיקרוליטר של מאגר ליזה המכיל בטא מרקפטואתנול והעביר את התרחיף לצינור חרוזים. הכן בקרה חיובית אחת עם מאגר ליזה ו-20 מיקרוליטר של דגימת הדמה החיידקית.

מערבולת את כל צינורות החרוזים במרץ למשך 15 שניות. לאחר מכן מחממים את הדגימות על מערבולת מבוקרת טמפרטורה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-700 עד 800 סל"ד למשך 10 דקות. טען את הצינורות לתוך ערכת מתאם משבש הדגימה האוטומטי.

לאחר מכן חרוז היכה את הדגימות ב -30 הרץ למשך דקה אחת. פרק את ערכת המתאמים והחלף אותה ידנית עם לוחות הדגימה מהזרוע הרובוטית השמאלית לזרוע הרובוטית הימנית של המכשיר. חרוז היכה את הצינורות ב-30 הרץ למשך דקה נוספת ואז צנטריפוגה את הצינורות ב-17, 200 פעמים G ו-25 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.

בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר, הסר את כל הסופרנטנט, הקפד לא לקחת את השכבה השומנית בחלק העליון או את שאריות החרוזים בתחתית הדגימה. מרחו את הסופרנטנט על עמודי הומוגנייזר. לאחר מכן צנטריפוגה את העמודים במהירות מקסימלית ו -25 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.

העבר 350 מיקרוליטר של eluid לצינור מיקרוצנטריפוגה של יצרני שני מיליליטר. לבידוד DNA על פי פרוטוקול הטקסט, חתכו את המכסים והחליקו את הקצוות של עמודות הספין הבודדות עבור DNA ו-RNA. הכנס את עמודת הספין של ה-DNA ללא צינור האיסוף לתוך מתאם הרוטור.

ואז השליכו את צינור האיסוף. לאחר מכן, הכנס את שני צינורות המיליליטר המערבולת לשייקר, בהתאם לטבלת הטעינה של מכשיר טיהור ה-DNA/RNA האוטומטי לפי הוראות היצרן. סמן נקודה אחת של צינורות איסוף של חמישה מיליליטר והכנס אותם למתאמי הרוטור.

לאחר מכן הגדר את מתאמי הרוטור לצנטריפוגה בעקבות תרשים הטעינה של מכשיר טיהור ה-DNA/RNA האוטומטי. לאחר הכנסת קצות המסנן, מים ללא RNase והריאגנטים לתוך בלוק הריאגנטים של המכשיר, סגור את מכסה המכשיר והפעל את תוכנית טיהור ה-DNA המותאמת אישית על המכשיר. בסיום התגובה, אסוף את הדגימה המכילה צינורות מהשייקר, ואם נותרה דגימה כלשהי, אחסן אותה במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר או מינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.

לאחר הכנת אזור העבודה, ותערובת המאסטר של PCR, על פי פרוטוקול הטקסט, טען 50 עד 100 מיקרוליטר של דגימות DNA למתאם דגימת מכשיר של 32 בארות, בהתאם למפת הלוחות של 96 בארות. עבור כל לוחית PCR, הגדר שני בקרות שליליות על ידי פיפטינג של 30 מיקרוליטר של מי PCR בצינור איסוף נקי של נקודה וחמישה מיליליטר. לאחר מכן הנח את כל הדגימות על מתאם הדגימה של המכשיר בעל 32 הבארות עם מכסים נעולים במצב פתוח.

במתאם המגיב של המכשיר, הסר את המכסה של כל פריימר הפוך עם מספרי ברקוד ספציפיים אחד בכל פעם. כדי לטעון את המטפל בנוזלים הרובוטיים, הנח את מתאם המגיב במקומו B1.In מנת למנוע אפקט קצה, הנח בזהירות קצה אחד של המתאם כנגד צד האחיזה והוריד לאט את הקצה השני כלפי מטה. הקפד לדחוף את כל פינות המתאמים.

הנח את מתאם הדגימה במצב C1, הקפד לדחוף את כל פינות המתאמים. ואז מערבל את תערובת המאסטר של חמישה מיליליטר. פתח את המכסה והנח אותו במצב A על המיקס הראשי ובלוק הריאגנטים של הכלי.

הנח את לוחית ה-PCR על מתאם המכשיר בן 96 הבארות המיועד להחזיק לוחות PCR עם חצאית למחצה. לאחר מכן התחל את הריצה ושמור אותה כקובץ חדש. לאחר השלמת ההפעלה, ודא שלא היו שגיאות.

לאחר מכן השתמש ב-12 או שמונה מכסי רצועות כדי לאטום את הצלחת. מערבולת נמרצת והשתמש בספינר צלחות של 96 בארות כדי לסובב את הצלחות למשך דקה אחת. לבסוף, הנח את הצלחת על קרח עד שהיא מועברת לחדר ההגברה ונטענת על המחזור התרמי.

לאחר הגברת PCR, בצע בקרת איכות והכנת ספרייה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. שלב ה-QC הראשון של הפרוטוקול עוקב אחר הגברת PCR של אזור 16SV4. כפי שמוצג כאן, מיקרוליטר אחד של תוצר PCR מכל דגימה, נותח על ידי אלקטרופורזה כדי לאשר שהוא נמצא בטווח הגודל הצפוי של 350 עד 450 זוגות בסיסים.

חלק מדגימות חלב אם הפיקו כמויות נמוכות יותר של מוצר ספציפי, מה שמרמז על רמות נמוכות של DNA מיקרוביאלי שחולץ בדגימות אלה או העברת מעכבי PCR במהלך המיצוי. כימות התוצר הספציפי עבור כל דגימה היה חיוני לקביעת הנפח הנדרש לאיגום מולרי שווה של דגימות לריצוף. ספרייה מאוגדת לריצוף ממוקד נשלטת בדרך כלל על ידי מוצר PCR ספציפי.

אם יש כמות משמעותית של מוצר לא ספציפי בספרייה, יש להוסיף שלב טיהור ג'ל לזרימת העבודה. תוצאות הריצוף מדגימות גיוון גבוה בטקסונים הקשורים למיקרוביום של חלב אם ושונות במספר ספירת קני הריצוף עבור כל דגימה. לעומת זאת, הרכב הטקסונים וספירת הקנים עבור המוק החיידקי, היו דומים לתוצאות שהתקבלו עבור המוק בריצות זרימת עבודה קודמות, מה שמרמז על כך שהשונות שנצפתה עבור דגימות החלב האנושי היא תוצאה ניסויית אותנטית ולא פונקציה של שונות מהותית בזרימת העבודה.

אם משאירים רצף פועל למשך הלילה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים, עבור 12 עד 24 דגימות, אם כל הדגימות מתגברות לריצת ה-PCR הראשונית. אם לא, יש צורך ביום פגז נוסף. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לנסוע רק מהאזור שלפני ה-PCR לאזור שלאחר ה-PCR כדי למנוע זיהום.

כמו כן, חשוב להחליף כפפות לעתים קרובות כדי למנוע זיהום צולב. אל תשכח שעבודה עם דגימות אנושיות עלולה להיות מסוכנת ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות, כגון ציוד מגן מתאים וארונות בטיחות ביולוגיים.