Name: שיטה של מטוסי אף-16 יישוב רצף של דגימות חלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: למד שיטה חצי-אוטומטית לריצוף 16S rRNA מדגימות חלב אנושי בעלות ביומסה נמוכה. הפרוטוקול מייעל מחקרי מיקרוביום ומסייע בחקירת הקשר בין חיידקים לבריאות ומחלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות Helty Adisetiyo, PhD, Shangxin יאנג, PhD לפיתוח של הפרוטוקול. הכוללת תמיכה עבור הבינלאומי אימהי בילדים מתבגרים איידס קליניים ניסויים קבוצה (IMPAACT) סופק על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של במכון הלאומי של בריאות (NIH) תחת מספרי פרס UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC), UM1AI106716 (IMPAACT LC), עם השתתפות במימון המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר של ובריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD), את נבחרת המכון לבריאות הנפש (NIMH). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של NIH.

<ol><li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li>
<li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Holobiont%3A+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li>
<li>Hall, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-personal+diversity+and+temporal+dynamics+of+dental%2C+tongue%2C+and+salivary+microbiota+in+the+healthy+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2(2017).</li>
<li>Perez Perez, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+Site+Is+a+More+Determinant+Factor+than+Human+Population+Diversity+in+the+Healthy+Skin+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome.</a> PLoS One. 11 (4), e0151990(2016).</li>
<li>Hamady, M., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+profiling+for+human+microbiome+projects%3A+Tools%2C+techniques%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges.</a> Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).</li>
<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+human+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A framework for human microbiome research.</a> Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+and+dodging+pitfalls+in+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research.</a> Microbiome. 5 (1), 52(2017).</li>
<li>Hugerth, L. W., Andersson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+Microbial+Community+Composition+through+Amplicon+Sequencing%3A+From+Sampling+to+Hypothesis+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing.</a> Front Microbiol. 8, 1561(2017).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li>
<li>Pannaraj, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+Between+Breast+Milk+Bacterial+Communities+and+Establishment+and+Development+of+the+Infant+Gut+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome.</a> JAMA Pediatr. , (2017).</li>
<li>Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+and+breast+milk+cells.+A+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatr+Scand%22%5BJournal%5D)">Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study.</a> Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).</li>
<li>Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+on+the+T-lymphocyte+population+of+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk.</a> J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).</li>
<li>Sabbaj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+human+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk.</a> J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).</li>
<li>Jimenez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Milk+of+Healthy+and+Mastitis-Suffering+Women%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Lact%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women.</a> J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).</li>
<li>Ghosh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li>
<li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+DNA%2FRNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588(2016).</li>
<li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100(2016).</li>
<li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li>
<li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29(2016).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87(2014).</li>
<li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26(2015).</li>
<li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24(2016).</li>
<li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li>
<li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564(2014).</li>
<li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+of+the+human+lower+airways%3A+a+next+generation+sequencing+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22World+Allergy+Organ+J%22%5BJournal%5D)">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23(2015).</li>
<li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li>
<li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487(2014).</li>
<li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19(2015).</li>
<li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li>
<li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73(2016).</li>
<li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Genetics+and+Gut+Microbiome%3A+Challenges+and+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li>
<li>ATCC. Mock microbial communities. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

רצף יישוב הדור הבא של מטוסי אף-16 rRNA היא טכניקה בשימוש נרחב, מהיר microbiome אפיון18. עם זאת, גורמים רבים, כולל אפקטים אצווה, זיהום סביבתי, זיהום, לדוגמה, רגישות הפארמצבטית יכול להשפיע לרעה להשפיע על תוצאות הניסוי, וחיסול7,שלהם פרשנות19 , 20. להקל הכי חזקים 16 ניתוחים, זרימות עבודה microbiome עליך לשלב עיצוב ניסיוני טוב, את השימוש הפקדים המתאימים, היבדלות של שלבים בזרימת עבודה, ויישום של שיטות עבודה מומ...

