Name: העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: למדו טכניקת מיקרו-הזרקה לעוברי Nasonia vitripennis לצורך מניפולציה גנומית. שיטה זו מאפשרת שינויים גנטיים בריי-השפעה ומקדמת מחקר בביולוגיה של צרעות, כולל ייצור ארס וקביעת מין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי נדיב, שבוצע באוניברסיטת קליפורניה, מעבדה ריברסייד (UCR) סטארט-אפ לקרן O.S.A, משרד החקלאות המכון הלאומי של המזון, החקלאות (NIFA) פתח פרוייקט (1009509) O.S.A.

1. Vitripennis (ש ע) גידול מושבת
<ol>
	<li>הגדרת מספר מושבות (~ 3-5) על-ידי הצבת 200-500 מבוגרים (ש ע) vitripennis (עם יחס של 3:1 של נקבה: זכר) בכלובים במעונות באג. הערה: חלופה לשימוש באג במעונות, צרעות יכול גם להיות מופצות במבחנות מרובים, םת מחובר עם כותנה עם 15-20 צרעות/מבחנה.<ol>
		<li>לשמור על הצרעות-25 ± 1 ° C עם 30% לחות יחסית, 12:12 אור מחזור כהה, להאכיל אותם מדי יום עם טיפות קטנות של 1:10 (v/v) פתרון סוכרוז/מים. הערה: התפשטות של צרעה מושבות ואוספים יכול להתבצע גם בטמפרטורת החדר ללא לחות מבוקרת; עם זאת, טמפרטורות נמוכים מ- 25 ° C תפחית במקצת את התזמון התפתחותית של העוברים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>לאפשר צרעות להזדווג לפחות 4 ימים לפני זריקות.<ol>
		<li>במשך היומיים הראשונים, לאפשר נקבות ובסיומה ניזונים טריים הגלמים ס bullata , כמו גם טיפות קטנות של 1:10 (v/v) פתרון סוכרוז/מים.</li>
		<li>במשך היומיים הבאים, הסר את הגלמים זבוב לשלול הצרעות הנשי של אתר ההטלה, הפיכתם gravid מאוד.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. אוסף ויישור של העוברים בשלב טרום blastoderm ש Vitripennis
<ol>
	<li>לאפשר נקבות הצרעה על הדורות (oviposit עוברי) לתוך מארחים צעיר (ס' bullata גלמי). כדי לשמור מארחים טריים, לאחסן מארחים 4 ° C מיד לאחר קבלת אותם ולהסיר רק בעת הצורך. הערה: מארחים צעיר יכול להיקבע על ידי בעל puparium בצבע אדום בעוד מארחים בוגרים יש בצבע כהה יותר puparium (איור 1 א').<ol>
		<li>מקום טריים בודדים bullata ס הגלמים לתוך פקק קצף עם חור בגודל של הגלמים לחתוך לתוך המרכז. לחשוף רק ~ 0.2 ס מ בקצה הקדמי (אתר ההטלה מועדף) של המארחת של ריכוז מרבי של parasitization ואוסף העובר קל יותר. הערה: הסוף קדמי מעוגל, ואילו הקצה האחורי סמיך ומכיל חור 'מכתש דמוי' (איור 1B).</li>
		<li>המקום מארח גלמי (בערך 5 מארח הגלמים לכל הצרעות 100) בסידור זה לתוך הכלוב ולא לחכות בערך 45 דקות כדי לאפשר צרעות הדורות אותם (איור 2- ii). הערה: חשוב מאוד כי העוברים הם צעירים ככל שניתן, באופן אידיאלי בתוך השעה הראשונה של להיות oviposited, כדי להבטיח כי הם בשלב טרום blastoderm. עוברי הישן (&#62; 1.5 h) לא צריך להיות מוזרק.</li>
		<li>להסיר מארחים parasitized על-ידי איחזורם ביד ובעדינות צחצוח/לפוצץ את כל המתגוררים צרעות. להחליף אותם עם המארחים טריים לאחר כל ~ 15 דקות כדי להמשיך באיסוף מוקדם מבוים ביצים במהלך זריקות.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הסר את המארחים טרי parasitized כלוב בעבודת יד. תחת מיקרוסקופ ויבתר, באמצעות מלקחיים, בזהירות הקילוף בקצה האחורי (0.4 ס מ) של puparium החיצוני (מעטפת הגולמי) לחשוף את הביצים (ש ע) vitripennis (איור 2- iii). הערה: יש לנקוט כדי להימנע ניקב העור הגולמי; אם זה יקרה, hemolymph ירטבו העוברים צרעה, אשר יהיה קשה מאוד להסיר על microinjection.</li>
	<li>השתמש דבק נוזלי כדי להדביק את coverslip על זכוכית נקי כדי להכין שקופיות יישור של העובר (איור 3). הערה: דבק מיידית ביצועים גבוהים משמש כדי להגדיל את בונד חוזק, ייבוש מהירות, אולם בדבק כלשהו שיכול למנוע את coverslip לנוע בשקופית מקובל.</li>
	<li>אתה מנסה לחתוך העוברים מהמחשב המארח בזהירות עם מברשת פיין-טיפ רטוב, מוודא שלא יגרמו נזק לעור רך הגולמי של המחשב המארח. הערה: "העובר לבחור," שזה בעצם חצי של זוג מלקחיים חדה במיוחד, ניתן להשתמש במקום במכחול.</li>
	<li>העברת ~ 20 עוברי אחד--אחד על גבי השקופית, ומייד בסמוך לצד של coverslip באמצעות מברשת צבע רטוב. אוריינט בקצה הקדמי של העובר כנגד הקצה של השקופית כיסוי כך באחד העוברים עליה הצבעת באותו כיוון (איור 2- iv). זה יאפשר דיוק גבוה יותר של הזרקת לאותה תנוחה בין כל העוברים. הערה: שיפור טכניקה זו אינה דורשת דו-צדדית קלטת דביק לתקן את העוברים אל השקופית כפי שתואר לעיל21,22. בנוסף, אין וכשתתחילי העוברים, או לכסות את הביצים בשמן halocarbon במהלך ההזרקה כפי שתואר לעיל vitripennis (ש ע) העובר microinjection22.</li>
</ol>
3. מחט הכנה Microinjections
<ol>
	<li>המקום זכוכית נימי aluminosilicate לתוך פולר המחט. הערה: מחט טובה הוא קריטי עבור מוצלחת vitripennis ש עוברי זריקות. המחטים הזרקת צריך יש שארפ פיין-טיפ כדי לאפשר חדירה קלה דרך chorion. קוורץ ומחטים נימי בורוסיליקט גם יכול להיות בשימוש (איור 4).</li>
	<li>להגדיר את החום 605, את מהירות 130, עיכוב ל-80, משוך 70, ואת הלחץ 500 פולר המחט. הערה: ההגדרות פולר המחט נוספים עבור משיכת קוורץ ומחטים בורוסיליקט ניתן לראות בטבלה 1; הפרמטרים עשויים להשתנות עבור אלו שלוחצים שונים של חוטים.</li>
	<li>הפעל את פולר מחט כדי ליצור את המחט הנכון. חזור על צורך ייצור מחטים מרובים. הערה: ניתן לאחסן מחטים משך על-ידי הצבתם לתוך צלחת פטרי המכילות שבמקביל מספר גלילים מחימר של התיקים מסחרי.</li>
	<li>מסגרת משופעת של מחט על-ידי נגיעה במקצת את הטיפ יהלומים מחוספסים לצלחת בסביבות 10 s ב- 25 ° C (איור 2- iii). הערה: המחטים הזרקת תועלת שיפוע באמצעות קידום כניסתו העוברים עם נזק מינימלי תוך שיפור בו זמנית את הזרימה של חברי ההנהלה דרך המחט.</li>
</ol>
4. העובר Microinjection
<ol>
	<li>להכין לתערובת הזרקת המורכב של הגנום השינוי ריאגנטים (למשל, transposon + עוזר transposase, או CRIPSR ריאגנטים, וכו '.), ולשמור אותו בקרח.</li>
	<li>לטעון את המחט הזרקה עם 2 µL של הזרקת תערובת באמצעות טיפים microloader. הערה: התערובת הזרקת הפגינו בפרוטוקול מורכב יחיד-מדריך RNA (sgRNA) (s), חלבון רקומביננטי Cas9 מעורב ב H2O.</li>
	<li>מקם את השקופית זכוכית עם העוברים שורות לבמה של מיקרוסקופ המתחם.</li>
	<li>הכנס היטב את המחט בקצה האחורי של העובר עם זווית אנכי של 25-35 מעלות.</li></ol>להזריק pL 1-5 של הזרקת תערובת (בסביבות 2-10% נפח של העובר) וודא כי העובר מופיע להתנפח מעט כמו התערובת מוזרק לתוכו (איור 2- iv). הערה: אם התערובת הזרקה מדי מוזרק העובר זה ייתכן פרץ לסילוק הציטופלסמה של העובר. בנוסף, באופן לא תקין משופע או שבור מחטים עם גדול מדי של פתיחה עלולים גם הם לגרום קרע העובר.<ol>
		<li>נסה מחדש מסגרת משופעת מחטים אם סתימת מתרחשת. הציטופלסמה של vitripennis (ש ע) העוברים הוא באופן חריג צמיגה, דביק, מה שמוביל המחט תכופים סתימת (1/25 זריקות). הערה: חשוב לשמור את העוברים לחות במהלך תקופת הזרקת בהוספת מים מיוננים שימוש במכחול באופן קבוע. כמות המים על המברשת היא המפתח כדי לנוע עוברי ליישר בקלות. מדי מים תוצאות עוברי מים צפים מעט מדי גורם להם קשה לנוע.</li>
		<li>להזריק ~ 20-40 ביצים בבת אחת (אמור לקחת בערך 10 דקות), אז תפסיק. להעביר את הביצים מוזרק באמצעות מברשת צבע רטוב על-ידי נגיעה בקלילות את הביצים מוזרק, למקם אותם לתוך מחשב מארח. ואז להמשיך להזריק שוב באמצעות טרי שזה עתה זיון אצווה של ביצים (&#62; הישן 1 h). הערה: באופן אידיאלי פרוטוקול זה הוא היעיל ביותר אם אדם אחד ללא הרף איסוף בתור ביצים, בעוד אדם אחר הוא הזרקת רכיבי השינוי של הגנום משתילים עוברי מוזרק אל המחשב המארח הגלמים.</li>
	</ol>
	

