מדידה סימולטני של סופראוקסיד/מימן על-חמצני ו- NADH הייצור על ידי המכילות פלווין Dehydrogenases מיטוכונדריאלי
24 בפברואר 2018
המיטוכונדריה מכילה מספר אנזימים תלויי-פלווין שיכול לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS). ניטור ROS שחרור שאתרים בתוך המיטוכונדריה הוא מאתגר עקב תגובות לוואי לא רצויות. אנו מציגים שיטה קלה, זולה עבור הערכה ישירה של המחירים יליד לשחרור ROS באמצעות מטוהרים flavoenzymes ו- microplate fluorometry.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את קצב הייצור של סופראוקסיד/מי חמצן ו-NADH של דהידרוגנאזות מיטוכונדריאליות מטוהרות המכילות פלבין באמצעות פלואורומטריה של מיקרו-פלטות. מיטוכונדריה יכולה להכיל עד 12 אתרים שונים ליצירת סופראוקסיד/מי חמצן שזוהו באמצעות שילובי סובסטרט ומעכבים שונים עם מיטוכונדריה מבודדת. עם זאת, עדיין נותרו כמה קשיים בכל הנוגע לכימות מדויק של יכולת השחרור של אתרי ייצור בודדים במיטוכונדריה מבודדת.
וזה קשור לתגובות לוואי לא רצויות המייצרות גם מיני חמצן תגובתיים, אך גם לנוכחות נוגדי חמצון ושימוש במעכבים חסרי ספציפיות בנוסף לשימוש בתוספים שעלולים להפריע למדידות. כאן אנו מציגים את השיטה למדידה בו-זמנית של סופראוקסיד/מי חמצן וייצור NADH על ידי דהידרוגנאזות מיטוכונדריות מטוהרות תלויות פלבין. שיטה זו היא יתרון מכיוון שהיא יכולה לאפשר כימות ישיר ומדויק של פוטנציאל ייצור ה-ROS של אתרי ייצור בודדים על ידי ביטול תגובות לוואי לא רצויות וכל מערכות מרווה של מיני חמצן תגובתיים.
המדד הסימולטני של ייצור ROS ו-NADH מאפשר גם השוואה ישירה של פוטנציאל יצירת הסופראוקסיד/מי חמצן ופעילותם של אנזימים בודדים שיכולים להיות בעלי ערך לסינון מעכבים לייצור ROS לפני ביצוע בדיקות עם מיטוכונדריה. למטרותינו כאן, נשתמש בקומפלקס פירובט דהידרוגנאז וקומפלקס אלפא-קטוגלוטראט דהידרוגנאז ממקור לב חזירי כדוגמאות. שניהם אנזימים המכילים פלבין ומקורות ידועים למיני חמצן תגובתיים.
בנוסף, ניתן לטהר את שני האנזימים הללו בקלות. המדידה בו-זמנית של סופראוקסיד/מי חמצן ו-NADH מושגת על ידי מעקב אחר שינויים בתפרחת. ל-NADH יש תכונות תפרחת מהותיות משלו המאפשרות מדידה קלה של ייצורו.
שינויים בסופראוקסיד/מי חמצן דורשים בינתיים סופראוקסיד דיסמוטטאז, חזרת פרוקסידאז ומגיב אמפלקס אולטרה-אדום. בנוכחות חזרת פרוקסידאז ומי חמצן, האמפלקס אולטרה-אדום מומר ממולקולה שאינה פלואורסצנטית לרסורופינה פלואורסצנטית. סופראוקסיד דיסמוטאז מבטיח שכל סופראוקסיד שנוצר על ידי הדהידרוגנאז הנחקר מומר למי חמצן.
לפני הקמת הבדיקה, מכינים פתרונות עבודה. כדי לייעל את הבדיקה, כל הריאגנטים מתווספים לבארות של צלחת שחורה של 96 בארות בכמות של 20 מיקרוליטר. הנפח לכל תגובה בבאר הוא 200 מיקרוליטר, ולכן פתרונות עבודה הם פי 10 מהריכוז שנמצא בבאר התגובה.
