Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך תאי גזע של לוקמיה בלוקמיה מיאלואידית חריפה ובקסנוגרפלים שמקורם בחולה על ידי זרימה ציטומטרית באבחון ובמעקב אחר הטיפול. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום ההמטולוגיה/אונקולוגיה, כגון הרלוונטיות הקלינית של הערכה כמותית של תאי גזע של לוקמיה על ידי זרימה ציטומטרית בלוקמיה מיאלואידית חריפה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ישימה לרוב המעבדות ההמטולוגיות/אונקולוגיות עם נוגדנים נפוצים.

ההליך הזה יודגם על ידי תומס, פוסט-דוקטורנט, פאני, סטודנטית לתואר שני, ואדלין, מהנדסת מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, אסוף שני מיליליטר של מח עצם מ-AML דה נובו בצינורות המכילים 1.8 מיליגרם למיליליטר של נוגד הקרישה EDTA. לבודד תאים חד-גרעיניים מתאי דם אדומים וגרנולוציטים על ידי דילול מח עצם תחילה בשלושה נפחים של PBS.

לאחר מכן, שכבו בזהירות נפח אחד של פיקול עם נפח אחד של מח עצם מדולל. סובב את שיפוע הצפיפות ב -300 גרם למשך 30 דקות ללא הפסקה. לאחר מכן, העבירו את שכבת המעיל הלבן של תאים חד-גרעיניים לצינור סטרילי חדש.

כדי להסיר את הסופרנטנטים המזהמים את רכיבי הסרום, הוסף 10 מיליליטר PBS וצנטריפוגה את התאים ב-300 גרם למשך חמש דקות לפני שתחזור על הכביסה. ליז את כדוריות הדם האדומות על ידי הוספת שני מיליליטר של מאגר ליזה לכדור התא ולמערבולת בעדינות. לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

צנטריפוגה של התאים ב-300 גרם למשך חמש דקות והוציאו את הסופרנטנט. לאחר מכן, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים. לאחר בידוד תאי בלסט ממח העצם על פי פרוטוקול הטקסט, מתחת למכסה זרימה למינרית, הכנס עכבר NSG לא מותנה למכשיר ריסון והזריק חמש פעמים 10 לתאי הבלסט השישי של AML לווריד הזנב.

החזר את העכבר לכלוב מאוורר בודד בתנאים קונבנציונליים וספציפיים ללא פתוגנים. כל שבועיים, השתמש בשיטת איסוף תת-לסתית עם נימי המטוקריט כדי לשאוב 60 מיקרוליטר דם. העבירו את הנימים לצינור של חמישה מיליליטר ואז בעזרת כרית גזה סטרילית, הפעילו לחץ עדין כדי לעצור את הדימום.

הוסף מיליליטר אחד של מאגר ליזה לצינור ומערבולת בעדינות. לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. צנטריפוגה את התאים ב -300 גרם למשך חמש דקות.

לאחר מכן, לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסיפו 100 מיקרוליטר PBS עם 10% BSA, שלושה מיקרוליטרים של CD45 FITC אנטי אנושי, ודגרו למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את כדור התא פעמיים ב-PBS, שני מיליליטר, עם 10% BSA וצנטריפוגה ב-300 גרם למשך חמש דקות. כל שבועיים, השתמש בזרימה ציטומטרית כדי לנתח את החריטה על ידי ניתוח כימריזם של ביטוי CD45 אנושי לעומת עכבר.

כאשר ספירת הפיצוצים גדולה מ-70% או כאשר נצפים סימנים קליניים חמורים של מחלה, הקריבו את החיה ואספו תאי פיצוץ חד-גרעיניים מטחול כתוש וממח עצם על ידי שימוש ב-PBS כדי לשטוף את השוקה ועצם הירך כפי שתואר קודם לכן. כדי לבצע צביעת פאנל, שלב נוגדנים מצומדים עם דגימות קסנוגרפט ראשוניות אנושיות או נגזרות מטופל, או PDX, ומערבל את הצינורות. לאחר מכן, דגרו את התאים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות.

הסר את הנוגדנים הלא קשורים על ידי שימוש בשני מיליליטר PBS כדי לשטוף את התאים. השעו מחדש את התאים ב-450 מיקרוליטר של PBS, ולאחר מכן המשיכו לניתוח ציטומטריית זרימה וניטור MRD. כדי להעריך בצורה מדויקת וניתנת לשחזור את הממברנה של סמנים ציטופלזמיים על ידי ציטומטריית זרימה, ודא יישור אופטי.

כוונון נכון של מערכת התלת מימד ורגישות אופטית וסטומטיזציה באמצעות כיול סטומזין פועם מדי יום. השתמש במח עצם רגיל כדי להגדיר את השערים עבור CD38. נדרשים מינימום של 500,000 אירועים ומאומת שכל ריצת זרימה היא סדירה והומוגנית.

בנוסף, כפילים, כמו גם תאים מתים ופסולת תאים מסולקים. תאים המטופויאטיים לא בשלים מוגדרים על ידי היותם CD45 ביניים, SSC נמוך. והבקרה החיובית CD38 או המטוגונים, הם CD19 / CD38 חיובי כפול.

לאחר מכן מוגדרים P8 או CD38 חיובי, P7 או CD38 ביניים ו-P6 או CD38 שלילי. ניתן לחלק את תאי P6 עוד יותר ל-HSC, MPP ו-LSC. מכיוון שמדובר במח עצם תקין הוא LSC שלילי.

באמצעות ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית, נמצא כי מקטע הפיצוץ החיובי CD34, CD38 שלילי היה גבוה יותר ב-PDX בהשוואה לדגימת המטופל האבחנתי. מעניין לציין כי אחוז גבוה יותר של LSC משוער נמצא ב-PDX בהשוואה לדגימת המטופל הראשונית, מה שמרמז על העשרה אפשרית של תאי אב ממאירים ברקמות ההמטולוגיות במודל עכבר זה. לאחר השוואה של אוכלוסיות אבות ה-blast בשתי דגימות חולים שונות, החלק החיובי ל-CD34 ו-CD38 השלילי עלה מ-0.06% בעת האבחנה ל-3.33% במעקב הטיפול הראשון בחולה הראשון.

לעומת זאת, החלק החיובי ל-CD34, CD38 שלילי ירד בחולה השני מ-7.8% בעת האבחנה ל-2.27% במעקב הטיפול הראשון. בהתאם לכך, מקטע ה-LSC המשוער עלה בחולה הראשון מ-0% בעת האבחנה ל-0.65% וירד בחולה השני מ-6.57% בעת האבחנה ל-1.44% במעקב הטיפול. ניטור מינימלי של מחלה שיורית או MRD, תוך שימוש כסמנים מולקולריים במוטציה NPM1 בחולה 1 ואיחוי הגן CBF-beta MYH11 בחולה 2 הראה כי MRD מולקולרי ירד פחות בחולה הראשון בהשוואה לחולה השני בנקודת המעקב הראשונה של הטיפול.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בזמן שאתה מנסה הליך זה, חשוב לוודא הגדרות זרימה ציטומטריות ומדידת CD38. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כמו מיון תאים ציטומטרי זרימה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו הערכת תאי גזע לוקמיה תפקודית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות ולכמת תאי גזע של לוקמיה בדגימות חולים בהשתלות זרות שמקורן בחולה. אל תשכח שעבודה עם דגימות מטופלים עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הנחיות GOP ונהלי בטיחות מוסדיים בזמן שאתה מבצע הליך זה.