5. משתילים Injected G0 vitripennis (ש ע) העוברים על גבי Pre-stung מארח
<ol>
	<li>בזהירות המקום העוברים0 גרם מוזרק אל בעבר נעקץ ס bullata גלמי (איור 2- vi) באמצעות מברשת צבע רטוב לאחר microinjection. הערה: הגלמים מארח המשמש לאיסוף העוברים על microinjection יעבוד למטרה זו. בנוסף, למרות מאמץ משמעותי, יש כיום אין מזון מלאכותי זמין זה יכול להיות בשימוש22.<ol>
		<li>הצב עוברי עד 40 מוזרק אחת בכל פעם על גבי מארח נעקץ מראש אחד כדי למנוע תחרות, צפיפות זחל. הערה: הזרקת יגרום נזק העוברים; השתלת רשלנית של העוברים מוזרק אל הגלמים המארח יכול לסחוט את הרכיב מוזרק או החלמון, להוביל למותו של העוברים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>למקם את הגלמים מארח צלחת פטרי עם נייר סינון לח, כדורי צמר-גפן, דגירה אותם 25 ° c עם בערך 70% לחות עד עוברי מוזרק בוקעות (בערך 1-2 ימים) (איור 2- vii). הערה: חשוב, המארחים יכול להישאר עם קלופים puparium, את vitripennis (ש ע) ביצים יתפתחו בדרך כלל כל עוד הם מודגרת בתוך תא humidified (צלחת פטרי עם נייר סינון לח, כדורי צמר-גפן) כדי למנוע לייבוש. מספיקה המקננת בטמפרטורת החדר, עם לחות מן הכדורים כותנה לחה, במקרה שלא ניתן לשלוט לחות.</li>
	<li>העברת הגלמים מארח לתוך צלחת פטרי חדש ב 70% לחות ו- 25°C לאחר G0 עוברי הפתח.<ol>
		<li>לנטר את המחשב המארח הגלמים וזחלים מוזרק G0 מדי יום. אם הגלמים המארח יש ריח רע, להעביר את הזחלים מוזרק הגלמים מארח בריאה חדשה.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. הקרנת עבור שינויים הגנום
<ol>
	<li>הסר כל גלמי vitripennis ש המארח באמצעות מברשת הצבע בסדר או העובר פיק. שהוחדר G0 הזחלים צריך pupate בסביבות 8 ימים שלאחר ההזרקה.</li>
	<li>המקום כל גולם שהוסר לתוך בקבוקון זכוכית מבודדת מחובר עם כותנה ולאפשר להם לצאת כמו G0 מבוגרים, המבטיח כי הנקבות המקווקו תהיה בתולה אשר יסייע עם צלבים גנטי במורד הזרם. הערה: נקבות ניתן למיין מן הזכרים לפי אורך הזרוע: נקבות יש כנפיים יותר אשר להרחיב מעבר לפרופיל הגוף כשמלאו בצד. ניתן להציב כל הגלמים הנשי microinjected יחד לתוך בקבוקון פקוק, אותו הדבר חל על גלמי זכרים.</li>
	<li>מסך G0 יחידים, לאחר וגיחתו על-ידי ה-PCR גם או ויזואלית (אם לשבש את פעולת הגן פנוטיפי). לדוגמה, אם CRISPR משמש ליצירת מחיקות בגן נתון הגן שיבשו מקנה הפנוטיפ גלויים, ואז למיין ולשמור אנשים עם גירסת מוטציה פנוטיפ המושפע (איור 2- viii)21. אם, לעומת זאת, הגן המושפעת מקודד עבור הפנוטיפ גלויים, כגון מוטציה של ג'ין חיוני, לבצע ערכה המעבר (קרוס G0 זכר עם נקבה פראי סוג או קרוס G0 נקבה עם זכר פראי סוג) כדי לשחזר לבין מסך עבור מוטציות heritable דרך assaying קטלני או עקרות. הערה: דומה melanogaster ד, מבוגרים vitripennis ש יכול להיות מרותק למיטה על ידי חשיפה CO2 המאפשרות מניפולציה פשוטה. יתר על כן, נקבות unmated יהיה להצמיח האפרוחים זכר הפלואידי 100%, אז לכן שנקבה unmated מוטציה יכולים להצמיח מספר גדול של הזכרים מוטציה יכול לשמש לצורך ניתוח מאוחר יותר. הערה: מוטציות בגנים חיוניים יהיה צורך להיות כל הזמן על ידי הזדווגות ששרד G0 מוזרק נקבות (ככל הנראה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עבור מוטציה) זכרים פראי סוג; במקרה ספציפי זה, מחצית הוא צאצא זכר1 G צריך למות בגלל הורשת המוטציה קטלני, בעוד חצי צאצאים נקבה1 G יהיו נשאים של שוק.</li>
	<li>Outcross G0 מבוגרים על מסך G רומא1 עבור הוספות transgene באמצעות סמנים transgenesis אם המטרה היא transgenesis. כעת transgenesis נשאר להדגים ב vitripennis ש.</li>
</ol>