לאחר מכן, תכנת את קורא המיקרו-לוחות להריץ בדיקה קינטית למדידה כפולה של אוטופלורסנציה של NADH ופרחת רסורופין. זה נעשה על ידי בחירת נוהל תחילה והגדרתו ל-25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לחץ על התחל קינטי.
הגדר את הזמן להפעלה של כחמש דקות ואחריו בחר מרווח קריאה פלואורסצנטי של 30 שניות. לאחר מכן, לחץ על קרא והגדר את פרמטרי המדידה הפלואורסצנטיים עבור הבדיקה שלך. כאן מוזנים לתוכנה מיקום הגשושית, אורכי הגל המשמשים למעקב אחר שינויים בפריחה והבארות שייקראו.
הערוצים השונים לקריאות הפלואורסצנטיות נבחרים גם הם, כאשר אחד מהם מוקדש לאוטופלורסנציה של NADH, המוגדרת לעירור של 376 ננומטר ואורכי גל פליטה של 450 ננומטר. מעקב אחר שינויים בפלחת רסורופין הוא 565 ננומטר ו-600 ננומטר. לאחר קביעת תנאי הבדיקה, בארות בודדות נטענות במאגר וריאגנטים שונים הנדרשים למדידת ייצור NADH וסופראוקסיד/מי חמצן בו זמנית.
סדר העמסת הבארות בריאגנטים שונים הוא כדלקמן. ראשית, הכמות הנדרשת של חיץ מתווספת לבאר ואחריה תוספת של 20 מיקרוליטר של תמיסת אנזים מטוהרת. האנזים מאוזן במאגר למשך מספר דקות בתוך המכשיר.
ואז, הריאגנטים הנותרים מתווספים בסדר הבא. לאחר הוספת המצע, לחץ על התחל. מנשא הלוחית ייכנס לקורא והפרוטוקול יופעל.
במהלך הבדיקה, ניתן לעקוב אחר תפוקות בזמן אמת עבור יחידות פלואורסצנטיות יחסיות גולמיות, או RFUs, באמצעות התוכנה. המשתמש יכול לדפדף בין הקריאות הפלואורסצנטיות השונות באמצעות הכרטיסייה נתונים מעל פריסת הבאר. שים לב שניתן לבחור עקומות עבור קריאות הפלואורסצנט השונות.
בנוסף, על ידי לחיצה ממושכת על Control במקלדת ולחיצה שמאלית על הבארות, ניתן להפיק גרף מורכב המאפשר השוואות בזמן אמת של התגובות השונות. עם השלמת הניסוי, מנשא המיקרופלייט ייצא מהמכשיר. בשלב זה, התוצאות בגרף המייצג לשינויים ב- RFU מיוצאות ל- Excel.
ערכי RFU גולמיים מיוצאים על ידי לחיצה ראשונה על נתונים בגרף ה- RFU המייצג. זה יניב טבלה של ערכי RFU גולמיים עבור NADH ופריחת רסורופין. לא שלא ניתן לייצא מספרי RFU גולמיים המתאימים לשינויים ב-NADH או בפריחת רסורופין בו זמנית.
לאחר הייצוא, התוצאות מאורגנות לניתוח. באמצעות עקומות סטנדרטיות עבור NADH ופרחת רסורופין שנוצרו לפני ביצוע הבדיקה, ניתן לחשב את כמות ה-NADH במיקרומול ובסופראוקסיד/מי חמצן בפיקומול שנוצרו לאורך זמן. לאחר מכן ניתן לחשב את קצב ייצור NADH וסופראוקסיד/מי חמצן.
עבור הליך זה, חיוני לבדוק את טוהר הדהידרוגנאז המבודד המכיל פלבין לפני ביצוע בדיקות. ניתן להשיג זאת על ידי ביצוע צביעת קומאסי פשוטה לחלבונים או על ידי בדיקת פעילות האנזים בנוכחות סובסטרטים שונים. שימו לב שמומלץ להשמיט חומרי הפחתה כמו DTT מהבדיקה מכיוון שהם יכולים לשמש כמצע לייצור סופראוקסיד/מי חמצן על ידי דהידרוגנאזות המקושרות לפלבין.