הקהילות אותן מיקרוביאלי לישוב בני האדם מאמינים כי חשובה ביותר לבריאות האדם ומחלות המשפיעים על חילוף החומרים, פיתוח המערכת החיסונית, נטייה למחלות, תגובות חיסון התרופות, טיפול1, 2. מאמצים כדי להבין את השפעת microbiota על בריאות האדם כיום מדגישים את הזיהוי של מיקרובים המשויכות מוגדרים תאים אנטומיים (כלומר, עור, בטן, אוראלי, וכו '), כמו גם אתרי מקומי בתוך אלה3,תאים4. המאמצים האלה החקירות לגורם המרכזי עליו מושתתת היא התפתחותה המהירה של נגישות מוגברת של טכנולוגיות הדור הבא רצפי (הגדרות) המספקים פלטפורמה בנפט במקביל לניתוח של התוכן הגנטי מיקרוביאלית (microbiome) של מדגם. לדוגמאות פיזיולוגיים רבים, microbiome המשויך הוא מורכב וגם בשפע (קרי, צואה), אבל עבור כמה דוגמאות, microbiome מיוצג על-ידי ביומסה מיקרוביאלית נמוך (כלומר, חלב, מערכת הנשימה התחתונה) שבו רגישות, חפצי אמנות ניסויית, זיהום אפשרי להפוך את הנושאים העיקריים. האתגרים המשותפים של microbiome לימודי עיצוב ניסיוני המתאים כבר הנושא של מספר סקירת מאמרים5,6,7,8.
שהוצגו במסמך זה צינור ניסיוני חזק המיתרים מבוסס על רצף יישוב של rRNA 16 שכבת ביטול v4 של אזור9 כדי לאפיין את microbiome של חלב. ניתוח Microbiome של חלב אינו מורכב רק על ידי נמוך מטבעו ביומסה מיקרוביאלית של10, אך בנוסף על ידי גבוהה רמות של דנ א אנושי רקע11,12,13,14 ו דחויים פוטנציאלי של PCR מעכבי15,16 בחומצות שחולצו. פרוטוקול זה מסתמך על ערכות חילוץ זמינים מסחרית, פלטפורמות חצי אוטומטיים כדי לסייע במזעור השתנות לאורך אצוות הכנת המדגם. הוא כולל קהילה מדומה חיידקי מוגדרים היטב, שמעובד לצד דוגמאות כמו בקרת איכות כדי לאמת כל שלב בפרוטוקול ולספק מדד עצמאית של צינור חוסן. אמנם הפרוטוקול כפי שתואר ספיציפית דגימות חלב, ניתנת להתאמה בקלות סוגים אחרים דוגמת כולל צואה, בפי הטבעת, בנרתיק, עור, מטליות מונטגומרי, אוראלי10,17, והוא יכול לשמש נקודת מוצא חוקרים המעוניינים לבצע ניתוח microbiome.

<table><tbody><tr><td>ערכת מיני AllPrep RNA / DNA</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>ערכת מיצוי DNA / RNA</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase, DNase, DNA decontaminant</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>מבוקר טמפרטורה</td></tr><tr><td>מערבולת מאגר RLT בתוספת</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>גואנידיניום תיוציאנט מאגר ליזה / חלק מערכת</td></tr> <tr><td>Allprep&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&szlig;-ME הוא חומר מפחית שיפגע באופן בלתי הפיך ב-RNases על ידי הפחתת קשרי דיסולפיד</td></tr><tr><td>LME חרוזים</td><td>MP ביו-רפואיים</td><td>116914050</td><td>צינור חרוזים</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>סט מתאם משבש דגימה אוטומטי</td></tr><tr><td>QIAמגרסה עמודה</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td></td><td>צינור מיקרוצנטריפוגה של יצרן</td>צינור QIAgen RB <td></td><td></td> בערכה</tr><tr><td>QIAcube וכלי פלסטיק קשורים</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>מכשיר טיהור DNA</td></tr><tr><td>אוטומטי יציאת DNA בתוספת</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>פתרון טיהור לא אנזימטי</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>מאגר פליטה</td></tr><tr><td>QIAgility וכלי</td> <td>פלסטיק קשוריםQiagen</td><td>9001532</td><td>רובוטי מטפל בנוזלים</td></tr><tr><td>PCR מים</td><td>MO BIO</td><td>17000-5PRIME</td><td></td></tr> <tr><td>HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים הפוכים ברקודים</td><td>Eurofin</td><td>No Catalog #</td><td>תוכנן והוזמן</td></tr><tr><td>96 באר PCR צלחת</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 וכלי</td> <td>פלסטיק קשורים</td><td>מנתח שברי DNA/RNA אוטומטי</td>של Agilent <td>G2964AA</td></tr><tr><td>ריאגנטים D1000 עבור Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>מאגר דגימה וסולם הם חלק מערכה זו</td></tr><tr><td>ערכת הסרת מעכבי OneStep PCR Zymo</td><td>Research</td><td>50444470</td><td>הסרת מעכבי PCR נעשית לפי הוראות היצרן.</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>ערכת ניקוי DNA: טיהור מבוסס קרום סיליקה של מוצרי PCR</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>מאגר דילול וצבע מבוססי דימתיל-סולפוקסיד הם חלק מערכה זו.</td></tr><tr><td>קיוביט פלואורומטר</td><td>תרמו פישר</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>תרמו פישר</td><td></td><td>ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח</td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 ערכת</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catalog</td><td>#'s Next Generation Sequencer</td></tr></tbody></table>