<ol><li>Rivers, D. B., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022191094900833">Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis.</a> J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).</li>
<li>Whiting, A. R. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2818420?seq=1#page_scan_tab_contents">The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker).</a> Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).</li>
<li>Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterium+targets+maternally+inherited+centrosomes+to+kill+males+in+Nasonia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia.</a> Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).</li>
<li>Hurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-Killing+Bacteria+in+Insects%3A+Mechanisms%2C+Incidence%2C+and+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications.</a> Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).</li>
<li>Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bselfish%26%2334%3B+B+chromosome+induces+genome+elimination+by+disrupting+the+histone+code+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A &#34;selfish&#34; B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis.</a> Sci Rep. 7, 42551(2017).</li>
<li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSR+%28paternal+sex+ratio%29+chromosomes%3A+the+ultimate+selfish+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li>
<li>Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bselfish%26%2334%3B+B+chromosome+that+enhances+its+transmission+by+eliminating+the+paternal+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A &#34;selfish&#34; B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome.</a> Science. 240 (4851), 512-514 (1988).</li>
<li>Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venom+Proteins+of+the+Parasitoid+Wasp+Nasonia+vitripennis%3A+Recent+Discovery+of+an+Untapped+Pharmacopee%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee.</a> Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).</li>
<li>de Graaf, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+venom+composition+of+the+ectoparasitoid+wasp+Nasonia+vitripennis+from+bioinformatic+and+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies.</a> Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).</li>
<li>Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+control+of+haplodiploid+sex+determination+in+the+wasp+Nasonia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia.</a> Science. 328 (5978), 620-623 (2010).</li>
<li>Grillenberger, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+structure+of+natural+Nasonia+vitripennis+populations%3A+validating+assumptions+of+sex-ratio+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory.</a> Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).</li>
<li>Pultz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+role+for+zygotic+hunchback+in+patterning+the+Nasonia+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo.</a> Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).</li>
<li>Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+maternal+orthodenticle+patterns+anterior+and+posterior+in+the+long+germ+wasp+Nasonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia.</a> Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).</li>
<li>Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+tailless+in+the+long+germ+wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis.</a> Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).</li>
<li>Werren, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+evolutionary+insights+from+the+genomes+of+three+parasitoid+Nasonia+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species.</a> Science. 327 (5963), 343-348 (2010).</li>
<li>Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genes+Uniquely+Expressed+in+the+Germ-Line+Tissues+of+the+Jewel+Wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis.</a> G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).</li>
<li>Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+Nasonia+vitripennis+testis+reveals+novel+transcripts+expressed+from+the+selfish+B+chromosome%2C+paternal+sex+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio.</a> G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).</li>
<li>Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+infection-induced+transcriptome+of+Nasonia+vitripennis+reveals+a+preponderance+of+taxonomically-restricted+immune+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes.</a> PloS one. 8 (12), e83984(2013).</li>
<li>Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Nasonia+%28parasitoid+wasp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp).</a> Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).</li>
<li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Sci Rep. 7 (1), 901(2017).</li>
<li>Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1570-7458.1999.00594.x/full">Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis.</a> Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).</li>
<li>Werren, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+evolutionary+insights+from+the+genomes+of+three+parasitoid+Nasonia+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species.</a> Science. 327 (5963), 343-348 (2010).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