בסך הכל, שיטה זו גמישה מאוד בכך שניתן להשתמש בה כדי לסנן מעכבים לייצור סופראוקסיד/מי חמצן וגם לאפשר השוואה ישירה של יכולת יצירת ה-ROS של דהידרוגנאזות מיטוכונדריאליות שונות הקשורות לפלבין. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה אינטימית כיצד למדוד ייצור ROS ו-NADH על ידי דהידרוגנאזות מטוהרות. בדיקה זו יכולה לשמש קרש קפיצה לניסויים מתוחכמים יותר עם מיטוכונדריה מבודדת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לכימות שיעורי הייצור של superoxide/hydrogen peroxide ו-NADH מדהידרוגנזות מיטוכונדריאליות מופרשות המכילות פלאבין, באמצעות פלואורומטריית מיקרו-פלטה. השיטה נותנת מענה לאתגרים במדידת שחרור רדיקלים חופשיים של חמצן (ROS) מאתרים מיטוכונדריאליים בודדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ביולוגיה של מיטוכונדריה
רקע
- מיטוכונדריה מכילות אנזימים שונים התלויים בפלבין המייצרים ROS.
- כימות מדויק של שחרור ROS מאתרים בודדים הוא קשה.
- תגובות לוואי לא רצויות ונוכחות של נוגדי חמצון מסבכות את המדידות.
- שילובי סובסטרט ומעכבים שונים שימשו לזיהוי אתרי ייצור של ROS.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה למדידה בו-זמנית של ייצור superoxide/hydrogen peroxide ו-NADH.
- סילוק תגובות לוואי לא רצויות בכימות ROS.
- מתן הערכה ישירה של הפוטנציאל לייצור ROS באתרים מיטוכונדריאליים.
שיטות שהשתמשו בהן
- נעשה שימוש בדהידרוגנזות מיטוכונדריאליות מpurified התלויות בפלאבין.
- לביצוע המדידות נעשה שימוש במיקרופלט פלואורומטריה.
- בוצע כימות סימולטני של superoxide/hydrogen peroxide ו-NADH.
- נעשה שימוש במעכבים ובסובסטראטים ספציפיים כדי להעריך אתרי ייצור בודדים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת כימות מדויק של קצבי ייצור ROS.
- תגובות לוואי לא רצויות מומעטו ביעילות.
- אתרים בודדים של ייצור ROS הוערכו בהצלחה.
- הגישה מספקת הבנה ברורה יותר של דינמיקת ROS מיטוכונדריאלית.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את היכולת לחקור ייצור ROS מיטוכונדריאלי.
- היא מציעה כלי מהימן עבור חוקרים הבודקים תפקוד מיטוכונדריאלי.
- לממצאים עשויות להיות השלכות על הבנת עקה חמצונית בתאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
כימות מדויק של ייצור מיני חמצן רעילים (ROS) מאנזימים מיטוכונדריאליים בודדים הוא קריטי לתיקוף מטרות בתהליכי גילוי תרופות הקשורות לעקה חמצונית. שיטה זו מאפשרת השוואה ישירה בין היווצרות ROS לבין פעילות אנזימטית, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים של מטרות דהידרוגנאז מקושרות לפלבין. על ידי ביטול השפעות של מערכות נוגדי חמצון ותגובות לוואי מבלבלות, היא מספקת ביטחון חיזוי לסריקת מעכבים לפני ביצוע בדיקות מיטוכונדריאליות או תאיות מורכבות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות שיעורי שחרור ROS טבעיים מדהידרוגנאזות מטוהרות התלויות בפלאבין.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה ישירה של ייצור superoxide/hydrogen peroxide ו-NADH מאתרי אנזים בודדים.
