העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע בהצלחה מיקרו-הזרקה לעוברי nasonia vitripennis על מנת להקל על מניפולציה גנומית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות לביולוגיה של nasonia vitripennis, כגון בייצור ארס וקביעת מין. היתרון העיקרי בשימוש בטכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת מניפולציה ישירה לגנום הצרעות, ומציעה מגוון רחב של שינויים גנומיים מתקדמים.

מי שתדגים את ההליך תהיה מינג לי, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלנו. בתור התחלה, הקימו מספר מושבות N.vitripennis על ידי הצבת 200 עד 500 בוגרים עם יחס של 3 ל-1 של נקבות לזכרים במעונות חרקים. שמור על הצרעות בטמפרטורה של 25 פלוס מינוס מעלה אחת צלזיוס עם לחות יחסית של 30% ומחזור אור / חושך של 12 עד 12

במשך יומיים, אפשר לנקבות המזדווגות להאכיל גלמים טריים של S.bullata, כמו גם טיפות קטנות של תמיסת מי סוכרוז בנפח אחד עד עשר. במשך היומיים הבאים, הסר את גלמי הזבוב כדי למנוע מהצרעות הנקבות אתר הטלה, מה שהופך אותן לכבדות מאוד. כדי לשמור על טריות הגלמים, יש לאחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מיד לאחר השגתם, ולהסיר אותם רק בעת הצורך.

הבדיל בין מארחים צעירים שיש להם בופה בצבע אדום, לבין מארחים מבוגרים שיש להם בופה בצבע כהה יותר. אפשרו לנקבות צרעות לטפיל לתוך הפונדקאי הצעיר על ידי הנחת גלמי S.bullata טריים בודדים לתוך פקק קצף עם חור בגודל גלם חתוך במרכז. לריכוז מקסימלי של טפילים, ואיסוף עוברים קל יותר, חשפו רק כ-0.2 סנטימטרים מהקצה הקדמי של הפונדקאי, שהוא מעוגל, בהשוואה לקצה האחורי, שהוא עבה יותר, ומכיל פתח דמוי מכתש.

הכניסו גלמים פונדקאים בסידור זה לתוך הכלוב והמתינו כ-45 דקות כדי לאפשר לצרעות לטפיל אותם. הסר מארחים טפיליים על ידי החזרתם ביד והקשה עדינה או פיצוץ של שאריות צרעות. החליפו אותם בפונדקאים טריים בערך כל 15 דקות כדי להמשיך לאסוף ביציות בשלב מוקדם במהלך הזריקות.

תחת מיקרוסקופ ניתוח, השתמש במלקחיים כדי לקלף בזהירות את הקצה האחורי של הגולם החיצוני של פונדקאי טפיל טרי כדי לחשוף את ביצי N.vitripennis. לאחר מכן, הכן שקופית יישור עובר באמצעות דבק נוזלי כדי להדביק פתק כיסוי על מגלשת זכוכית נקייה. בעזרת מברשת רטובה ועדינה, הברישו בזהירות את העוברים מהפונדקאי, והקפידו לא לפגוע בעור הרך והגולמי של הפונדקאי.

לאחר מכן, בעזרת המברשת הרטובה, העבירו כ-20 עוברים בזה אחר זה אל המגלשה, מיד בסמוך לצד החלקת הכיסוי. כוון את הקצה הקדמי של העובר כנגד קצה מגלשת הכיסוי, כך שהקצוות האחוריים של העובר יופנו לאותו כיוון. זה יאפשר דיוק גבוה יותר של הזרקה לאותו מיקום בין כל העוברים.

לאחר משיכת מחטי הזרקה לפי פרוטוקול הטקסט, שפוע את קצה המחט על ידי נגיעה קלה בקצה לצלחת שוחקת יהלומים ב-25 מעלות צלזיוס למשך כ-10 שניות. הכן את תערובת ההזרקה המורכבת מריאגנטים לשינוי גנום, ושמור אותה על קרח. השתמש בקצה מיקרו-מטען כדי להעמיס את מחט ההזרקה בשני מיקרוליטר של תערובת הזרקה.