רצף האחרונות של הגנום vitripennis ש יש שיחרר צורך חשוב כלים לאפיין באופן פונקציונלי הגנים לא ידוע בתוך זה מינים23. מערכת CRISPR-Cas9, וכלים רבים אחרים ג'ין העריכה, הוכיחו להיות יקר בחקירת פונקציות ג'ין עבור מספר אורגניזמים24. עם זאת, כדי ליצור מוטציות heritable, כלים אלה דורשים ביצוע העובר microinjections. לכן, הפגינו הנה טכניקה חזותית מפורטת כולל מספר חידושים המאפשרים יעיל vitripennis (ש ע) העובר microinjections.
בסך הכל, טכניקה זו מפורט מציע מספר חידושים משמעותיים, לגבי שיטות קיימות23, המאפשרות יעיל vitripennis (ש ע) העובר microinjections. לדוגמה, כדי להקל על האוסף מהירה של העוברים, כלי ההטלה (קצף פקק) הוא נוצרים ונמצאים בשימוש כדי להגביל את הנחת לחלוטין לקצה האחורי של המחשב המארח (איור 1), אשר מאוד מקל אוסף של רבים העוברים בתוך ביצה תקופה קצרה של זמן. שיטות לגידול צרעה מושבות עם מספרים גדולים כדי לאסוף מספר רב יותר של ביצים משופרת גם ומוגדר. בנוסף, כדי להאיץ עובר יישור, מפותחת התקן יישור העובר, מה שמאפשר עבור עוברי ביעילות מיושר, מוזרק מבלי להשתמש דו-צדדית קלטת דביק כדי לאבטח את העוברים במקום (איור 3).
יתר על כן, הוא נמצא כי על ידי שמירה על לחות עם מים העוברים במהלך ההזרקה ולא desiccating את העוברים או מכסה אותם עם שמן שיפרה שיעורי ההישרדות. בנוסף, נבדקים מספר סוגי זכוכית נימי, נקבעים פרמטרים כדי לבנות את המחטים מושלם עבור vitripennis (ש ע) microinjection (טבלה 1, איור 4). יתר על כן, microinjection הבאות, הישרדות העובר תעריפי אפשרות להגדיל באופן משמעותי עקב המקננת ביצים מוזרק המארחים מראש נעקץ להציב בתאי לחה (70%). חידושים אלה מאפשרים שגרה microinjection יותר יעילה ומצליחה vitripennis ש.
ניתן לבצע שינויים מזעריים במונחים של מכשיר הזרקה, והגידול הליכים פרוטוקול זה, בהתאם להעדפות משתמש. עם זאת, מספר צעדים קריטיים יהיה חיוני ליצירת מוטציות בהצלחה ב- vitripennis (ש ע). לדוגמה, עובד מהר. כך הם עוברי מוזרק &#62; העתיקה h 1, ומבטיחה כי מחטים הזרקת אינם חדים מספיק. למזער את הנזק העובר שנינו נהיה חיוני. בעוד פרוטוקול זה צריך להיות יעיל ליצירת מוטציות בגנים רבים (אם לא כולם), מגבלה אחת גדולה היא הדרישה CRIPSR/Cas9 למטרה רצף פאם (הגולה) אשר יכתיב את רצף היעד.
לסיכום, ניתן להשתמש בטכניקה זו משופרת כדי ליצור סוגים רבים של הגנום שינויים, כגון מוטציות, מחיקות, ואולי אפילו הוספות באמצעות טכנולוגיות CRIPSR/Cas921, או אפילו transgene הוספות ליצירת הטרנסגניים (ש ע) vitripennis, אשר צריך להאיץ באופן משמעותי הפונקציונלית במחקר האורגניזם הזה.

צרעה תכשיט, (ש ע) vitripennis, הוא אחד מארבעת המינים בתוך הסוג של Nasonia כי הם ectoparasitoids של בשר לאכול זבובים כגון Sarcophaga bullata1. עקב תקופות שלהם מהיר-דורי, קלות לגידול של המעבדה, ומגוון רחב של תכונות ביולוגיות חשוב וייחודי, ש vitripennis היה מוקד לפיתוח של כלי ניסיוני מרובים הנמצאים במודל המסורתי אורגניזמים . לדוגמה, תכונות מסוימות ביולוגי ייחודי כוללים מערכת רבייה האפלו-דיפלואידי2, יחסים עם טפילים חיידקים ותעשיה3,4supernumary (B) כרומוזום5,6 ,7. יחדיו, אלה גורמים vitripennis (ש ע) מערכת ניסויית חשוב עבור ניסויים שמטרתם הבהרת ההיבטים הסלולר המולקולריים של תהליכים אלה, בנוסף אחרים כולל ארס הייצור8, 9, נחישות סקס10,11, ו האבולוציה והתפתחות של ציר דפוס היווצרות12,13,14. יתר על כן, ערכת הכלים גנטי לחקר הביולוגיה של N. vitripennis גדל באופן דרמטי במהלך העשור האחרון, או אז, עם הרצף של הגנום ברזולוציה גבוהה15, ביטוי גנים מספר מחקרים16,17,18, ו היכולת לשבש באופן פונקציונלי ביטוי גנים להסתמך על התערבות RNA (RNAi)19,20, אשר ביחד יש משופרים ללקוחות שלנו, יכולות להופיע גנטיקה הפוך את האורגניזם הזה.
למרות הפיתוחים המדעיים החשובים, ומקורות המורחב של האורגניזם רבים, החל הידע הנוכחי רק קבוצה אחת ביצעה בהצלחה microinjections עובריים ליצירת שינויים הגנום heritable21. זאת בעיקר בשל הקשיים של עבודה עם עוברי של vitripennis (ש ע) כפי שהם די קטן, להיות ~2/3 בגודל של עוברי דרוזופילה melanogaster , שהופך אותם בדרך כלל קשה לתמרן ושבירה. בנוסף, vitripennis (ש ע) הנקבות להפקיד את ביציהם לגלמים זבוב מראש נעקץ, שבתוכה מתרחשת מכלול של מופרה, זחל, ופיתוח הגולמי. לכן, עבור microinjections מוצלח, שלב טרום blastoderm, העוברים חייב להיות ביעילות שנאסף מארח הגלמים, במהירות microinjected, מושתלים מיד בחזרה לתוך מארחיהם לפיתוח. הפעולות הבאות דורשות דיוק ומיומנות כדי למנוע נזק העוברים microinjected, או המארחים הגולמי, ביצוע הטכניקה מאתגר במיוחד. על אף האמור, יש פרוטוקול קצר אחד, שפורסם לפני יותר מעשור המתארת vitripennis (ש ע) העובר microinjection22. עם זאת, הליך זה דורש העוברים צבען להיות desiccated, היא משתמשת סרט דביק כדי לעגן את הביצים על microinjection, לא כולל הדגמה ויזואלית של הטכניקה. לכן, המתוארים כאן הוא פרוטוקול מעודכן, מתוקנת, לרבות הליך חזותי, המפרט את פרוטוקול צעד אחר צעד משופרת עבור העובר vitripennis ש microinjections זה יכולה להיות מלווה בכל מעבדה בסיסיות ליצירת heritable הגנום שינוי מודל חשוב החרק.