שיטה של מטוסי אף-16 יישוב רצף של דגימות חלב

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

מחקרים של קהילות מיקרוביאלי הפכו נרחבת עם הפיתוח של רצפי התפוקה יחסית זול, מהיר וגבוה. עם זאת, כמו עם כל הטכנולוגיות הללו, תוצאות לשחזור תלויות שזרימת עבודה במעבדה משלבת אמצעי הזהירות המתאימים ופקדים. דבר זה חשוב במיוחד עם דגימות נמוך-ביומסה איפה לזיהום חיידקי ה-DNA ניתן להפיק תוצאות מטעות. מאמר זה מפרט זרימת עבודה אוטומטית למחצה כדי לזהות חיידקים מדגימות חלב בשד האנושי באמצעות רצף יישוב של אזור V4 ribosomal RNA (rRNA) 16 בסולם נמוך - עד אמצע - throughput. הפרוטוקול מתאר הכנת הדוגמא של חלב מלא כולל: לטעום פירוק, חילוץ חומצת גרעין, הגברה של אזור V4 של מטוסי אף-16 rRNA ג'ין, וכן ספריית הכנה עם אמצעי בקרה. חשוב, הפרוטוקול ואת הדיון לשקול סוגיות שאינן בולטות הכנה, ניתוח דוגמאות נמוך-ביומסה לרבות הפקדים המתאימים חיוביים ושליליים, הסרת המעכב PCR, דוגמת זיהום על ידי הסביבה, מגיב, או מקורות ניסיוני, ושיטות עבודה מומלצות ניסיוני, שנועדו להבטיח הפארמצבטית. בעוד הפרוטוקול כפי שמתואר ספיציפית דגימות חלב, זה יכולת הסתגלות רבים סוגי דגימה ביומסה נמוכה ולא גבוהה, כולל דוגמאות שנאספו על דגימות, קפוא מסודר, או התייצב במאגר שימור.

פרוטוקול המוצג כאן כולל שלבים חשובים בקרת איכות (QC) כדי להבטיח כי הפגישה נתונים שנוצרו ובחינות עבור פרוטוקול בקרת רגישות, ירידה לפרטים, זיהום. הצעד הראשון של הפרוטוקול QC בעקבות PCR הגברה של אזור V4 16 (איור 2). µL אחד של מוצר ה-PCR של כל מדגם נותחה על ידי אלקטרופורזה לאשר שזה היה בטווח גודל הצפוי של 315-450 bp (איור 2, חץ אדום). דגימות חלב שנוצר כמויות נמוכות של מוצר מסוים (איור 2A, מסלולים להשוות ...

זרימת עבודה אוטומטית למחצה מוצג עבור רצף יישוב של rRNA מטוסי אף-16 מ חלב וסוגים אחרים של הדגימה נמוך-ביומסה.

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להגביר 16 SRRNA מחלב אם ודגימות אחרות של ביומסה נמוכה באמצעות פרוטוקול חצי אוטומטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהתפתחות ובהפרעות של המיקרוביום האנושי בהקשר של בריאות וחולי. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא חצי אוטומטית, קלה יחסית לביצוע וניתנת להתאמה לסוגי דגימות מרובים כולל הפרשה, ספוגיות וצואה.לאחר הפשרה והקצאת חלב מלא על פי פרוטוקול הטקסט, סובב את הדגימות ב-5000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לגלול את התאים. השתמש במרית פלסטיק או בקצה פיפטה גדול כדי להסיר את שכבת השומן העליונה. ואז מבלי להפריע לגלולה, הסר את כל הסופרנטנט, למעט 100 מיקרוליטר.עם מיליליטר אחד של PBS, השעו מחדש ושטפו את הגלולה. לאחר מכן הכינו בקרה שלילית על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS סטרילי לצינור של חמישה מיליליטר. העבירו את המתלה לצינור צנטריפוגה נקי של נקודה אחת של חמישה מיליליטר וסובבו אותו ב-5000 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה סטרילי מסונן בנפח 1000 מיקרוליטר כדי להשליך את כל שכבת השומן העל-טבעית. כדי לשבש ולהומוגניזציה של הדגימה, הוסף לגלולה 600 מיקרוליטר של מאגר ליזה המכיל בטא מרקפטואתנול והעביר את התרחיף לצינור חרוזים. הכן בקרה חיובית אחת עם מאגר ליזה ו-20 מיקרוליטר של דגימת הדמה החיידקית.מערבולת את כל צינורות החרוזים במ