- ערך ניבוי: מסייע במיון פורטפוליו על ידי מתן אפשרות לסריקה של סלקטיביות ויעילות של מעכבים עבור ייצור ROS לפני ביצוע בדיקות מיטוכונדריאליות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור תהליכי עבודה המשכיים על ידי אספקת קריאות כמותיות וסטנדרטיות של ROS ו-NADH.
- הסבירות לשחזור: משתמשת בفلואורומטריה של פלטות מיקרו עם אורכי גל מוגדרים של עירור/פליטה (NADH: 376/450 nm; resorufin: 565/600 nm) לצורך זיהוי עקבי של האות.
- יכולת הרחבה: מאפשרת סריקה של מעכבים בתפוקה גבוהה באמצעות פורמט של פלטת 96 בארות עם נפחי תגובה של 200 µL.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: משמש כנקודת מוצא לניסויים מורכבים יותר עם מיטוכונדריה מבודדת או סיב שריר חדיר (permeabilized), באמצעות ביסוס מערכות יחסים בסיסיות בין ROS לאנזימים.
- מערכת רלוונטית למחלות: משתמש בקומפלקס pyruvate dehydrogenase (PDHC) ובקומפלקס alpha-ketoglutarate dehydrogenase (KGDHC) מהלב של חזיר כמודלים למקורות ROS מיטוכונדריאליים הרלוונטיים למחלות מטבוליות ומחלות לב וכלי דם.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהיר האם שינויים נצפים ב-ROS נובעים מפעילות האנזים המטרה לעומת השפעות שאינן מטרתיות (off-target) או הפרעה של נוגדי חמצון.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מוקדם של מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת נתונים כמותיים על ROS ופעילות המנחים החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) לפני המעבר למודלים פנוטיפיים מורכבים או למודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי בידוד ייצור ROS מדהידרוגנזים ספציפיים הקשורים לפלאבין, ובכך מפחית עמימות מנגונית בניתוח מסלולים.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות זיהוי סטנדרטי וסימולטני של אוטופלורסצנציה של NADH ושל פלורסצנציה של רסורופין, המאפשרת הערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר פלטים כמותיים (NADH במיקרו-מולים, סופר-אוקסיד/מימן פרוקסיד בפיקו-מולים לאורך זמן) המאפשרים חישוב של קצבי ייצור לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הגילוי לרצף פרה-קליני על ידי הגדרת קצבי שחרור ROS טבעיים עבור אנזימים בודדים לפני בדיקה במערכות מיטוכונדריאליות שלמות.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקת מטרות של אנזימים תלוי-פלאבין בפרויקטים שונים, ובכך מפחית פיתוח כפול של בדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בשיוך מקור ה-ROS.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות סדר ריאגנטים מוגדר, הגדרות קינטיות והפרדה בין ערוצי פלואורסצנציה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור סינון מוקדם של מעכבים, ובכך מפחית כשלים בשלבים מאוחרים עקב רעילות בלתי צפויה המתווכת על ידי ROS.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים על ידי כימות הפוטנציאל לייצור ROS של אתרי אנזימים בודדים, ובכך מספק מידע לקבלת החלטות על בחירת מטרה וקידומה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיהור אנזימים והקמת בדיקה פלואורומטרית, כולל תיקוף של טוהר ה-dehydrogenase המכיל פלבין באמצעות צביעת coomassie או בדיקות פעילות.
- תלוי בקורא מיקרו-פלייטים המסוגל לבצע קריאות קינטיות באורך גל כפול (376/450 nm עבור NADH, 565/600 nm עבור resorufin) עם בקרת טמפרטורה ב-25°C.
- מחייב החראת חומרים מרדיפים כגון DTT, העלולים לשמש כסובסטראטים לייצור superoxide/hydrogen peroxide ולהטעות את התוצאות.
- נדרשת הכנה של תמיסות עבודה בריכוז 10x, בשל נפח סופי של 200 microliter המורכב מאליקוטיים של 20 microliter בלוחות 96-well.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך ב-superoxide dismutase כדי להמיר superoxide ל-hydrogen peroxide לצורך גילוי באמצעות מערכת amplex ultrared/horseradish peroxidase.