<table><tbody><tr><td>Bugdorm</td><td></td><td>Bugdorm 41515</td><td>כלוב גידול חרקים</td></tr><tr><td>מבחנות זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>982010</td><td></td></tr><tr><td>גלמי זבוב בשר, Sarcophaga bullata</td><td>Carolina חרקים</td><td>144440</td><td></td></tr><tr><td>מיקרואלקטרודה Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td></td></tr><tr><td>צלחת שוחקת יהלום (גדלי קצה 0.7u עד 2.0u)</td><td>סאטר מכשירים</td><td>104E</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>עפיפון R</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Express מיקרו-מזרק לתכנות</td><td>אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשירי סאטר</td><td>P-1000 או P-2000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>אולימפוס</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מורכב</td><td>Leica DM-750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימי זכוכית אלומינוסיליקט 1 מ"מ (קוטר חיצוני) X 0.58 מ"מ (קוטר פנימי)</td> <td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>יכול גם להשתמש בבורוסיליקט או קוורץ</td></tr><tr><td>Identi-Plugs</td><td>JAECE</td><td>L800-B</td><td>תקעי קצף</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו כיסוי זכוכית</td><td>VWR</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>דבק</td><td>Aron Alpha</td><td>AA471</td><td>להדבקת כיסויהחלקה על מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מברשת צבע עדינה</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עם קצה דק במיוחד</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>טיפים למיקרו-מעמיס Femtotips</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>E5242956003</td><td></td></tr></tbody></table>

העובר microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום nasonia vitripennis

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

הצרעה תכשיט Nasonia vitripennis התפתחה מערכת מודל יעיל לחקר תהליכים כולל קביעת מין, זוויג האפלו-דיפלואידי, ארס סינתזה של אינטראקציות מארח-ונאבו, בין היתר. מגבלה עיקרית של עבודה עם האורגניזם הוא המחסור פרוטוקולים יעיל כדי לבצע שינויים הגנום מכוונת. חלק חשוב של שינוי הגנום הוא משלוח של עריכת ריאגנטים, לרבות מולקולות CRISPR/Cas9, העוברים דרך microinjection. בעוד microinjection וותיקה אורגניזמים דגם רבים, טכניקה זו היא מאתגרת במיוחד כדי לבצע ב- vitripennis (ש ע) בעיקר בשל גודלו העובר קטן, ואת העובדה כי התפתחות מתרחשת לחלוטין בהישג זבוב parasitized גולם. ההליך הבא מתגבר על אלה אתגרים משמעותיים תוך הפגנת הליך יעיל, חזותי להסרת ביעילות צרעה העוברים מן parasitized מארח הגלמים, microinjecting אותם, בזהירות משתילים אותם חזרה אל המחשב המארח עבור המשך והשלמה של פיתוח. פרוטוקול זה יהיה בתוקף לשפר את היכולת של קבוצות מחקר כדי לבצע שינויים מתקדמים הגנום ב האורגניזם הזה.