לאחר מכן, הנח את מגלשת הזכוכית עם העוברים המרופדים על הבמה של מיקרוסקופ מורכב. הכנס בזהירות את המחט לקצה האחורי של העובר בזווית אנכית של 25 עד 35 מעלות. לאחר מכן, הזריקו 1 עד 5 פיקוליטר של תערובת ההזרקה וודאו שהאמבירו מתנפח מעט עם ההזרקה.

אם מתרחשת סתימה, נסה לשפוע מחדש את המחטים. הציטופלזמה של עוברי N.vitripennis היא צמיגה ודביקה בצורה יוצאת דופן, מה שמוביל לסתימת מחט תכופה. יש להזריק כ-20 עד 40 ביצים בכל פעם, ולאחר מכן להפסיק.

מעבירים את הביצים המוזרקות בעזרת מכחול רטוב על ידי נגיעה קלה בביצים המוזרקות ומניחים אותן בפונדקאי. לאחר מכן, המשיכו להזריק באמצעות אצווה טרייה של ביצים שזה עתה הוטלו. באופן אידיאלי, שלב זה יעיל ביותר כאשר אדם אחד אוסף ומסדר ביציות, בעוד שאדם אחר מזריק רכיבי שינוי גנום ומשתיל עוברים מוזרקים לגלמים מארחים.

לאחר הזרקת מיקרו, השתמש במכחול רטוב כדי להניח בזהירות עד 40 עוברי G zero שהוזרקו בזה אחר זה על גלמי S.bullata שנעקצו בעבר. מניחים את הגלמים המארחים בצלחת פטרי עם נייר סינון לח וכדורי צמר גפן ודוגרים אותם בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם לחות של כ-70% עד שהעוברים המוזרקים בוקעים תוך יום עד יומיים. חשוב לציין, ניתן להשאיר את הפונדקאים עם גולם מקולף, וביצי N.vitripennis יתפתחו כרגיל, כל עוד הן מודגרות בתא לח כדי למנוע התייבשות.

לאחר בקיעת העוברים G zero, העבירו את הגלמים המארחים לצלחת פטרי חדשה ודגרו אותם בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-70% לחות. עקוב אחר הגלמים המארחים והזרקת זחלי G zero מדי יום. אם לגלמים המארחים יש ריח רע, העבירו את הזחלים שהוזרקו לגלמים מארחים בריאים חדשים.

לחדירת מחט יעילה והזרקת מיקרו לעוברי N.vitripennis, נבדקו מושכי מיקרופיפטות שונים עם מספר סוגים של מחטי זכוכית נימיות עם חוטים, כולל קוורץ, אלומינוסיליקט ובורוסיליקט, כדי לקבל קצה ארוך דמוי היפודרמי רצוי, יעיל להזרקת מיקרו עובר N.vitripennis. מרכיבי שינוי הגנום ששימשו כאן היו RNA מדריך מעורב וחלבון cas9 לעריכת גנום בתיווך פריך יותר. בניסוי זה, sgRNA המכוון לגן cinnabar הוזרק בכמויות משתנות, יחד עם חלבון cas9, לתוך N.vitripennis.

טבלה זו מראה כי שיעורי ההישרדות היו תלויי מינון, שכן ריכוז מוגבר של חלבון sgRNA ו-cas9 הוביל לירידה בשיעורי ההישרדות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להקפיד לא לנקב או לייבש את עוברי הצרעות במהלך מניפולציה או העברה על ידי שימוש בזהירות במברשת לחה או קיסם עוברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לאחזר, להזריק ולהשתיל עוברי צרעות ביעילות על מנת לבצע בהצלחה שינויים גנומיים מתקדמים.