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אפיון הקהילה המיקרוביאלית היה מטרה ארוכת שנים במיקרוביולוגיה סביבתית. שיטות ריצוף מהדור הבא מאפשרות כעת אפיון של קהילות מיקרוביאליות בעומק חסר תקדים עם עלות ועבודה מינימליות. אנו מפרטים כאן את הגישה שלנו לרצף גנים של RNA ריבוזומלי חיידקי 16S באמצעות רצף שולחני.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

חלב הוא מקור תזונה עיקרי ליילוד. ניתוח מרכיבי החלב עשוי לספק תובנה לגבי גורמים אימהיים המשפיעים על בריאות הצאצאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה ידנית לאיסוף דגימות חלב מהחולדה המניקה, אשר לאחר מכן יכולה לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם.

אוסף חלב בעכברוש שימוש נימי צינורות והערכה של שומן חלב תוכן על ידי Creamatocrit

אנחנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מן מטליות לאפיון של קהילות חיידקי באמצעות רצף amplicon הגן 16S rRNA. השיטה מאפשרת גישה עיבוד משותף סוגי מדגם מרובים ויכול להכיל מספר תהליכים טיפוליים במורד הזרם.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מתוקננת מפורט של תפוקה גבוהה מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף. הפרוטוקול מציג פרוטוקול משולב, לובשי מדים, ריאלי וזולה החל באיסוף הנתונים ניתוחים דגימת צואה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של מספר רב של דוגמאות עם סטנדרטים קפדניים מספר פקדים.

פרוטוקול מודרך לקבלת צואה אפיון חיידקים על ידי מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף

נתאר כאן את כימות של fucosylated חלב oligosaccharides (קופות החולים) באמצעות ביוסנסור תאים שלמים וזיהוי תפוקה גבוהה. גם נדגים כאן, את העיבוד של פלטפורמה זו לקראת ניתוח זנים לייצור קופות החולים, תוך התמקדות בשיפור את האות לרעש יחס.

ניתוח של האדם Fucosylated Trisaccharides חלב בהקשר ביוטכנולוגי באמצעות גנטית מקודד ביולוגיים

מתוארים כאן הוא הליך סטנדרטי הפעלה פשוטה עבור הפרופיל microbiome באמצעות רצף מטאגנמית של 16S וניתוח באמצעות כלים זמינים בחופשיות. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים החדשים לשדה microbiome, כמו גם אלה הדורשים עדכונים על שיטות להשיג פרופיל חיידקי ברזולוציה גבוהה יותר.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

מאמר זה מתאר כיצד להרכיב מכשיר שניתן להשתמש בו לאיסוף חלב מעכברי מעבדה. מכשיר זה זול, נייד ומאפשר איסוף של 0.1-0.5 מ"ל חלב על ידי אדם מיומן אחד. פרוטוקול חליבה מפורט כלול גם כן.

טכניקה יעילה לאדם יחיד לדגימת חלב מעכברי מעבדה

המאמר מתאר פרוטוקול לבנייה מחדש של מיקרוביוטת חלב תורם מפוסטר באמצעות מיקרוביוטת חלב האם עצמה בסביבות מעשיות בעולם האמיתי. הוא מדגים גדילה יעילה של חיידקים ומודולציית מיקרוביום, ותומך ביישום אפשרי של הליך זה במסגרת הטיפול השגרתי בבית חולים ליולדות ובבנק חלב האם הקשור אליו.

בנייה מחדש אישית של מיקרוביוטה של חלב אם: גישה ישימה בסביבות בעולם האמיתי

פרוטוקול זה נועד לזרז ולאפשר בידוד יעיל של שלפוחיות חוץ-תאיות מחלב אם אנושי בטוהר גבוה.

בידוד מהיר של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בחלב אם

פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה וחסכונית של הרכב החיידקים במוצרי חלב על ידי שילוב קולטורומיקה עם MALDI-TOF MS. הוא מספק תוצאות טקסונומיה דומות לריצוף 16S rRNA עם זמן אספקה קצר יותר משיטות תרבית מסורתיות.

הערכת בטיחות מיקרוביאלית של מחלבות באמצעות פרופיל פרוטאומי חיידקי באמצעות גישת MALDI

למד שיטה חצי-אוטומטית לריצוף 16S rRNA מדגימות חלב אנושי בעלות ביומסה נמוכה. הפרוטוקול מייעל מחקרי מיקרוביום ומסייע בחקירת הקשר בין חיידקים לבריאות ומחלה.

שיטה של מטוסי אף-16 יישוב רצף של דגימות חלב

גלה סרטונים נוספים