פרוטוקול זה מספק הנחיות מפורט המושבה לגידול, אוסף blastoderm מראש העובר, יישור, microinjection של השתלת הבאים לאחר ההזרקה, יכול לשמש עבור הנדסה הגנום יעיל ב- vitripennis ש. כפי שמוצג באיור2, רצף השלבים עבור microinjection מוצלח לתוך vitripennis ש כללי כוללים: (i) המתיר מבוגרים זכרים ונקבות להזדווג (~ 4 ימים), (ii) אספקת גלמי לטוס טרייה המארח (S. bullata) ממוקם הכנס קצף ששונה נקבות ובסיומה, המאפשרות ההטלה (~ 45 min), (iii) בזהירות פילינג משם את הקוטיקולה הגלמים המארח parasitized כדי לחשוף ולאסוף שלב טרום blastoderm צרעה עוברי (~ 15 דקות), יישור (iv) שנאספו עוברי (~ 15 דקות), (v) רכיבי השינוי הגנום microinjecting לתוך עוברי (~ 15 דקות), העוברים מוזרק מהצבת בקפידה (vi) חזרה אל המארחים נעקץ מראש כדי לאפשר פיתוח תקין (~ 15 דקות), ו (vii) מניעת התייבשות של המחשב המארח/העובר מוזרק על ידי העברת אותם לתא humidified עם בערך 70% לחות יחסית (~ 15 דקות). המארחים parasitized ואז מודגרת למשך בערך 14 ימים כדי לאפשר את התפתחות מלאה של עוברי vitripennis ש . ברגע מוזרק, מבוגרים מגיחים המארח (השמיני), לבודד, חבר, לבין מסך אותם בנפרד לנוכחות של מוטציות הצפוי.
חדירה יעיל מחט, microinjection לתוך vitripennis ש עוברי, מספר סוגים של מחטים נימי זכוכית עם נימה כולל סוגי הקוורץ, aluminosilicate ובורוסיליקט נבדקים. הוא נמצא כי האיכות של המחט הוא קריטי עבור הימנעות שבירה/סתימת במהלך ההזרקה, להשגת שיעור גבוה של שני יעילות הישרדות וטרנספורמציה של העובר. עבור כל סוג הזכוכית, פרוטוקול יעיל פותחה כדי למשוך מחטים כדי יש הרצוי תת-עורית דמוי זמן טיפ יעיל עבור vitripennis ש microinjection העובר באמצעות אלו שלוחצים micropipette שונים (P-1000, ו P-2000) (טבלה 1 איור 4).
כדי למטב את ההליך, נמדדים שיעורי ההישרדות לאחר ההזרקה של כמויות משתנות של הגנום שינוי רכיבים. הגנום שינוי הרכיבים המשמשים כאן היו מעורבים RNAs הוראות Cas9 חלבון עבור גנום בתיווך CRISPR עריכה, אשר היו הפגינו בעבר לעבוד גם ב vitripennis (ש ע)21. בדומה למה שהיה קודם לכן דיווח, כאן פילוח sgRNA הגן כינאבאר ותחתית מסונתז. על ידי מיקוד ומפריעה גן זה, החלפת פנוטיפי הניתנות לזיהוי בקלות הוא לראות את צבע העיניים של19,האורגניזם21. תערובת הזרקת המשלבת בתוכה מגוון של ריכוזים של sgRNA (0, 20, 40, 80, 160, ו 320 ng/µL) עם חלבון Cas9 (0, 20, 40, 80, 160, ו 320 ng/µL) נוצר, מוזרק העוברים מסוג הפרוע vitripennis ש. שיעור ההישרדות של עוברי מוזרק הוא נמצא כדי להיות תלוי במינון (טבלה 2)21. ריכוז מוגבר של sgRNA ו- Cas9 חלבון להוביל שיעורי ההישרדות ירד (טבלה 2), אולי בגלל תופעות מוספים את המטרה. לחות גבוהה (~ 70%) נמצא גם חשוב להישרדות העובר לאחר ההשתלה למארחים, כמו לחות נמוכה (~ 10%), גרמו 100% מוות כל העוברים מוזרק.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig1.jpg"> 
איור 1 . הכנת הגלמים המארח (S. bullata) עבור vitripennis ש העובר ההטלה. (א) יאנג, גלמי bullata ס הישן. גלמים מבוגרת יש לציפורן כהה יותר ואילו הצעיר גלמי יש גוון אדמדם יותר כדי לציפורן שלהם. הגלמים הצעירים עדיפים למקסם ההטלה. ניתן גם להבחין וקצה אחורי קדמי של הגלמים על-ידי "דמוי מכתש פתיחת בקצה האחורי, ואילו בקצה הקדמי מגיע לנקודה מעוגל. (B) המארח (S. bullata) גולם לקראת ההטלה העובר ש vitripennis . הוספת הגלמים מארח לתוך פקק קצף כי יש לו את הגלמים בגודל חור בנה. יש את הצד האחורי של הפנים הגלמים מארח בתוך התקע בעוד 0.2 ס מ בקצה הקדמי חשוף כדי לאפשר ריכוז מרבי של הטלה לתוך האזור הקדמי. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig2.jpg"> 
איור 2 . ציר זמן עבור יצירת vitripennis ש מוטציות מאת microinjection. ציר הזמן של אוסף העובר (ש ע) vitripennis , microinjection CRISPR/Cas9 ושגרות שלאחר ההזרקה. (ש ע) vitripennis מבוגרים הורשו להזדווג בהעדר אתר ההטלה של ארבעה ימים (אני). טרי, זבוב הבשר מארח הגלמים, ס bullata, בתוך פקק קצף באשר רק לחשוף 0.5 ס מ של הסוף האחורי, הבאים, הוצגה בפני הנקבות gravid למשך 45 דקות כדי לאפשר parasitization (ii). במקביל הוכנו הזרקת חומרים כולל מחטים microinjection ורכיבים CRISPR/Cas9 (iii). העוברים היו הנאסף מהמחשב המארח (iv), מיושר (v), מוזרק עם רכיבים CRISPR/Cas9 (vi). העוברים מוזרק היו בקפידה להחזיר את מארח נעקץ מראש (vii), מודגרות עד מפותחת (14 ימים) (השמיני). כאשר המבוגרים הגיח, מוטציות הוקרנו על פנוטיפים של מוטציות CRISPR/Cas9 המושרה הצפוי הגן היעד (ix). ההליך כולו אורכת בדרך כלל 19 ימים כדי להשלים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig3.jpg"> 
איור 3 . שקופיות מיקרוסקופ ששונה לצורך התאמת עוברי. (א) א coverslip. (B) של שקופיות מיקרוסקופ. (C) התקן יישור של העובר.Coverslip יכול להיות דבוק לשקופית מיקרוסקופ כדי לשמש קו עוברי להזרקה. המטרה של coverslip היא לפעול כמו קצה כדי לאפשר טיפול קל, הציפוי הפנימי של העוברים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig4.jpg"> 
איור 4 . הכנה מחט ההזרקה. (א) דוגמאות aluminosilicate טוב ורע זכוכית מחטים. (B) קצות המחט משופע unbeveled כראוי משופע, גרוע. Aluminosilicate זכוכית צינורות קפילר הוסרו על-ידי שימוש של פולר micropipette. העצות המחט המיוצר היו אז פתח בעדינות ומעודן באמצעות של beveler. המחט המשופעים טוב יש קצה חד מאד, המחט המשופעים רע יש קצה קהה. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>סוג זכוכית נימי</td>
			<td>מודל פולר המחט סאטר</td>
			<td>חום</td>
			<td>פילמנט</td>
			<td>מהירות</td>
			<td>עיכוב</td>
			<td>משוך</td>
			<td>לחץ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קוורץ</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>750</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
			<td>150</td>
			<td>165</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>605</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>בורוסיליקט</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>450</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1. הגדרות עבור מחט פולר. הערה: ההגדרה פולר המחט להשתנות מכונת מכונת אז כל המעבדה יהיה עליך למטב את הגדרות פולר משלהם המחט. טבלה זו שונתה מ- Li. et al. 21
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3">sgRNA-1</td>
			<td rowspan="3">Cas9</td>
			<td rowspan="3">סה כ עוברי</td>
			<td>השתלת (10% לחות)</td>
			<td colspan="4">השתלת (70% לחות)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>הזחלים ניצולים</td>
			<td>הזחלים ניצולים</td>
			<td colspan="3">ניצולים מבוגרים</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סה כ (%)</td>
			<td>סה כ (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>סה כ (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אין הזרקה</td>
			<td>אין הזרקה</td>
			<td>100</td>
			<td>94 (94)</td>
			<td>96 (96)</td>
			<td>66</td>
			<td>26</td>
			<td>92 (92)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מים</td>
			<td>מים</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>78 (78)</td>
			<td>44</td>
			<td>32</td>
			<td>76 (76)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng/µL</td>
			<td>20 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>74 (74)</td>
			<td>34</td>
			<td>34</td>
			<td>68 (68)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ng/µL</td>
			<td>40 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>67 (67)</td>
			<td>30</td>
			<td>32</td>
			<td>62 (62)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ng/µL</td>
			<td>80 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>53 (53)</td>
			<td>24</td>
			<td>22</td>
			<td>46 (46)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160 ng/µL</td>
			<td>160 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>41 (41)</td>
			<td>16</td>
			<td>22</td>
			<td>38 (38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>320 ng/µL</td>
			<td>320 ng/µL</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>25 (25)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>20 (20)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
בטבלה 2. הזרקת והשתלות שאירים מוטגנזה מכוונת וקצבי בהתבסס על זריקות של ריכוזים שונים של sgRNA ושל Cas9. טבלה זו שונתה מ- Li. et al. 21

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע בהצלחה מיקרו-הזרקה לעוברי nasonia vitripennis על מנת להקל על מניפולציה גנומית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות לביולוגיה של nasonia vitripennis, כגון בייצור ארס וקביעת מין. היתרון העיקרי בשימוש בטכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת מניפולציה ישירה לגנום הצרעות, ומציעה מגוון רחב של שינויים גנומיים מתקדמים.מי שתדגים את ההליך תהיה מינג לי, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלנו. בתור התחלה, הקימו מספר מושבות N.vitripennis על ידי הצבת 200 עד 500 בוגרים עם יחס של 3 ל-1 של נקבות לזכרים במעונות חרקים. שמור על הצרעות בטמפרטורה של 25 פלוס מינוס מעלה אחת צלזיוס עם לחות יחסית של 30% ומחזור אור / חושך של 12 עד 12.במשך יומיים, אפשר לנקבות המזדווגות להאכיל גלמים טריים של S.bullata, כמו גם טיפות קטנות של תמיסת מי סוכרוז בנפח אחד עד עשר. במשך היומיים הבאים, הסר את גלמי הזבוב כדי למנוע מהצרעות הנקבות אתר הטלה, מה שהופך אותן לכבדות מאוד. כדי לשמור על טריות הגלמים, יש לאחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מיד לאחר השגתם, ולהסיר אותם רק בעת הצורך.הבדיל בין מארחים צעירים שיש להם בופה בצבע אדום, לבין מארחים מבוגרים שיש להם בופה בצבע כהה יותר. אפשרו לנקבות צרעות לטפיל לתוך הפונדקאי הצעיר על ידי הנחת גלמי S.bullata טריים בודדים לתוך פקק קצף עם חור בגודל גלם חתוך במרכז. לריכוז מקסימלי של טפילים, ואיסוף עוברים קל יותר, חשפו רק כ-0.2 סנטימטרים מהקצה הקדמי של הפונדקאי, שהוא מעוגל, בהשוואה לקצה האחורי, שהוא עבה יותר, ומכיל פתח דמוי מכתש.הכניסו גלמים פונדקאים בסידור זה לתוך הכלוב והמתינו כ-45 דקות כדי לאפשר לצרעות לטפיל אותם. הסר מארחים טפיליים על ידי החזרתם ביד והקשה עדינה או פיצוץ של שאריות צרעות. החליפו אותם בפונדקאים טריים בערך כל 15 דקות כדי להמשיך לאסוף ביציות בשלב מוקדם במהלך הזריקות.תחת מיקרוסקופ ניתוח, השתמש במלקחיים כדי לקלף בזהירות את הקצה האחורי של הגולם החיצוני של פונדקאי טפיל טרי כדי לחשוף את ביצי N.vitripennis. לאחר מכן, הכן שקופית יישור עובר באמצעות דבק נוזלי כדי להדביק פתק כיסוי על מגלשת זכוכית נקייה. בעזרת מברשת רטובה ועדינה, הברישו בזהירות את העוברים מהפונדקאי, והקפידו לא לפגוע בעור הרך והגולמי של הפונדקאי.לאחר מכן, בעזרת המברשת הרטובה, העבירו כ-20 עוברים בזה אחר זה אל המגלשה, מיד בסמוך לצד החלקת הכיסוי. כוון את הקצה הקדמי של העובר כנגד קצה מגלשת הכיסוי, כך שהקצוות האחוריים של העובר יופנו לאותו כיוון. זה יאפשר דיוק גבוה יותר של הזרקה לאותו מיקום בין כל העוברים.לאחר משיכת מחטי הזרקה לפי פרוטוקול הטקסט, שפוע את קצה המחט על ידי נגיעה קלה בקצה לצלחת שוחקת יהלומים ב-25 מעלות צלזיוס למשך כ-10 שניות. הכן את תערובת ההזרקה המורכבת מריאגנטים לשינוי גנום, ושמור אותה על קרח. השתמש בקצה מיקרו-מטען כדי להעמיס את מחט ההזרקה בשני מיקרוליטר של תערובת הזרקה.לאחר מכן, הנח את מגלשת הזכוכית עם העוברים המרופדים על הבמה של מיקרוסקופ מורכב. הכנס בזהירות את המחט לקצה האחורי של העובר בזווית אנכית של 25 עד 35 מעלות. לאחר מכן, הזריקו 1 עד 5 פיקוליטר של תערובת ההזרקה וודאו שהאמבירו מתנפח מעט עם ההזרקה.אם מתרחשת סתימה, נסה לשפוע מחדש את המחטים. הציטופלזמה של עוברי N.vitripennis היא צמיגה ודביקה בצורה יוצאת דופן, מה שמוביל לסתימת מחט תכופה. יש להזריק כ-20 עד 40 ביצים בכל פעם, ולאחר מכן להפסיק.מעבירים את הביצים המוזרקות בעזרת מכחול רטוב על ידי נגיעה קלה בביצים המוזרקות ומניחים אותן בפונדקאי. לאחר מכן, המשיכו להזריק באמצעות אצווה טרייה של ביצים שזה עתה הוטלו. באופן אידיאלי, שלב זה יעיל ביותר כאשר אדם אחד אוסף ומסדר ביציות, בעוד שאדם אחר מזריק רכיבי שינוי גנום ומשתיל עוברים מוזרקים לגלמים מארחים.לאחר הזרקת מיקרו, השתמש במכחול רטוב כדי להניח בזהירות עד 40 עוברי G zero שהוזרקו בזה אחר זה על גלמי S.bullata שנעקצו בעבר. מניחים את הגלמים המארחים בצלחת פטרי עם נייר סינון לח וכדורי צמר גפן ודוגרים אותם בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם לחות של כ-70% עד שהעוברים המוזרקים בוקעים תוך יום עד יומיים. חשוב לציין, ניתן להשאיר את הפונדקאים עם גולם מקולף, וביצי N.vitripennis יתפתחו כרגיל, כל עוד הן מודגרות בתא לח כדי למנוע התייבשות.לאחר בקיעת העוברים G zero, העבירו את הגלמים המארחים לצלחת פטרי חדשה ודגרו אותם בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-70% לחות. עקוב אחר הגלמים המארחים והזרקת זחלי G zero מדי יום. אם לגלמים המארחים יש ריח רע, העבירו את הזחלים שהוזרקו לגלמים מארחים בריאים חדשים.לחדירת מחט יעילה והזרקת מיקרו לעוברי N.vitripennis, נבדקו מושכי מיקרופיפטות שונים עם מספר סוגים של מחטי זכוכית נימיות עם חוטים, כולל קוורץ, אלומינוסיליקט ובורוסיליקט, כדי לקבל קצה ארוך דמוי היפודרמי רצוי, יעיל להזרקת מיקרו עובר N.vitripennis. מרכיבי שינוי הגנום ששימשו כאן היו RNA מדריך מעורב וחלבון cas9 לעריכת גנום בתיווך פריך יותר. בניסוי זה, sgRNA המכוון לגן cinnabar הוזרק בכמויות משתנות, יחד עם חלבון cas9, לתוך N.vitripennis.טבלה זו מראה כי שיעורי ההישרדות היו תלויי מינון, שכן ריכוז מוגבר של חלבון sgRNA ו-cas9 הוביל לירידה בשיעורי ההישרדות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להקפיד לא לנקב או לייבש את עוברי הצרעות במהלך מניפולציה או העברה על ידי שימוש בזהירות במברשת לחה או קיסם עוברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לאחזר, להזריק ולהשתיל עוברי צרעות ביעילות על מנת לבצע בהצלחה שינויים גנומיים מתקדמים.

embryo-microinjection-transplantation-technique-for-nasonia

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

ב אורגניזמים מודל, transgenesis יכול לתפעל פונקציות גן בעוד RNAi יכול מציאה תעתיקי mRNA ספציפי 1-2. פרוטוקול זה נועד להמחיש את טכניקות צורך להציג DNA מועבר ביציבות וחולפת RNA גדילי כפול לתוך נמטודות...

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em

nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וnucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) יכול לשמש כדי לשנות את הגנום של עוברי preimplantation עכבר על ידי מפעילה שני סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית מסלולים (HR). מקדמות אלה לאפשר את הדור המהיר של עכברים עם שינויים גנטיים מדויקים.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר loss- ולהשיג-של שיטת הפונקציה כי הוא ישים לזהות neogenin כמו קולטן בשלב ספציפי שמוביל trophectoderm ותא פנימי בידול המונים עוברי עכברים preimplantation.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

אנו מציגים transgenesis חולף מציאת גן ב intestinalis Ciona, קבוצת אחות chordate לבעלי חוליות, תוך שימוש בטכניקות microinjection ו electroporation. שיטות כאלה להקל גנומיקה תפקודית חסר חוליות הפשוטות הזה כולל מאפיינים בסיסיים של בעלי חוליות, כולל notochord ו epithelia ראש חושים ועל orthologs הרב של הגנים הקשורים למחלות אנושיות.

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

כאן, אנו מתארים שיטות להזרקות יעילות של פופלים ומבוגרים בנסוניה ויטריפניס כחלופות נגישות למיקרו-אינטרנציקציה של עוברים, המאפשרות ניתוח פונקציונלי של גנים בעלי עניין באמצעות השתקת RNA באמצעות הפרעת RNA (RNAi) או נוקאאוט גנים באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

להלן פרוטוקולים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי תירס קדם-תאיים לצורך שינוי הגנום שלהם באמצעות עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 או להוספת אלמנטים מסומנים הניתנים להעברה באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט.

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך אינטגראז phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרו-הזרקה עוברית, צעד מכריע ליצירת זבובים טרנסגניים.

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

למדו טכניקת מיקרו-הזרקה לעוברי Nasonia vitripennis לצורך מניפולציה גנומית. שיטה זו מאפשרת שינויים גנטיים בריי-השפעה ומקדמת מחקר בביולוגיה של צרעות, כולל ייצור ארס וקביעת מין.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

גלה סרטונים נוספים